تحسين إنتاج وتحليل الحويصلات المملوءة بالبروتين المؤتلف من الإشريكية القولونية
Summary
يصف هذا البروتوكول طريقة مفصلة لإنتاج البكتيريا للبروتينات المؤتلفة ، بما في ذلك البروتينات المحتوية على روابط غير قابلة للذوبان أو ثاني كبريتيد ، معبأة داخل حويصلات محاطة بغشاء خارج الخلية. ويمكن تطبيق ذلك على مجالات متنوعة من البحث العلمي، بما في ذلك التكنولوجيا الأحيائية التطبيقية والطب.
Abstract
يوفر هذا النظام المبتكر ، باستخدام علامة ببتيد قصيرة ، والتي تصدر بروتينات متعددة مؤتلفة في حويصلات مرتبطة بالغشاء من الإشريكية القولونية ، حلا فعالا لمجموعة من المشكلات المرتبطة بتعبير البروتين المؤتلف البكتيري. تعمل هذه الحويصلات المؤتلفة على تقسيم البروتينات داخل بيئة دقيقة تسهل إنتاج بروتينات صعبة أو سامة أو غير قابلة للذوبان أو تحتوي على روابط ثاني كبريتيد من البكتيريا. يزداد إنتاج البروتين بشكل كبير عند مقارنته بالتعبير البكتيري النموذجي في غياب علامة الببتيد ذات النواة الحويصلة. يدعم إطلاق البروتينات المعبأة في الحويصلة العزل عن وسط الاستزراع ويسمح بتخزين البروتين النشط على المدى الطويل. تؤدي هذه التكنولوجيا إلى زيادة غلة البروتينات الوظيفية المعبأة في الحويصلة من أجل المعالجة النهائية المبسطة لمجموعة متنوعة من التطبيقات من التكنولوجيا الحيوية التطبيقية إلى علوم الاكتشاف والطب. في هذه المقالة والفيديو المرتبط بها ، يتم توفير بروتوكول مفصل للطريقة ، والذي يسلط الضوء على الخطوات الرئيسية في المنهجية لزيادة إنتاج الحويصلات المملوءة بالبروتين المؤتلف.
Introduction
البكتيريا سالبة الجرام E. coli هي نظام جذاب لإنتاج البروتين المؤتلف على الصعيدين الصناعي والأكاديمي. إنها ليست فعالة من حيث التكلفة ومباشرة للاستزراع على دفعات إلى كثافات عالية فحسب ، بل تم إنشاء مجموعة واسعة من الكواشف والسلالات والأدوات والمروجين لتعزيز توليد البروتينات الوظيفية في الإشريكية القولونية1. بالإضافة إلى ذلك ، تتغلب تقنيات البيولوجيا التركيبية الآن على العقبات المتعلقة عادة بتطبيق تعديلات ما بعد الترجمة وطي البروتينات المعقدة2. تعد القدرة على استهداف إفراز البروتينات المؤتلفة في وسائط الاستزراع أمرا جذابا لتحسين الغلة وتقليل تكاليف التصنيع. يساعد التغليف الخاضع للرقابة للبروتينات المعرفة من قبل المستخدم في الحويصلات الغشائية على تطوير المنتجات والتقنيات في مجال التكنولوجيا الحيوية التطبيقية والصناعات الطبية. حتى الآن ، كان هناك نقص في الطرق القابلة للتطبيق على نطاق واسع لإفراز البروتينات المؤتلفة من E. coli 3.
طور Eastwood et al. مؤخرا طريقة قائمة على وضع العلامات على الببتيد لإنتاج وعزل الحويصلات المحتوية على البروتين المؤتلف من E. coli1. يسمح هذا الببتيد النواة الحويصلة (VNp) بإنتاج حويصلات غشائية بكتيرية خارج الخلية ، حيث يمكن استهداف البروتين المؤتلف المفضل لتبسيط تنقية وتخزين البروتين المستهدف ، ويسمح بإنتاجية أعلى بكثير مما يسمح به عادة من مزارع القارورة المهتزة. تم الإبلاغ عن غلة قريبة من 3 غرام من البروتين المؤتلف لكل لتر من زراعة القارورة ، مع غلة أعلى > 100 مرة من تلك التي تم الحصول عليها مع البروتينات المكافئة التي تفتقر إلى علامة VNp. يمكن تنقية هذه الحويصلات الغنية بالبروتين المؤتلف وتركيزها بسرعة من وسائط الاستزراع وتوفير بيئة مستقرة للتخزين. تمثل هذه التقنية طفرة كبيرة في إنتاج البروتين المؤتلف E. coli . تقوم الحويصلات بتقسيم البروتينات السامة وروابط ثاني كبريتيد المحتوية على شكل قابل للذوبان ووظيفي ، وتدعم التنقية البسيطة والفعالة والسريعة للبروتينات الوظيفية المعبأة في الحويصلة للتخزين طويل الأجل أو المعالجة المباشرة1.
