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Inmunología y contagio

Detección simultánea de diferentes clases de anticuerpos en una prueba serológica multiplexada

Published: July 14, 2023
doi:
10.3791/65323
, , , , , , , , , , ,
1NMI Natural and Medical Sciences Institute at the University of Tübingen, 2Department of Neurology,Sächsisches Krankenhaus Rodewisch, 3Department of Epidemiology,Helmholtz Centre for Infection Research, 4German Centre for Infection Research (DZIF)

Summary

Se utilizó un sistema de análisis de flujo de fluorescencia de doble reportero de tres canales para desarrollar un inmunoensayo múltiple basado en perlas que evalúa simultáneamente muestras de suero para IgG e IgM provocadas contra múltiples antígenos de diferentes especies de Borrelia que causan borreliosis de Lyme en Europa y América del Norte.

Abstract

Para monitorizar la progresión de las enfermedades infecciosas, es útil evaluar la inmunorreactividad frente a diversos determinantes antigénicos y medir diferentes isotipos de anticuerpos, ya que aparecen en diferentes etapas de la respuesta inmunitaria del huésped. En el caso de la borreliosis de Lyme, el agente patógeno puede ser uno de los múltiples miembros de la especie Borrelia . Por lo tanto, la correcta clasificación de las muestras requiere evaluar la inmunorreactividad frente a diferentes antígenos de diferentes especies de Borrelia . Además, las respuestas de IgG e IgM antipatógenas pueden tener diferentes cursos de tiempo de elicitación durante la progresión de la enfermedad. Aquí demostramos el desarrollo de un inmunoensayo múltiple de dos reporteros que tiene utilidad para identificar la respuesta inmune específica de Borrelia en muestras de suero humano mediante la evaluación simultánea de la inmunorreactividad de IgG e IgM contra diferentes antígenos bacterianos en el mismo pozo de reacción. Este enfoque de doble informante conserva el rendimiento analítico de los métodos de un solo informador, al tiempo que conserva tiempo y recursos y reduce los requisitos de tamaño de muestra. Este ensayo permite generar esencialmente el doble de información serológica a partir de una muestra de sangre en la mitad de tiempo.

Introduction

La borreliosis de Lyme es la enfermedad infecciosa transmitida por garrapatas más común en climas moderados del hemisferio norte1. Es causada por bacterias espiroquetas del género Borrelia, con cinco patógenos humanos conocidos que varían en distribución geográfica2. Las principales especies patógenas de Borrelia en Europa son B. afzelii y B. garinii, con B. burgdorferi s.s., B. spielmanii y B. bavariensis implicadas con menor frecuencia. En América del Norte, B. burgdorferi s.s. es el único agente causal de la borreliosis de Lyme 2,3. Los patógenos de Borrelia son transmitidos por miembros del género de garrapatas Ixodes, y la transmisión puede ocurrir dentro de las 24 horas posteriores a la picadura de garrapata4.

El diagnóstico de la borreliosis de Lyme generalmente se realiza mediante síntomas clínicos y posteriormente se confirma mediante serología. Tanto en Europa como en América del Norte, las guías diagnósticas recomiendan una serie de pruebas en dos pasos que consiste en un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) con un inmunoblot reflejo para evaluar la respuesta de anticuerpos contra antígenos específicos de Borrelia 1,5,6,7,8,9 . Sin embargo, este enfoque carece de sensibilidad y no es óptimo, especialmente en la fase temprana de la infección, cuando la seroconversión puede ser incompleta y los títulos de IgG e IgM anti-Borrelia son demasiado bajos6.

Los inmunoensayos multiplex mejoran los inmunoensayos tradicionales que miden solo un objetivo a la vez, y pueden evaluar simultáneamente múltiples respuestas de isotipos de anticuerpos contra uno o más antígenos 10,11,12. Los ensayos como los ELISA se limitan a identificar y cuantificar un solo analito por reacción, en el caso actual de IgG o IgM circulante inducida contra un único antígeno bacteriano tras la infección por Borrelia. Este informe ilustra el uso de la tecnología de perfil de analito basada en perlas para el desarrollo de un inmunoensayo multiplex que detecta simultáneamente anticuerpos IgG e IgM contra cualquiera de los antígenos de Borrelia aquí elegidos en muestras de suero humano. Se seleccionaron cuatro antígenos que en conjunto cubren las especies patógenas de Borrelia nativas de Europa más comunes (B. garinii, B. afzelii, B. burgdorferi s.s.) y América del Norte (B. burgdorferi s.s.) (Tabla 1) 2,3. Esto permite una identificación decisiva del patógeno y la capacidad de discernir la inmunorreactividad temprana de la IgM y la posterior inmunorreactividad de la IgG más duradera en las muestras de los pacientes.

Isotipo objetivo Canal Reportero Antígeno Especies de Borrelia Colar Concentración de acoplamiento de antígeno
Igm PEI OspC B. garinii 20047 5,0 μg/106 perlas
IgG BV421 VlsE B. burgdorferi s.s B31 1,25 μg/106 perlas
IgG BV421 DbpA B. burgdorferi s.s. ZS7 10,0 μg/106 perlas
IgG BV421 DbpA B. afzelii PKo 5,0 μg/106 perlas

Tabla 1: Antígenos representativos de Borrelia utilizados para el desarrollo de ensayos múltiples.

