Activité adjuvante de Mycobacterium paratuberculosis dans l’amélioration de l’immunogénicité des autoantigènes au cours de l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale
Summary
Ici, nous présentons un protocole alternatif pour induire activement l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale chez les souris C57BL / 6, en utilisant l’épitope immunogène myéline oligodendrocyte glycoprotéine (MOG)35-55 en suspension dans l’adjuvant de Freund incomplet contenant la sous-espèce paratuberculose de Mycobacterium avium tuée par la chaleur.
Abstract
L’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) induite par la glycoprotéine oligodendrocytaire de myéline (MOG) nécessite une immunisation par un peptide MOG émulsionné dans un adjuvant de Freund complet (CFA) contenant Mycobacterium tuberculosis. Les composants antigéniques de la mycobactérie activent les cellules dendritiques pour stimuler les cellules T à produire des cytokines qui favorisent la réponse Th1 via des récepteurs de type Toll. Par conséquent, la quantité et les espèces de mycobactéries présentes lors de la provocation antigénique sont directement liées au développement de l’EAE. Cet article sur les méthodes présente un protocole alternatif pour induire l’EAE chez les souris C57BL/6 à l’aide d’un adjuvant de Freund incomplet modifié contenant la souche K-10 de la sous-espèce Paratuberculosis de Mycobacterium avium tuée par la chaleur.
M. paratuberculosis, membre du complexe Mycobacterium avium, est l’agent causal de la paratuberculose chez les ruminants et a été identifié comme un facteur de risque de plusieurs troubles induits par les lymphocytes T humains, y compris la sclérose en plaques. Dans l’ensemble, les souris immunisées avec Mycobacterium paratuberculosis ont montré une apparition plus précoce et une plus grande gravité de la maladie que les souris immunisées avec CFA contenant la souche H37Ra de M. tuberculosis aux mêmes doses de 4 mg/mL. Les déterminants antigéniques de la souche K-10 de la sous-espèce paratuberculeuse de Mycobacterium avium ont pu induire une forte réponse cellulaire Th1 pendant la phase effectrice, caractérisée par un nombre significativement plus élevé de lymphocytes T (CD4+ CD27+), de cellules dendritiques (CD11c+ I-A/I-E+) et de monocytes (CD11b+ CD115+) dans la rate comparativement aux souris immunisées par le CFA. De plus, la réponse proliférative des lymphocytes T au peptide MOG semblait être la plus élevée chez les souris immunisées contre M. paratuberculosis. L’utilisation d’un encéphalitogène (p. ex. MOG35-55) émulsionné dans un adjuvant contenant M. paratuberculosis dans la formulation peut être une méthode alternative et validée pour activer les cellules dendritiques pour amorcer les lymphocytes T CD4+ spécifiques de l’épitope de myéline pendant la phase d’induction de l’EAE.
Introduction
L’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) est un modèle commun pour l’étude des troubles démyélinisants humains1. Il existe plusieurs modèles d’EAE : immunisation active à l’aide de différents peptides de myéline en combinaison avec des adjuvants puissants, immunisation passive par transfert in vitro de lymphocytes CD4+ spécifiques de la myéline et modèles transgéniques d’EAE2 spontanée. Chacun de ces modèles présente des caractéristiques spécifiques qui permettent d’étudier différents aspects de l’EAE, tels que l’apparition, la phase effectrice ou la phase chronique. Le modèle de glycoprotéine oligodendrocytaire de myéline (MOG) de l’EAE est un bon modèle pour étudier les mécanismes à médiation immunitaire de la neuroinflammation chronique et de la démyélinisation, car il est caractérisé par une infiltration inflammatoire mononucléaire, une démyélinisation dans la substance blanche périphérique et une récupération réduite après le pic de la maladie1.
Le MOG-EAE est induit par l’immunisation de souris sensibles avec le peptide MOG35-55 dans l’adjuvant de Freund complet (CFA), suivie d’une injection intrapéritonéale de toxine coqueluche. Cela augmente la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique et permet aux lymphocytes T spécifiques à la myéline activés à la périphérie d’atteindre le système nerveux central (SNC), où ils seront réactivés3. La CFA joue un rôle clé dans l’induction de l’EAE en améliorant l’absorption de l’antigène par les cellules présentatrices d’antigènes et l’expression des cytokines liées aux réponses humorales et à médiation cellulaire4. Ce mécanisme est principalement dû à la présence de Mycobacterium tuberculosis tué émulsionné dans l’huile, dont les composants fournissent un puissant stimulant pour le système immunitaire5. En fait, l’induction de l’EAE est directement liée à la quantité de mycobactérie présente lors du défi antigénique6.