المزايا الرئيسية التي تقدمها هذه التكنولوجيا على التقنيات الحالية هي: (1) قابلية التطبيق على مجموعة من الأحجام (1 كيلو دالتون إلى >100 كيلو دالتون) وأنواع البروتين. (2) تسهيل تكوين رابطة ثاني كبريتيد البروتين وداخلها ؛ (3) تنطبق على مجمعات متعددة البروتينات. (4) يمكن استخدامها مع مجموعة من المروجين وسلالات الإشريكية القولونية القياسية في المختبر ؛ (5) توليد غلات البروتينات من قوارير الاهتزاز التي لا ترى عادة إلا مع ثقافات التخمير ؛ يتم تصدير البروتينات وتعبئتها في حويصلات مرتبطة بالغشاء (6) توفر بيئة مستقرة لتخزين البروتين النشط القابل للذوبان. و (7) يبسط المعالجة النهائية وتنقية البروتين. من المرجح أن يكون لأداة البروتين المؤتلف البسيطة والفعالة من حيث التكلفة تأثير إيجابي على التكنولوجيا الحيوية والصناعات الطبية ، فضلا عن علم الاكتشاف.
هنا ، يصف بروتوكول مفصل ، تم تطويره على مدى عدة سنوات ، الظروف المثلى لإنتاج حويصلات مملوءة بالبروتين المؤتلف من البكتيريا باستخدام تقنية VNp. يتم عرض أمثلة على صور لهذا النظام في الممارسة العملية ، مع التعبير عن بروتين الفلورسنت ، مما يسمح بوجود حويصلات خلال مراحل مختلفة من الإنتاج والتنقية والتركيز. أخيرا ، يتم توفير إرشادات حول كيفية استخدام التصوير الخلوي الحي للتحقق من إنتاج الحويصلات المحتوية على اندماج VNp من البكتيريا.
Protocol
Representative Results
Discussion
طريقة الببتيد الأمينية الطرفية لإنتاج البروتينات المؤتلفة الموصوفة أعلاه هي عملية بسيطة تنتج باستمرار كميات كبيرة من البروتين يمكن عزلها و / أو تخزينها بكفاءة لعدة أشهر.
من المهم تسليط الضوء على الخطوات الرئيسية في البروتوكول المطلوبة للاستخدام الأمثل لهذا النظام. أولا ، يجب أن تكون علامة VNp1 موجودة في N-terminus ، متبوعة بالبروتين محل الاهتمام وأي علامات مناسبة. من المهم أيضا تجنب استخدام المضادات الحيوية التي تستهدف طبقة الببتيدوغليكان ، مثل الأمبيسلين.
من حيث ظروف النمو ، فإن الوسائط الغنية (على سبيل المثال ، وسائط LB أو TB) ومساحة السطح العالية: نسبة الحجم ضرورية لزيادة إنتاج الحويصلات إلى أقصى حد. درجة الحرارة المثلى لإنتاج الحويصلات خارج الخلية هي 37 درجة مئوية ، ولكن يجب مراعاة الظروف المطلوبة عادة للتعبير عن البروتين محل الاهتمام أيضا. لانخفاض درجات حرارة الحث ، يجب استخدام VNp6. بشكل حاسم ، يجب تحقيق تحريض محفز T7 باستخدام ما لا يزيد عن 20 ميكروغرام / مل (84 ميكرومتر) IPTG بمجرد وصول الخلايا إلى OD600 من 0.8-1.0. تصل البروتينات المعبر عنها باستخدام النظام إلى أقصى إنتاج للحويصلة إما في 4 ساعات أو بعد الحث الليلي.
على الرغم من بساطة هذا البروتوكول ، إلا أنه يتطلب التحسين. قد يختلف الانصهار المتغير VNp ودرجات حرارة التعبير والفترات الزمنية للحث اعتمادا على البروتين محل الاهتمام. علاوة على ذلك ، هناك حاجة لتحسين تنقية الحويصلات خارج الخلية وتركيزها لاحقا من الوسائط. الإجراء الحالي غير قابل للتطوير ويمكن أن يستغرق وقتا طويلا. هذه هي حدود هذه المنهجية.