Inicialmente, desarrollamos un inmunoensayo de un solo reportero que detectaba anticuerpos IgG o IgM contra el antígeno anti-Borrelia en dos reacciones separadas y luego fusionamos estos ensayos en un ensayo múltiplex de doble reportero que mide ambos isotipos de anticuerpos en la misma mezcla de reacción. Las perlas magnéticas se acoplan a un antígeno diana del patógeno de interés y luego se incuban con muestras de suero del paciente. El antígeno acoplado a perlas es reconocido y capturado tanto la IgG como la IgM circulantes en el suero que se genera en una respuesta inmunitaria contra ese antígeno patógeno. La especificidad de IgG frente a IgM se determina mediante la selección de un anticuerpo secundario que se une a IgG o IgM, cada uno con una señal de fluoróforo distinta asociada a los dos anticuerpos secundarios. Cada señal fluorescente se detecta en uno de los dos canales reporteros del instrumento (es decir, doble reportero) que tiene un láser de excitación diferente y una captura de emisión específica para el fluoróforo único utilizado para detectar IgG o IgM (aquí Brilliant Violet 421 o ficoeritrina, respectivamente). El canal de clasificación del instrumento identifica el tinte codificado por colores que es inherente a los diferentes conjuntos de cuentas. Por lo tanto, se pueden acoplar múltiples antígenos diana a perlas teñidas de manera diferente, y los conjuntos de perlas se mezclan y se utilizan para evaluar de manera integral la inmunorreactividad antipatógena diversa en muestras de suero. El canal de clasificación identifica cada conjunto de perlas individuales (es decir, antígeno específico) y mide la fluorescencia asociada con IgG o IgM frente a ese antígeno. El ensayo multiplex resultante ahorra tiempo y recursos en comparación con las pruebas clásicas menos exhaustivas y cataloga con precisión la inmunorreactividad de la enfermedad de Lyme en volúmenes de muestra limitados. Mientras que un enfoque similar de doble reportero se ha utilizado anteriormente para categorizar las respuestas inmunitarias en otras patologías como la infección por SARS-CoV-213, este informe detalla la aplicación de la tecnología de ensayo fluorescente multiplex para caracterizar la inmunorreactividad en la borreliosis de Lyme.

