Оптимизированное производство и анализ рекомбинантных везикул, заполненных белком, из E. coli

Проводимая работа с бактериями проводится в соответствии с местными, национальными и международными правилами сдерживания биобезопасности, соответствующими конкретному уровню опасности биобезопасности каждого штамма. 1. Выбор различных виртуальных машин Определите последовательности виртуальных машин.ПРИМЕЧАНИЕ: Для настоящего исследования были идентифицированы три последовательностиVNp 1 , которые приводят к максимальному выходу и везикулярному экспорту белков, исследованных на сегодняшний день: VNp2, VNp6 и VNp15. В настоящее время неясно, почему некоторые варианты VNp работают более эффективно с одними белками, чем с другими; поэтому рекомендуется, чтобы слияния генерировались между новым интересующим белком с каждым вариантом VNp (т.е. VNp2, 6 или 15).VNp2: MDVFMKGLSKAKEGVVAAAEKTKQGVAEAАГКТКЕГВЛVNp6: MDVFKKGFSIADEGVVGAVEKTDQGVTEAAEKTKEGVMVNp15: MDVFKKGFSIADEGVVGAVEПлазмиды, которые позволяют экспрессировать интересующий белок с различными аминоконцевыми слияниями VNp, были коммерчески доступны (см. Таблицу материалов). Разработайте стратегию клонирования, чтобы вставить интересующий ген в 3′-конец кДНК, кодирующей VNp, в одну из этих конструкций или адаптировать существующую плазмиду путем интеграции синтезированной кДНК VNp выше по течению от первого кодона ATG гена, кодирующего интересующий белок. Используйте методы, описанные впункте 1. Для токсичных белков используйте вектор с репрессируемым промотором экспрессии или промотор с минимальным неиндуцированным шумом экспрессии. Клонируйте метку последовательности VNp на аминоконце белка слияния. Убедитесь, что аффинные метки, последовательности расщепления протеазы и т. д., а также интересующий белок расположены на карбоксильной стороне метки VNp. Рекомендуется отделять VNp от нисходящего пептида с помощью гибкой линкерной области, такой как два или три повтора полипептидной последовательности -G-G-S-G- (рис. 1).ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте плазмиды с выбором антибиотика, который не нацелен на пептидогликан, который ослабляет клеточную поверхность и снижает выход везикул. Канамицин и хлорамфеникол (см. Таблицу материалов) были предпочтительными антибиотиками, используемыми для этого исследования. 2. Культивирование бактериальных клеток и индукция белка ПРИМЕЧАНИЕ: Бактериальные штаммы, обычно используемые в этом протоколе, представляют собой Escherichia coli BL21 (DE3) или W3110. Клетки E. coli культивируют в лизогенного бульоне (LB) (10 г/л триптона; 10 г/л NaCl; 5 г/л дрожжевого экстракта) или потрясающем бульоне (TB) (12 г/л триптона; 24 г/л дрожжевого экстракта; 4 мл/л 10% глицерина; 17 мМ KH 2 PO 4; 72 мМ K2HPO4, соли автоклавируют отдельно) (см. Таблицу материалов). Примеры изображений, показывающих каждый этап индукции белка и последующий процесс выделения и очистки, показаны на рисунке 2. Культивируйте закваски 5 мл LB от свежих бактериальных превращений при 37 ° C до насыщения и используйте их для инокуляции 25 мл туберкулеза в коническую колбу объемом 500 мл, все с соответствующим подбором антибиотиков. Соотношение площади поверхности и объема является важным фактором оптимизации этой системы. Используйте колбу как можно большего объема (например, колбу объемом 5 л, содержащую 1 л культуры; для оптимизации используйте 25 мл среды в колбе объемом 500 мл). Инкубируют более крупные культуры встряхивающих колб в инкубаторе при 37 °C с встряхиванием при 200 об/мин (орбитальный бросок ≥25 мм) до достижения значения оптической плотности 600 нм (OD600) 0,8-1,0.