L’ajout d’autres mycobactéries tuées, telles que Mycobacterium butyricum, à l’adjuvant de Freundincomplet 7, ainsi que l’effet des combinaisons adjuvantes8, peuvent moduler l’évolution clinique de l’EAE et par conséquent influencer la reproductibilité des résultats. Mycobacterium avium sous-espèce paratuberculosis (MAP), l’agent étiologique de la paratuberculose chez les ruminants, a été associé à des troubles inflammatoires du SNC humain 9, car ses composants antigéniques sont capables de provoquer une forte réponse humorale et cellulaire chez les patients atteints de sclérose en plaques et de troubles du spectre de la neuromyélite optique9. Par conséquent, dans ce protocole, nous montrons une méthode alternative et reproductible pour induire MOG-EAE en remplaçant M. tuberculosis dans CFA par M. paratuberculosis.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous avons démontré un protocole alternatif robuste pour induire activement une EAE sévère chez les souris C57BL/6J en utilisant le peptide MOG35-55 émulsionné dans un adjuvant contenant M. paratuberculosis10. L’induction de l’EAE par cette méthode a entraîné une maladie plus sévère que celle induite par le protocole commun avec le CFA. Cette différence pourrait être due aux différents composants lipidiques dans la paroi cellulaire des mycobactéries<sup class…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a reçu le soutien d’une subvention de la Société japonaise pour la promotion de la science (subvention no. JP 23K14675).
Materials
| anti-mouse CD115 antibody | Biolegend, USA | 135505 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD11b antibody | Biolegend, USA | 101215 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD11c antibody | Biolegend, USA | 117313 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD16/32 antibody | Biolegend, USA | 101302 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD4 antibody | Biolegend, USA | 116004 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD8a antibody | Biolegend, USA | 100753 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse I-A/I-E antibody | Biolegend, USA | 107635 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse Ly-6C antibody | Biolegend, USA | 128023 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| BBL Middlebrook OADC Enrichment | Thermo Fisher Scientific, USA | BD 211886 | for isolation and cultivation of mycobacteria |
| C57BL/6J mice | Charles River Laboratory, Japan | 3 weeks old, male and female | |
| FBS 10279-106 | Gibco Life Techologies, USA | 42F9155K | for cell culture, warm at 37 °C before use |
| Freeze Dryer machine | Eyela, Tokyo, Japan | FDU-1200 | for bacteria lyophilization |
| incomplete e Freund’s adjuvant | Difco Laboratories, MD, USA | 263810 | for use in adjuvant |
| Middlebrook 7H9 Broth | Difco Laboratories, MD, USA | 90003-876 | help in the growth of Mycobacteria |
| Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis K-10 | ATCC, USA | BAA-968 | bacteria from bovine origin |
| Mycobacterium tuberculosis H37 Ra, Desiccated | BD Biosciences, USA | 743-26880-EA | for use in adjuvant |
| Mycobactin J | Allied Laboratory, MO, USA | growth promoter | |
| Myelin Oligodendrocyte Glycolipid (MOG) 35-55 | AnaSpec, USA | AS-60130-10 | encephalotigenic peptide |
| Ovalbumin (257-264) | Sigma-Aldrich, USA | S7951-1MG | negative control antigen for proliferative assay |
| pertussis toxin solution | Fujifilm Wako, Osaka Japan | 168-22471 | From gram-negative bacteria Bordetella pertussi, increases blood-brain barrier permeability |
| Polytron homogenizer PT 3100 | Kinematica | for mixing the antigen with the adjuvant | |
| RPMI 1640 with L-glutamine | Gibco Life Techologies, USA | 11875093 | For cell culture |
| Thymidine, [Methyl-3H], in 2% ethanol, 1 mCi | PerkinElmer, Waltham, MA, USA | NET027W001MC | for proliferation assay, use (1 μCi/well) |
| Zombie NIR Fixable Viability Kit | Biolegend, USA | 423105 | cytofluorimetry, for cell viability |
Referencias
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