Protocol

Se recibió la aprobación apropiada de la Junta de Revisión Institucional y el Comité de Ética para el uso de muestras de suero humano en esta serie experimental. Las muestras fueron materiales residuales anonimizados de un estudio nacional alemán de seroprevalencia del SARS-CoV-214. La aprobación para el uso de muestras humanas fue otorgada por el Comité de Ética de la Facultad de Medicina de Hannover, Alemania (9086_BO_S_2020). En el presente estudio se utilizaron un total de 21 muestras de suero humano. 1. Aprobación ética para el uso de muestras humanas Obtener las aprobaciones éticas apropiadas para el uso de muestras humanas. 2. Reactivos y equipos Muestras de suero humano: Realizar la validación técnica del ensayo y el control de calidad utilizando muestras de suero de personas previamente diagnosticadas con borreliosis de Lyme o de un estado inmunológico negativo para Borrelia 12,14. Instrumentación de un solo reportero. Utilice un instrumento de un solo reportero de dos canales (Tabla de materiales) para el desarrollo inicial del ensayo y la validación técnica.NOTA: El sistema de un solo reportero tiene dos láseres: 1) identifica y cuantifica la fluorescencia específica del conjunto de perlas para discriminar diferentes conjuntos de perlas, si se utilizan (canal de clasificación), y 2) detecta y cuantifica la fluorescencia de ficoeritrina (PE) específica del objetivo unido a perlas (canal reportero; excitación de 532 nm, emisión “naranja” de 565-585 nm). Por lo tanto, solo se puede analizar una sola clase de isotipo de anticuerpo (por ejemplo, IgG o IgM) a la vez utilizando el único canal informador.Realizar estudios de validación iniciales para evaluar la IgG y la IgM anti-Borrelia por separado, en un formato de 96 pocillos de un solo reportero que utiliza reactivos de detección marcados con PE para ambas clases de anticuerpos.NOTA: El presente ensayo evalúa las IgG circulantes específicas para el antígeno VlsE de Borrelia y dos variantes de DbpA, y las IgM circulantes específicas para el antígeno OspC, como ejemplos representativos. El ensayo puede ampliarse para evaluar la inmunorreactividad sérica frente a otros antígenos anti-Borrelia , según se desee12. Instrumentación de doble reportero. Utilizar un instrumento de doble reportero de tres canales (Tabla de Materiales) que permita el análisis concurrente de IgG/IgM en la misma reacción, para el desarrollo y validación técnica del ensayo dual IgM/IgG (detallado más adelante). Este instrumento tiene un total de 3 canales de detección de fluorescencia, de los cuales 2 son canales reporteros que evalúan las señales asociadas a Ig dirigidas.NOTA: El sistema de doble reportero tiene tres láseres: 1) identifica y cuantifica la fluorescencia específica del conjunto de perlas (canal de clasificación); 2) detecta y cuantifica la fluorescencia de ficoeritrina (PE) específica de la diana (Canal Reportero 1; excitación de 532 nm, emisión “naranja” de 565-585 nm), y 3) evalúa la fluorescencia de violeta brillante 421 (BV421) específica de la diana de un segundo analito diana (Canal Reportero 2; excitación de 405 nm, emisión “azul” de 421-441 nm). El sistema de doble reportero es compatible con los formatos de ensayo de placa de microtitulación (manipulación semiautomática) de 96 pocillos y 384 pocillos. El esquema general del ensayo se muestra en la Figura 1. Los pasos del protocolo se detallan a continuación. 3. Acoplamiento de antígenos Acoplar los antígenos de Borrelia a microesferas magnéticas, carboxiladas y fluorescentes codificadas por colores de 6,5 μm (perlas; Tabla de Materiales) utilizando la química de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC)/sulfo-N-hidroxisuccinimida (sNHS).NOTA: Se puede encontrar una descripción detallada en la referencia11y la referencia12. Encuentre la concentración de acoplamiento de cada antígeno en la Tabla 1. Las perlas acopladas deben almacenarse en la oscuridad a 4 °C hasta su uso. Todos los tampones utilizados en las reacciones de acoplamiento y detección se detallan en los Materiales Suplementarios. 4. Procedimiento de ensayo: Ensayo serológico de IgG o IgM de un solo reportero: formato de 96 pocillos Diluir la muestra en 2 pasos (2 pasos, ambos en placas de 96 pocillos; dilución de la muestra de suero de 200 veces en tampón de ensayo).NOTA: La composición del tampón de ensayo es una mezcla 1:4 de tampón cruzado bajo: PBS que contiene 1% (p/v) de albúmina sérica bovina. El Tween-20 se añade a la mezcla hasta una concentración final del 0,05 % (v/v).Paso 1 de dilución de la muestra: Mezclar 5 μl de la muestra de suero con 120 μl del tampón de ensayo (dilución de 25 veces). Paso 2 de dilución de la muestra: Diluya la dilución de la muestra de 25 veces y adicionalmente 8 veces mezclando 10 μL de la dilución con 70 μL del tampón de ensayo para que la dilución final de la muestra sea de 200 veces. Dilución de mezcla de perlas magnéticasPrepare una mezcla de perlas que contenga 1,0 × 106 perlas/ml por población de perlas (es decir, por antígeno diana único). Diluya la mezcla de perlas preparada 25 veces en tampón de ensayo para que la concentración final de perlas en esta suspensión diluida sea ahora de 4 × 104 perlas/ml por población de perlas (es decir, por antígeno diana único). Incubación de muestras de suero con perlasPipetear 25 μL de suspensión de perlas múltiplex acoplada diluida (que contiene 4,0 × 104 perlas/set/mL) en pocillos asignados de una placa de microtitulación de media área de 96 pocillos (Tabla de materiales). Añadir 25 μL de muestra de suero diluida 200 veces (del Paso 4.1 anterior) en