ПРИМЕЧАНИЕ: Везикуляция оптимальна, когда клетки выращиваются при 37 ° C. Однако некоторые рекомбинантные белки требуют экспрессии при более низких температурах. Если это относится к интересующему белку, необходимо использовать метку VNp6, так как она позволяет экспортировать везикулы с высоким выходом при температурах до 25 °C. Чтобы индуцировать экспрессию рекомбинантного белка из промотора Т7, добавьте изопропил β-D-1-тиогалактопиранозид (IPTG) до конечной концентрации до 20 мкг / мл (84 мкМ) (см. Таблицу материалов). Индукция экспрессии рекомбинантного белка должна происходить в поздней логарифмической фазе (т.е. типичный OD600 0,8-1,0) для производства везикул.ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжительность индукционного периода может различаться между белками, при этом некоторые достигают максимальной продукции через 4 часа, а другие – ночью (18 часов). На сегодняшний день максимальный вывоз везикул получен в ночных культурах. 3. Выделение рекомбинантных везикул Гранулируют ячейки центрифугированием при 3 000 x g (4 °C) в течение 20 мин. Для стерилизации везикулсодержащих сред для длительного хранения пропустите очищенные питательные среды через стерильный и не содержащий моющих средств полиэфирсульфоновый фильтр (ПЭС) 0,45 мкм (см. Таблицу материалов).ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы проверить исключение жизнеспособных клеток из везикулосодержащего фильтрата, наложите пластину на агар LB и инкубируйте в течение ночи при 37 ° C. Чтобы сконцентрировать везикулы в меньшем объеме, пропустите стерильную везикулосодержащую среду через стерильный и не содержащий моющих средств фильтр 0,1 мкм смешанных эфиров целлюлозы (MCE) (см. Таблицу материалов). Аккуратно промойте мембрану 0,5-1 мл стерильного PBS с помощью клеточного скребка или пластикового разбрасывателя, чтобы осторожно удалить везикулы с мембраны. Переложите в свежую пробирку с микрофугой.ПРИМЕЧАНИЕ: Очищенные везикулы можно хранить в стерильных средах или фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS) при температуре 4 °C. Существуют примеры рекомбинантных белков, хранящихся в этих везикулах в течение 6 месяцев, таким образом, без потери ферментативной активности. 4. Высвобождение растворимого белка из изолированных везикул После того, как везикулы, содержащие белок, были выделены в стерильную среду / буфер, подвергните везикулярные липидные мембраны обработке ультразвуком, используя соответствующий график для аппарата (например, 6x 20 с включения и выключения циклов) и центрифугу при 39 000 x g (4 ° C) в течение 20 минут для удаления остатков везикул.ПРИМЕЧАНИЕ: Осмотический шок или детергентная обработка могут быть использованы в качестве альтернативы для вскрытия везикул, но необходимо учитывать влияние на функциональность белка и / или последующее применение. Если слияние VNp остается цитозольным и не высвобождается в среду, изолируйте белок, используя стандартные протоколы (например, ресуспендируйте клеточные гранулы в 5 мл соответствующего экстракционного буфера (20 мМ трис, 500 мМ NaCl), обработайте ультразвуком и удалите клеточный мусор центрифугированием). 5. Определение концентрации белка Определяют концентрацию белков методом гель-денситометрии тройных образцов1. Выполняйте вместе со стандартами загрузки бычьего сывороточного альбумина (BSA) на окрашенных кумасси гелях электрофореза полиакриламидного геля додецилсульфата натрия (SDS-PAGE). Отсканируйте и проанализируйте гели с помощью соответствующего программного обеспечения (например, изображение J; см. Таблицу материалов). 