تتمتع تقنية VNp بالعديد من المزايا مقارنة بالطرق التقليدية2. يسمح بالتصدير الحويصلي للبروتينات المتنوعة ، مع الحد الأقصى للحجم الذي تم التعبير عنه بنجاح حتى الآن هو 175 كيلو دالتون للحويصلات التي تظل داخلية و 85 كيلو دالتون لتلك التي يتم تصديرها. علاوة على ذلك ، يمكن لهذه التقنية أن تزيد بشكل كبير من إنتاجية البروتينات المؤتلفة مع مجموعة من الخصائص والأنشطة الفيزيائية. يمكن عزل الحويصلات المصدرة التي تحتوي على البروتين محل الاهتمام عن طريق الترشيح البسيط من الوسائط التي تم تطهيرها مسبقا ويمكن تخزينها لاحقا ، في وسط استزراع معقم أو مخزن مؤقت ، عند 4 درجات مئوية لعدة أشهر.
تطبيقات هذا النظام متنوعة ، من علم الاكتشاف إلى التكنولوجيا الحيوية التطبيقية والطب (على سبيل المثال ، من خلال إنتاج العلاجات الوظيفية)3. سهولة الإنتاج ، ومعالجة المصب ، والعائد العالي كلها صفات جذابة في هذه المجالات وخاصة في الصناعة.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون مستخدمي تويتر المتنوعين الذين أثاروا أسئلة حول البروتوكول المقدم في الورقة التي تصف تقنية VNp. تم إنشاء الشكل 1A باستخدام رموز من flaticon.com. تم دعم هذا العمل من قبل جامعة كنت وبتمويل من مجلس أبحاث التكنولوجيا الحيوية والعلوم البيولوجية (BB / T008/768/1 و BB / S005544/1).
Materials
| Ampicillin | Melford | 69-52-3 | |
| Chloramphenicol | Acros Organics (Thermofisher Scientific) | 56-75-7 | |
| E. coli BL21 (DE3) | Lab Stock | N/A | |
| E. coli DH10β | Lab Stock | N/A | |
| Filters for microscope | Chroma | ||
| FM4-64 | Molecular Probes (Invitrogen) | T-3166 | Dissolved in DMSO, stock concentration 2 mM |
| ImageJ | Open Source | Downloaded from: https://imagej.net/ij/index.html | |
| Inverted microscope | Olympus | ||
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Melford | 367-93-1 | |
| Kanamycin sulphate | Gibco (Thermofisher Scientific) | 11815-024 | |
| LED light source for micrscope | Cairn Research Ltd | ||
| Lysogeny Broth (LB) / LB agar | Lab Stock | N/A | 10 g/L Tryptone; 10 g/L NaCl; 5 g/L Yeast Extract (1.5 g/L agar) |
| Metamorph imaging software | Molecular Devices | ||
| MF-Millipore Membrane filter (0.1 µm, MCE) | Merck | VCWP04700 | |
| Millipore Express PLUS membrane filter (0.45 µm, PES) | Merck | HPWP04700 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Lab Stock | N/A | |
| Plasmids allowing expression of protein of interest with different VNp amino terminal fusions | Addgene | https://www.addgene.org/Dan_Mulvihill/ | |
| Terrific Broth (TB) | Lab Stock | N/A | 12 g/L Tryptone; 24 g/L Yeast Extract; 4 ml/L 10% glycerol; 17 mM KH2PO4 72 mM K2HPO4 |
Referencias
- Eastwood, T. A., et al. High-yield vesicle-packaged recombinant protein production from E. coli. Cell Reports Methods. 3 (2), 100396 (2023).
- Makino, T., Skretas, G., Georgiou, G. Strain engineering for improved expression of recombinant proteins in bacteria. Microbial Cell Factories. 10, 32 (2011).
- Peng, C., et al. Factors influencing recombinant protein secretion efficiency in gram-positive bacteria: Signal peptide and beyond. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 139 (2019).
- Lewis, K., Klibanov, A. M. Surpassing nature: rational design of sterile-surface materials. Trends in Biotechnology. 23 (7), 343-348 (2005).
- Betz, W. J., Mao, F., Smith, C. B. Imaging exocytosis and endocytosis. Current Opinion in Neurobiology. 6 (3), 365-371 (1996).
- Mulvihill, D. P. Live cell imaging in fission yeast. Cold Spring Harbor Protocols. 2017 (10), (2017).
- Shaner, N. C., et al. A bright monomeric green fluorescent protein derived from Branchiostoma lanceolatum. Nature Methods. 10 (5), 407-409 (2013).
- Shen, Y., Chen, Y., Wu, J., Shaner, N. C., Campbell, R. E. Engineering of mCherry variants with long Stokes shift, red-shifted fluorescence, and low cytotoxicity. PloS One. 12 (2), e0171257 (2017).
- Periz, J., et al. A highly dynamic F-actin network regulates transport and recycling of micronemes in Toxoplasma gondii vacuoles. Nature Communications. 10 (1), 4183 (2019).
- Qiu, H., et al. Uniform patchy and hollow rectangular platelet micelles from crystallizable polymer blends. Science. 352 (6286), 697-701 (2016).