pocillos apropiados que contengan 25 μL de suspensión de perlas acopladas.NOTA: Esto produce una dilución adicional de 2 veces, por lo que la dilución final de la muestra de suero en el pocillo es de 400 veces y el recuento final de perlas es de 1000 perlas / juego de perlas / reacción de 50 μL. Cubra la placa de reacción de 96 pocillos con un sello de microplaca (lámina adhesiva o cubiertas de placa de plástico). Incubar la placa durante 2 h a 20 °C, a 750 rpm en un agitador de placas. Lavado de perlasRetire la placa de reacción de 96 pocillos del agitador de placas y retire con cuidado el sello de la placa adhesiva. Coloque la placa de reacción de 96 pocillos en una arandela de placas. Lave las perlas tres veces con tampón de lavado de 100 μL (1× PBS + 0,05% v/v Tween 20) utilizando la lavadora de placas magnética automática. Vuelva a suspender las perlas lavadas en 100 μL de tampón de lavado, cubra la placa con una lámina adhesiva o una cubierta de plástico para placas y agite la placa en un agitador de placas durante 1 min a 20 °C a 1000 rpm. Divide las cuentas lavadasRetire la placa de reacción de 96 pocillos del agitador de placas y retire con cuidado el sello de la placa adhesiva. Mezcle las reacciones pipeteando hacia arriba y hacia abajo cinco veces y transfiera 50 μL de cada volumen de reacción de 100 μL a cada una de las dos nuevas placas de reacción de 96 pocillos, una placa para la detección de IgG y otra para la detección de IgM. Detección de incubación de anticuerpos/reactivosNOTA: En este punto, las perlas acopladas al antígeno diana se han incubado con muestras de suero para extraer los anticuerpos circulantes en el suero (si están presentes) que reaccionan con los antígenos. Las perlas reaccionadas con inmunoglobulina unida se han dividido en dos placas, y la IgG y la IgM ahora se detectan y cuantifican en sus placas separadas utilizando anticuerpos secundarios específicos del isotipo con una marca PE. Escalonar la manipulación de la placa en 20 min.Aspire el sobrenadante de los pocillos que contienen perlas magnéticas utilizando la arandela de placas magnéticas. Para cada placa, prepare la mezcla adecuada de reactivos de detección de Ig (ya sea anti-IgG o anti-IgM), que contenga IgG antihumana de cabra conjugada con PE (3 μg/mL) o IgM antihumana de burro conjugado con PE (5 μg/mL) en el tampón de ensayo. Para cada pocillo que contiene perlas, se utilizan 30 μL de reactivo de detección. Prepare suficientes volúmenes de reactivos de detección de IgG e IgM para los pocillos de reacción, con suficiente extra para acomodar las pérdidas de pipeteo. Pipetear 30 μL de reactivo de detección de IgG en cada pocillo que contenga perlas reaccionadas en la placa de IgG y cubrir la placa de reacción de 96 pocillos con un sello de microplaca. Pipetear 30 μL de reactivo de detección de IgM en cada pocillo que contenga perlas reaccionadas en la placa de IgM y cubrir la placa de reacción de 96 pocillos con un sello de microplaca. Incubar durante 45 min a 20 °C agitando a 750 rpm en un agitador de placas. Lavado de perlasRetire la placa de reacción de 96 pocillos del agitador de placas y retire con cuidado el sello de la placa adhesiva. Coloque la placa de reacción de 96 pocillos en una arandela de placa magnética. Lave las perlas tres veces con un tampón de lavado de 100 μL utilizando la lavadora de placas magnéticas. Vuelva a suspender las perlas en 100 μL de tampón de lavado. Analice los resultados en el instrumento de reportero único.Cubra la placa de reacción de 96 pocillos con un sello de microplaca. Agite la placa de reacción de 96 pocillos durante 3 min a 20 °C, a 1000 rpm en un agitador de placas. Transfiera la placa de reacción de 96 pocillos del agitador de placas y colóquela en un instrumento analizador de flujo de un solo reportero (Tabla de materiales). Para cada muestra, analice la mediana de la intensidad fluorescente (MFI) utilizando los siguientes ajustes del instrumento: Volumen de absorción = 80 μL, Recuento = 50/población de perlas, Tiempo de espera = 60 s, Activación = 7.500-15.000)12,13. 5. Procedimiento de ensayo: Ensayo serológico de IgG e IgM de doble reportero: formato de 96 pocillos Dilución de la muestra (2 pasos, ambos en placas de 96 pocillos; dilución de la muestra de suero 200 veces en tampón de ensayo)Paso 1 de dilución de la muestra: Mezclar 5 μl de muestra de suero con 120 μl de tampón de ensayo (dilución de 25 veces). Paso 2 de dilución de la muestra: Diluir las diluciones de la muestra de 25 veces 8 veces más mezclando 10 μl de la primera dilución (muestra diluida 25 veces de la sección 5.1.1) con tampón de ensayo de 70 μl (dilución de 8 veces), para obtener una dilución final de la muestra de 200 veces. Dilución de mezcla de perlas magnéticasPrepare una mezcla de perlas que contenga 1,0 × 106 perlas acopladas a antígeno diana/ml por población de perlas (es decir, por antígeno diana único).NOTA: En esta serie experimental, evaluamos la inmunorreactividad de IgG e IgM frente a cuatro antígenos únicos de Borrelia en cada reacción. Diluya la mezcla de perlas preparada 50 veces en tampón de ensayo. La concentración de perlas en esta suspensión diluida es ahora de 2,0 × 104 perlas/ml por población de perlas.NOTA: El número de perlas en la reacción de ensayo dúplex se reduce a la mitad con respecto al utilizado en la reacción de un solo reportero para permitir la comparabilidad directa entre los dos ensayos y conservar los recursos, después de que los estudios preliminares confirmaran que la señal de fluorescencia se mantenía dentro del rango lineal de cuantificación cuando se utilizaba