6. Визуализация образования везикул и изолированных везикул методом флуоресцентной микроскопии ПРИМЕЧАНИЕ: Если клетки содержат флуоресцентно меченные VNp слияние или мембранные маркеры, визуализация живых клеток может быть использована для отслеживания образования везикул. В качестве альтернативы флуоресцентные липидные красители могут быть использованы для визуализации везикул для подтверждения производства и очистки. Монтаж ячеекИндуцируйте экспрессию слияния VNp в течение нескольких часов перед установкой на покровное стекло. Метод агарозной прокладки (рис. 3A-C): пипеткой нанесите клетки на тонкую (<1 мм) круглую прокладку из LB-агарозы (2%), которой дали сформироваться и установить на чистое предметное стекло. Дайте клеткам осесть и уравновесить и поместите покровное стекло размером 50 мм x 25 мм на подушку и ячейки. Удерживайте покровное стекло на месте с помощью прокладок и клейкой ленты. Метод полиэтиленимина (PEI) (рис. 3D-F): нанесите 20 мкл 0,05% PEI (в dH2O) на покровное стекло наконечником пипетки и оставьте на 3-5 минут для связывания со стеклом, не давая высохнуть. Добавьте 50 мкл клеточной культуры и оставьте на 5-10 минут, чтобы убедиться, что бактерии связались с поверхностью, покрытой PEI4. Промойте покровное стекло 100 мкл носителя перед тем, как поместить его на предметное стекло, и удерживайте его на месте с помощью прокладок и клейкой ленты. Монтажные везикулыПипеткой наносят очищенные везикулы на тонкую (<1 мм) круглую LB-агарозную (2%) прокладку, которой дали сформироваться и установить на чистое предметное стекло. Как только жидкость высохнет, поместите покровное стекло размером 50 мм x 25 мм на подушечку и везикулы. Удерживайте покровное стекло на месте с помощью прокладок и клейкой ленты. Флуоресцентный липидный краситель FM4-64 способен окрашивать мембраны5, а потому может быть использован для визуализации везикул. Добавьте FM4-64 (см. Таблицу материалов) к очищенным везикулам в конечной концентрации 2 мкМ (из сырья 2 мМ, растворенного в диметилсульфоксиде [ДМСО]) и изображение после 10-минутной инкубации. Это особенно полезно для идентификации везикул, содержащих нефлуоресцентно маркированные грузы5. Промойте покровные стекла тем же носителем, который использовался для культивирования наблюдаемых клеток.ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые сложные среды (например, туберкулез) могут проявлять автофлуоресценцию, что может привести к избыточному фоновому сигналу. Визуализация везикулПРИМЕЧАНИЕ: Примеры микроскопических изображений рекомбинантных везикул VNp можно увидеть на рисунке 4.Установите предметное стекло на перевернутый микроскоп (см. Таблицу материалов) с помощью масляного иммерсионного объектива и оставьте на 2-3 минуты, чтобы образец осел и температура уравновешивалась.ПРИМЕЧАНИЕ: Все изображения живых клеток для каждого образца должны быть завершены в течение 30 минут после установки ячеек на покровные стекла, чтобы свести к минимуму влияние фототоксичности и анаэробного стресса. По этой причине одноплоскостные изображения предпочтительнее z-стеков. Используйте соответствующие источники света (например, светодиод [LED] или галогенную лампу; см. Таблицу материалов) и комбинации фильтров для используемого флуоресцентного белка (белков) / красителя (красителей)6. Используйте линзу с большим увеличением (например, 100x или 150x) и высокой числовой апертурой (например, NA ≥1.4) для визуализации микробных клеток и везикул. Определите минимальную интенсивность света, необходимую для визуализации сигналов флуоресценции от клеток и/или везикул. Для этого может потребоваться некоторая регулировка настроек экспозиции и усиления для используемой камеры.ПРИМЕЧАНИЕ: Типичное время экспозиции современных камер с комплементарным металл-оксидным полупроводником (КМОП) варьируется от 50 до 200 мс в зависимости от системы визуализации. Для однокадровых изображений используйте усреднение трех изображений, чтобы уменьшить аппаратно-зависимый случайный фоновый шум. Для покадровой съемки подождите 3-5 минут между отдельными кадрами.ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от настроек микроскопа может потребоваться периодическая регулировка фокуса во время длительных экспериментов с интервальной съемкой.