大肠杆菌重组蛋白填充囊泡的优化生产和分析

所进行的细菌工作遵循当地、国家和国际生物安全遏制法规，适合每种菌株的特定生物安全危害水平。 1. 选择不同的VNp 识别 VNp 序列。注意：对于本研究，已经确定了三个VNp序列1 ，这些序列导致迄今为止检查的蛋白质的最大产量和囊泡输出：VNp2，VNp6和VNp15。目前尚不清楚为什么某些VNp变体对某些蛋白质比其他蛋白质更有效地发挥作用;因此，建议在感兴趣的新蛋白质与每个VNp变体（即VNp2,6或15）之间产生融合。VNp2： MDVFMKGLSKAKEGVVAAAEKTKQGVAEAAGKTKEGVLVNp6： MDVFKKGFSIADEGVVGAVEKTDQGVTEAAEKTKEGVMVNp15： MDVFKKGFSIADEGVVGAVE允许通过不同VNp氨基末端融合表达目标蛋白的质粒已经商业化（参见 材料表）。 设计一种克隆策略，将目的基因插入编码VNp的cDNA的3’端，或者通过将合成的VNp cDNA整合到编码目标蛋白的基因的第一个ATG密码子的上游来调整现有的质粒。使用1 中所述的方法。 对于有毒蛋白，请使用具有可抑制表达启动子的载体或具有最小未诱导表达噪声的促进剂。 克隆融合蛋白氨基末端的VNp序列标签。确保亲和标签、蛋白酶切割序列等和目标蛋白位于VNp标签的羧基侧。建议使用柔性接头区域将VNp与下游肽分离，例如-G-G-S-G-G-多肽序列的两个或三个重复序列（图1）。注意：使用具有不靶向肽聚糖的抗生素选择的质粒，这会削弱细胞表面并降低囊泡产量。卡那霉素和氯霉素（见 材料表）是本研究的首选抗生素。 2. 细菌细胞培养和蛋白质诱导 注意：本协议中通常使用的细菌菌株是大肠杆菌BL21（DE3）或W3110。大肠杆菌细胞在溶原肉汤（LB）（10 g/L胰蛋白胨;10 g/L NaCl;5 g/L酵母提取物）或极好肉汤（TB）（12 g/L胰蛋白胨;24 g/L酵母提取物;4 mL/L 10%甘油;17 mM KH 2 PO 4;72 mM K2HPO 4，盐单独高压灭菌）培养基中培养（参见材料表）。图2显示了蛋白质诱导的每个步骤以及随后的分离和纯化过程的示例图像。 从37°C的新鲜细菌转化中培养5 mL LB发酵剂至饱和度，并用它们在500 mL锥形烧瓶中接种25 mL TB，所有这些都有适当的抗生素选择。 表面积：体积比是优化该系统的重要因素。使用尽可能大的培养瓶（例如，含有 1 L 培养物的 5 L 烧瓶;对于优化运行，在 500 mL 培养瓶中使用 25 mL 培养基）。 将较大的振荡瓶培养物在37°C的培养箱中以200rpm（≥25mm轨道抛出）振荡，直到达到0.8-1.0的600nm光密度值（OD600）。注意：当细胞在37°C下生长时，精泡是最佳的。 然而，一些重组蛋白需要在较低的温度下表达。如果目标蛋白质是这种情况，则必须使用VNp6标签，因为这可以在低至25°C的温度下高产量囊泡输出。 为了诱导T7启动子的重组蛋白表达，加入异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）至终浓度高达20μg/ mL（84μM）（参见 材料表）。重组蛋白表达的诱导必须在对数后期（即，典型的OD600 为0.8-1.0）发生，以产生囊泡。注意：诱导期的长度可能因蛋白质而异，有些在4小时达到最大产量，有些则在过夜（18小时）时达到最大产量。迄今为止，在过夜培养物中已获得最大的囊泡输出。 3.重组囊泡分离 通过在3,000× g （4°C）下离心20分钟来沉淀细胞。 要对含囊泡的培养基进行灭菌以进行长期储存，请将清除的培养基通过无菌且不含洗涤剂的0.45μm聚醚砜（PES）过滤器（参见 材料表）。注意：为了测试从含囊泡的滤液中排除活细胞，请平板到LB琼脂上并在37°C孵育过夜。 为了将囊泡浓缩成更小的体积，请将无菌含囊泡的培养基通过无菌且不含洗涤剂的0.1μm混合纤维素酯（MCE）过滤器（参见 材料表）。 