la mitad del número de perlas. Incubación de muestras de suero con perlasPipetear 25 μL de suspensión de perlas acopladas al antígeno diana diluida (que contiene 2,0 × 104 perlas/set/mL) en pocillos preasignados de una placa de microtitulación de media área de 96 pocillos. El número exacto de pocillos de reacción y su colocación en la placa dependen del número total de muestras analizadas determinado por el operador y de si se ejecutarán pocillos individuales o replicados por muestra.NOTA: Las perlas magnéticas acopladas al antígeno diana se harán reaccionar con muestras de suero humano. Tanto la IgG como la IgM inmunorreactivas al antígeno anti-Borrelia , si están presentes en las muestras, se unirán y se inmovilizarán en las mismas perlas acopladas al antígeno. A continuación, se realizará la cuantificación secundaria de anticuerpos de IgG e IgM unidos en las mismas perlas en las mismas reacciones, utilizando diferentes fluoróforos para la identificación de IgG e IgM que permita su diferenciación. Añadir 25 μL de suero diluido 200 veces (del paso 5.1 anterior) en cada pocillo que contenga 25 μl de suspensión de perlas acopladas al antígeno diana mixto (paso 5.2).NOTA: Esto produce una dilución adicional de 2 veces, por lo que la dilución final de la muestra de suero en el pocillo es de 400 veces y el recuento final de perlas es de 500 perlas / juego de perlas / reacción de 50 μL. Cubra la placa de reacción de 96 pocillos con un sello de microplaca (lámina adhesiva o cubierta de placa de plástico). Incubar la placa con perlas durante 2 h a 20 °C, a 750 rpm en un agitador de placas. Lavado de perlas (para eliminar el exceso de muestra de suero)Retire la placa de reacción de 96 pocillos del agitador de placas y retire el sello de la placa adhesiva. Coloque la placa de reacción de 96 pocillos en una arandela de placa magnética. Lave las perlas tres veces con un tampón de lavado de 100 μL utilizando la lavadora de placas magnéticas. Aspire el volumen de lavado final de las perlas después del último paso de lavado. Detección de anticuerpos (Incubación – Parte I)Hacer un reactivo de detección dual de IgG e IgM fresco que contenga IgG antihumana de cabra biotinilada (1 μg/mL) junto con IgM antihumana de burro conjugada con PE (5 μg/mL) en tampón de ensayo. Para cada pocillo que contiene perlas, se utilizan 30 μL de reactivo de detección dual. Prepare suficientes volúmenes de reactivos de detección dual de IgG e IgM para los pocillos de reacción, con suficiente extra para acomodar las pérdidas de pipeteo. Pipetee 30 μL de reactivo de detección dual de IgG e IgM en cada pocillo asignado y cubra la placa de reacción de 96 pocillos con un sello de microplaca. Incubar la placa durante 45 min a 20 °C mientras se agita a 750 rpm en un agitador de placas. Lavado de perlas (para eliminar el exceso de anticuerpos de detección)Retire la placa de reacción de 96 pocillos del agitador de placas y retire con cuidado el sello de la placa adhesiva. Coloque la placa de reacción de 96 pocillos en una arandela de placa magnética automática. Lave las perlas tres veces con un tampón de lavado de 100 μL utilizando la lavadora de placas magnética automática. Aspire el volumen de lavado final de las perlas después del último paso de lavado. Reportero conjugado con estreptavidina (Incubación – Parte II)Diluir estreptavidina fresca marcada con BV421 en tampón de ensayo a una concentración de 0,2 μg/ml. Para cada pocillo que contiene perlas, se utilizan 30 μL de estreptavidina marcada con BV421. Prepare suficiente volumen de estreptavidina marcado con BV421 para los pocillos de reacción, con suficiente extra para acomodar las pérdidas de pipeteo. Pipetear 30 μL de BV421-Estreptavidina diluida en cada pocillo de reacción y cubrir la placa de reacción de 96 pocillos con el sello de microplaca. Incubar la placa durante 30 min a 20 °C mientras se agita a 750 rpm en un agitador de placas. Lavar las perlas (para eliminar el exceso de BV421-Estreptavidina)Retire la placa de reacción de 96 pocillos del agitador de placas y retire con cuidado el sello de la placa adhesiva. Coloque la placa de reacción de 96 pocillos en la arandela de placa magnética. Lave las perlas tres veces con un tampón de lavado de 100 μL utilizando la lavadora de placas magnética automática. Vuelva a suspender las perlas dentro de los pocillos hasta un volumen final de 100 μL en tampón de lavado. Analice los resultados en el instrumento de doble reporteroCubra la placa de reacción de 96 pocillos con un sello de microplaca. Incubar la placa de reacción de 96 pocillos durante 3 min a 20 °C, a 1000 rpm en un agitador de placas. Transfiera la placa de reacción de 96 pocillos del agitador de placas al instrumento analizador de flujo de doble indicador (Tabla de materiales). Evalúe la mediana de la intensidad fluorescente (MFI) de la muestra de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Configuración del instrumento: modo de doble reportero, volumen de absorción = 80 μL, recuento = 50/población de perlas, tiempo de espera = 60 s, compuerta = 7.500-15.000). 6. Ensayo serológico de IgG e IgM de doble reportero: formato semiautomatizado de 384 pocillos Realice el ensayo de doble indicador en formato de placa de 384 pocillos siguiendo los pasos de ensayo detallados en la sección 5, pero procese las muestras utilizando un robot de pipeteo y una lavadora de placas magnética automatizada (Tabla de materiales). En formato de 384 pocillos, agite las placas durante las incubaciones y lavados a 1450 rpm, y antes de medir la fluorescencia, agite la placa durante 5 minutos a 21 °C y 1800 rpm.

Representative Results

Visión general del experimentoEn la Figura 1 se muestran los esquemas generales para los ensayos de Borrelia basados en perlas de un solo reportero y de doble reportero. En el caso de las dianas de anticuerpos individuales (es decir, IgG o IgM) generadas contra un antígeno de Borrelia determinado, ambas clases de anticuerpos se evaluaron de forma independiente en muestras de suero humano utilizando un anticuerpo antiisotipo conjugado con PE para su notificación. Para el ensayo de doble reportero con análisis simultáneo de la inmunorreactividad de IgG e IgM, la detección de IgG específica del antígeno de Borrelia utilizó un sistema reportero de estreptavidina (fluorescencia azul) marcado con IgG humana + BV421 biotinilado, al tiempo que conservó el reportero conjugado con PE (fluorescencia naranja) para la detección de IgM. El flujo de trabajo del ensayo de doble reportero es similar al del ensayo de un solo reportero, con la excepción de una incubación adicional del sistema de detección de 30 minutos con el reactivo de detección de fluorescencia de segundo canal BV421-Estreptavidina. Figura 1: Esquema de los ensayos de Borrelia basados en perlas de un solo reportero y de doble reportero. (A) El instrumento de un solo reportero se utilizó para desarrollar y validar inicialmente el ensayo basado en perlas que caracterizó la IgG o la IgM anti-Borrelia individualmente, ambas utilizando una etiqueta reportera fluorescente de ficoeritritina (PE) que emite señal en los espectros “naranjas”. Cualquier antígeno de Borrelia deseado puede acoplarse a las perlas y utilizarse para capturar y cuantificar la IgG o la IgM presentes en las muestras de suero. Se necesitan dos inmunoensayos separados para evaluar la reactividad de IgG e IgM frente a un antígeno determinado. (B) El sistema de doble reportero permitió el análisis simultáneo de muestras de suero para anticuerpos IgG e IgM contra cualquier antígeno individual de Borrelia en el mismo pocillo. Este enfoque utiliza el mismo anticuerpo de detección conjugado con PE para dirigirse a la IgM anti-Borrelia , pero reemplaza la detección de IgG de un sistema basado en PE al uso de un anticuerpo de detección primaria biotinilado y estreptavidina marcada con BV421 (un emisor “azul”) que necesita un paso de incubación adicional del sistema de detección de 30 minutos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Precisión intraensayoEl análisis de correlación de Spearman para tres antígenos representativos de Borrelia (Figura 2) demostró una reproducibilidad uniforme de los valores de IMF al detectar anticuerpos anti-Borrelia presentes en sueros humanos. Figura 2: Precisión intra-ensayo del ensayo Borrelia basado en perlas de doble reportero. El análisis de correlación de Spearman mostró una alta precisión intraensayo del ensayo de doble reportero cuando se utilizó un sistema de detección de PE para detectar anticuerpos IgM específicos de Borrelia (A) y un sistema de detección BV421 para detectar anticuerpos IgG específicos de Borrelia (B, C). Un total de 21 muestras de suero fueron analizadas por duplicado mediante un procedimiento semiautomatizado. En cada gráfico, las señales de MFI se trazaron entre sí y se analizaron mediante regresión lineal. Una curva lineal (x=y) mostrada como una línea discontinua roja indica señales MFI idénticas para los sistemas de detección. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Precisión entre ensayosSe observó una buena reproducibilidad ensayo a ensayo con el ensayo de doble reportero. Los gráficos de Levey-Jennings (Figura 3) con los valores de IMF de una muestra de control de calidad medida durante siete corridas independientes demostraron la alta precisión entre ensayos para todos los antígenos representativos. El coeficiente de variación porcentual promedio (CV% = desviación estándar/media × 100) de los cuatro antígenos representativos de Borrelia fue del 5,3%. Linealidad de diluciónDebido a que el ensayo original de un solo reportero y el nuevo ensayo de doble reportero emplean diferentes plataformas de citometría de flujo, comparamos las salidas de fluorescencia medianas del mismo inmunoensayo de antígeno entre los dos instrumentos de citometría de flujo (Figura 4). Las series de dilución de muestras proporcionaron curvas de dilución lineales para la evaluación de IgM e IgG, con un buen paralelismo de dosis-respuesta entre los instrumentos a lo largo de todo el rango de dilución evaluado (1:100-1:12.800). Figura 3: Precisión entre ensayos del ensayo Borrelia basado en perlas de doble reportero. Para la evaluación de la precisión entre ensayos, se analizó la respuesta de anticuerpos IgM (A) e IgG (B-D) específicos de Borrelia de una muestra de control de calidad en siete corridas independientes, en pocillos duplicados cada vez. Los ensayos se realizaron manualmente. Los valores de MFI se trazaron en un gráfico de Levey-Jennings. Una línea verde da la media de todos los valores. Dos líneas discontinuas rojas indican el rango de tolerancia de la precisión entre ensayos. Esto se calculó a partir del valor medio ± 2,5 veces la desviación estándar (2,5 DE). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 4: Linealidad de dilución del ensayo de Borrelia basado en perlas de doble reportero. A diluciones de muestra de 100 a 12.800 veces, las curvas de dilución para la detección de IgM (A) y la detección de IgG (B) fueron similares cuando se realizaron manualmente con el instrumento de un solo reportero y el instrumento de doble informador. En todas las diluciones analizadas, los valores de MFI fueron ligeramente más altos utilizando el instrumento de reportero único (símbolos rojos) que el instrumento de reportero dual (símbolos azules). Se muestran curvas de dilución para 2 antígenos representativos, y cada punto de dilución representa la medición promedio de pocillos por triplicado con desviación estándar (SD *) indicada por barras de error. Nota: Las SD pequeñas no son visibles a esta escala. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Materiales complementarios. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discussion