使用细胞刮刀或塑料撒布器用 0.5-1 mL 无菌 PBS 轻轻清洗膜，小心地去除膜上的囊泡。转移到新鲜的微量离心管中。注意：纯化的囊泡可以储存在4°C的无菌培养基或磷酸盐缓冲盐水（PBS）中。 有重组蛋白在这些囊泡中储存6个月的例子，以这种方式，酶活性没有损失。 4. 从分离的囊泡中释放可溶性蛋白质 一旦将含蛋白质的囊泡分离到无菌培养基/缓冲液中，使用适当的装置时间表（例如，6x 20 s开和关循环）对囊泡脂质膜进行超声处理，并在39,000× g （4°C）下离心20分钟以除去囊泡碎片。注意：渗透休克或洗涤剂处理可用作打开囊泡的替代方案，但必须考虑对蛋白质功能和/或下游应用的影响。 如果VNp融合保持胞质且未释放到培养基中，请使用标准方案分离蛋白质（例如，将细胞沉淀重悬于5 mL适当的提取缓冲液（20 mM tris，500 mM NaCl）中，超声处理，并通过离心去除细胞碎片）。 5. 蛋白质浓度测定 通过凝胶密度分析测定蛋白质浓度 一式三份样品1.在考马斯染色的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）凝胶上与牛血清白蛋白（BSA）上样标准品一起运行。使用适当的软件（例如，图像J;参见 材料表）扫描和分析凝胶。 6. 通过荧光显微镜可视化囊泡形成和分离囊泡 注意：如果细胞含有荧光标记的VNp融合或膜标志物，则可以使用活细胞成像来跟踪囊泡形成。或者，荧光脂质染料可用于可视化囊泡以确认生产和纯化。 电池安装诱导VNp融合表达数小时，然后安装到盖玻片上。 琼脂糖垫法（图3A-C）：将细胞移液到薄（<1毫米）圆形LB-琼脂糖（2%）垫上，该垫已允许形成并设置在干净的载玻片上。让细胞沉降并平衡，并将50 mm x 25 mm盖玻片放在垫子和电池上。用垫片和胶带将盖玻片固定到位。 聚乙烯亚胺（PEI）方法（图3D-F）：用移液器吸头将20μL0.05%PEI（dH2O）散布到盖玻片上，静置3-5分钟以结合玻璃而不干燥。加入 50 μL 细胞培养物并放置 5-10 分钟，以确保细菌与 PEI 包被的表面相关联4.在将盖玻片放在载玻片上之前，用 100 μL 培养基清洗盖玻片，并用垫片和胶带将其固定到位。 安装囊泡将纯化的囊泡移液到薄（<1 mm）圆形LB-琼脂糖（2%）垫上，该垫已允许形成并设置在干净的载玻片上。液体干燥后，将50 mm x 25 mm盖玻片放在垫子和囊泡上。用垫片和胶带将盖玻片固定到位。 荧光脂质染料FM4-64能够染色膜5，因此可用于可视化囊泡。将FM4-64（参见材料表）以终浓度为2μM（来自溶解在二甲基亚砜[DMSO]中的2mM储备液）加入纯化的囊泡中，并在孵育10分钟后成像。这对于识别含有非荧光标记货物的囊泡特别有用5。 用用于培养观察到的细胞的相同培养基冲洗盖玻片。注意：一些复杂介质（例如TB）可能表现出自发荧光，这可能导致背景信号过多。 对囊泡进行成像注意：VNp重组囊泡的示例显微镜图像如图 4所示。使用油浸物镜将载玻片安装到倒置显微镜（见 材料表）上，静置2-3分钟，使样品沉降并使温度平衡。注意：每个样品的所有活细胞成像必须在将细胞安装到盖玻片上后30分钟内完成，以尽量减少光毒性和厌氧应激的影响。因此，单平面图像优先于 z 堆栈。 使用适当的光源（例如，发光二极管[LED]或卤素灯泡;见 材料表）和滤光片组合，以用于所使用的荧光蛋白/染料6。 使用高放大倍率（即100x或150x）和高数值孔径（即NA ≥1.4）镜头对微生物细胞和囊泡进行成像。 确定可视化来自细胞和/或囊泡的荧光信号所需的最小光强度。这可能需要对正在使用的相机的曝光和增益设置进行一些调整。注意：当前互补金属氧化物半导体（CMOS）相机的典型曝光时间在50-200毫秒之间变化，具体取决于成像系统。 对于单帧图像，请使用三图像平均来减少与硬件相关的随机背景噪声。 对于延时成像，在各个帧之间留出 3-5 分钟。注意：根据显微镜设置，在较长的延时实验中可能需要间歇性调整焦点。