Este informe destaca el desarrollo de un inmunoensayo de Borrelia basado en dos perlas que determina de forma reproducible y sensible la inmunorreactividad anti-Borrelia en muestras de suero12. Las diversas especies patógenas de Borrelia que causan borreliosis de Lyme se pueden diferenciar por la heterogeneidad del antígeno específico de la variante 6,7,8,9. El ensayo multiplexado evalúa simultáneamente la inmunorreactividad anti-Borrelia mediada por IgG e IgM dentro del mismo pozo de reacción, conservando así los reactivos, la mano de obra y el material de muestra que de otro modo serían necesarios para realizar dos ensayos singleplex por separado. La comparación de las respuestas de IgM e IgG a lo largo del tiempo puede permitir un mejor seguimiento de la progresión de la enfermedad, ya que la seroconversión de IgM a IgG se produce después de la infección6.

El sistema de doble reportero utiliza dos sistemas de detección de anticuerpos diferentes 13,15. Los experimentos relacionados demostraron que no había reactividad cruzada detectable significativa entre los sistemas de detección anti-IgM y anti-IgG de Borrelia cuando ambas clases de anticuerpos se analizaron juntas en el mismo pozo de reacción12. Teniendo en cuenta la menor afinidad de unión de los anticuerpos IgM frente a los anticuerpos IgG16,17, elegimos un anticuerpo de detección conjugado con PE para la detección de IgM (el primer canal reportero del instrumento de doble reportero) porque el PE es uno de los fluoróforos emisores más fuertes utilizados habitualmente en inmunoensayos18. Para la evaluación de la IgG, se utilizó un anticuerpo de detección biotinilado que posteriormente se iluminó con estreptavidina conjugada con BV421 (el segundo canal reportero del instrumento)19. A pesar del paso de incubación adicional de 30 minutos en comparación con el sistema de un solo reportero, el sistema de doble reportero produce el doble de información por reacción. En general, el ensayo multiplexado de doble reportero requiere menos tiempo acumulado y entradas de material que la ejecución de dos ensayos de un solo reportero.

El alto rendimiento y la estabilidad del ensayo Borrelia multiplexado se ejemplificaron con una alta reproducibilidad en estudios de precisión intra e interensayo, y con la demostración de la linealidad de dilución y el paralelismo de dilución en una amplia gama de concentraciones de muestra para la evaluación de IgG e IgM. Observamos niveles de emisión de fluorescencia absoluta más altos para los mismos fluoróforos utilizando el instrumento de un solo canal en comparación con el sistema de doble canal (≈1,7× más alto con PE), atribuible a las diferencias en la óptica y los ajustes de calibración entre los dos instrumentos (Figura 4). No obstante, las curvas de emisión de fluorescencia con ambos fluoróforos se mantuvieron dentro del rango lineal de ambos instrumentos en los extremos de dilución de muestra alta y baja, y cualquier discrepancia en la fluorescencia absoluta medida no afectó la clasificación del estado de exposición a Borrelia . 12

Una de las principales ventajas de este ensayo múltiple de Borrelia basado en perlas es la facilidad con la que el ensayo puede modificarse o ampliarse para evaluar analitos diferentes o adicionales, por ejemplo, para detectar anticuerpos contra antígenos de otras especies de Borrelia . Los juegos de perlas magnéticas xMAP contienen diferentes combinaciones de colorantes que se pueden distinguir en el canal de clasificación del instrumento y, en teoría, se pueden implementar en ensayos multiplex que pueden evaluar simultáneamente hasta 500 analitos únicos dentro de la misma muestra. Mientras que el presente estudio destaca cuatro antígenos representativos de Borrelia para demostrar la funcionalidad y estabilidad del ensayo y para comparar el sistema de reportero único y doble, el ensayo final interroga ocho antígenos que, en conjunto, pueden identificar los cinco patógenos de Borrelia clínicamente relevantes que circulan por Europa y América del Norte12.

El rendimiento de alto rendimiento es posible utilizando placas de microtitulación estándar de 384 pocillos en un formato de ensayo semiautomatizado. La compatibilidad de ensayos e instrumentos con placas de 96 y 384 pocillos permite utilizar el ensayo múltiplex Borrelia como una herramienta de cribado eficaz para analizar rápidamente grandes conjuntos de muestras, como los estudios nacionales20. La realización manual del ensayo sigue siendo posible para conjuntos de muestras más pequeños que utilizan placas más pequeñas de 96 pocillos.

Las limitaciones del estudio incluyen la evaluación comparativa de solo unos pocos objetivos de inmunorreactividad de Borrelia en un pequeño número de muestras de suero humano. Sin embargo, el estudio original confirmó que el rendimiento del ensayo tanto para IgG como para IgM se mantuvo al analizar ocho antígenos de las cinco especies conocidas de Borrelia dentro de un conjunto de muestras más grande12. Además, el instrumento de doble reportero solo puede evaluar dos isotipos de anticuerpos simultáneamente dentro de cada reacción, por lo que el perfil completo del isotipo requeriría la realización de reacciones de ensayo adicionales13.

En conclusión, este informe detalla la fusión y conversión exitosa de inmunoensayos de un solo reportero basados en perlas en ensayos de doble reportero que pueden evaluar simultáneamente anticuerpos IgG e IgM patógenos específicos de Borrelia en muestras de suero humano. Este enfoque combinado ahorra tiempo total, material y mano de obra para generar el mismo volumen de datos que dos ensayos independientes de un solo informador. El ensayo multiplex se puede escalar desde un formato de placa de microtitulación de 96 pocillos hasta un formato de placa de microtitulación de 384 pocillos y se puede semiautomatizar mediante el uso de placas robóticas e instrumentación de manejo de líquidos, lo que lo hace adecuado para aplicaciones de alto rendimiento, como estudios de grandes poblaciones. Los sistemas de ensayo de doble reportero basados en perlas han demostrado previamente su utilidad para evaluar, por ejemplo, las respuestas inmunitarias a otros patógenos virales y bacterianos13,21, evaluar las respuestas alogénicas de anticuerpos contra los epítopos HLA en el trasplante de órganos22 y explorar los mecanismos de las enfermedades autoinmunes23. El presente informe detalla el uso de la tecnología multiplex para identificar la exposición a los patógenos de Borrelia que causan la enfermedad de Lyme, como ejemplo de cómo los laboratorios pueden adaptar este enfoque para explorar mecanismos inmunológicos complejos en diversas patologías.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este informe fue financiado por Luminex (Austin, TX). Los autores agradecen a Matthew Silverman PhD (Biomedical Publishing Solutions, Ciudad de Panamá, FL; mattsilver@yahoo.com) por su asistencia analítica y científica en la edición. Los autores también agradecen a Harald Klein y Christoph von Eichel-Streiber de tgcBIOMICS GmbH (Bingen, Alemania) por proporcionar los antígenos de Borrelia utilizados en el estudio. Se obtuvieron muestras de suero humano para la validación técnica de ensayos y el control de calidad de: 1) el Estudio de Prevalencia Multilocal y en Serie de Anticuerpos contra el SARS-CoV-2 en Alemania a través del Departamento de Epidemiología, Centro Helmholtz de Investigación de Infecciones, Braunschweig, Alemania; y 2)el Departamento de Neurología, Sächsisches Krankenhaus Rodewisch (Rodewisch, Alemania). La aprobación para el uso de muestras humanas fue otorgada por el Comité de Ética de la Facultad de Medicina de Hannover, Alemania (9086_BO_S_2020).

Materials

Antibodies and Detection Reagents Source Catalog Number
Biotinylated Goat Anti-Human IgG Jackson ImmunoResearch (Dianova) 109-066-098 
Brilliant Violet 421-Streptavidin BD Biosciences 563259
Donkey Anti-Human IgM  Jackson ImmunoResearch (Dianova) 709-116-073
Borrelia Antigens tgcBIOMICS (Bingen, Germany)
Coupling Reagents
1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride (EDC) Thermo Scientific Pierce 77149 ProteoChem (100 mg)
10x PBS Fisher Scientific BP399-4
BSA Carl Roth T844.3
MES (2-ethanesulfonic acid; zwitterionic buffer) Carl Roth 4256.2
Na2HPO4 Carl Roth 4984.1
ProClin300 Sigma 48914-U
Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) Thermo Scientific Pierce 24510 (500 mg)
Triton X-100 Thermo Scientific 85111
Instrumentation and Ancillary Lab Supplies Source
384-well plate Corning, Cat# 3570
96-well deep-well plates ThermoFisher Scientific, Cat# 95040450
96-well half-area plates  Corning, Cat# 3690
BioTek 405 TS Plate Washer BioTek Instruments/Agilent Technologies, Santa Clara, CA 
BioTek MultiFlo FX Plate Washer BioTek Instruments/Agilent Technologies, Santa Clara, CA 
DynaMag Spin Magnet (for isolating beads in microcentrifuge tubes) ThermoFisher, Cat# 12320D
Flexmap 3D (two-channel, single-reporter instrument) Luminex Corp., Austin, TX
KingFisher Magnetic Particle Processor (for isolating beads in 96-well plates)  ThermoFisher, Cat# A31508
MagPlex Microspheres (magnetic, fluorescent, 6.5-µm-diameter beads) Luminex Corp., Austin, TX
SmartBlock Plates Eppendorf, Cat# 5363000039
ThermoMixer C Eppendorf, Cat# 5382000015
ThermoTop Eppendorf, Cat# 5308000003
xMAP Intelliflex (three-channel, dual-reporter instrument) Luminex Corp., Austin, TX
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Referencias

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Häring, J., Michel, T., Becker, M., Junker, D., Tchitchagua, T., Leschnik, O., Lange, B., Castell, S., Krause, G., Strengert, M., Dulovic, A., Schneiderhan-Marra, N. Simultaneous Detection of Different Antibody Classes in a Multiplexed Serological Test. J. Vis. Exp. (197), e65323, doi:10.3791/65323 (2023).
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