फ्लो साइटोमेट्री में मुआवजा नियंत्रण के रूप में उपयोग के लिए पोर्फिरीन-संशोधित मोती
Summary
प्रोटोकॉल बताता है कि फ्लो साइटोमेट्री के लिए पोर्फिरीन-आधारित मुआवजा मोती पोर्फिरीन टीसीपीपी और एमाइड युग्मन अभिकर्मक ईडीसी के साथ अमाइन-कार्यात्मक पॉलीस्टाइनिन मोतियों की प्रतिक्रिया से कैसे तैयार किए जाते हैं। पार्टिकुलेट बायप्रोडक्ट्स को कम करने के लिए एक निस्पंदन प्रक्रिया का उपयोग किया जाता है।
Abstract
फ्लो साइटोमेट्री फ्लोरेसेंस माप के आधार पर विभिन्न सेल आबादी को तेजी से चिह्नित और निर्धारित कर सकती है। कोशिकाओं को पहले एक या एक से अधिक फ्लोरोसेंट अभिकर्मकों से दाग दिया जाता है, प्रत्येक को एक अलग फ्लोरोसेंट अणु (फ्लोरोफोरे) के साथ कार्यात्मक किया जाता है जो कोशिकाओं को उनकी फेनोटाइपिक विशेषताओं, जैसे सेल सतह एंटीजन अभिव्यक्ति के आधार पर चुनिंदा रूप से बांधता है। कोशिकाओं से बंधे प्रत्येक अभिकर्मक से प्रतिदीप्ति की तीव्रता को प्रवाह साइटोमीटर पर चैनलों का उपयोग करके मापा जा सकता है जो तरंग दैर्ध्य की एक निर्दिष्ट सीमा का पता लगाते हैं। जब कई फ्लोरोफोर का उपयोग किया जाता है, तो अलग-अलग फ्लोरोफोर से प्रकाश अक्सर अवांछित पहचान चैनलों में फैल जाता है, जिसके लिए मुआवजे नामक प्रक्रिया में प्रतिदीप्ति तीव्रता डेटा में सुधार की आवश्यकता होती है।
मुआवजा नियंत्रण कण, आमतौर पर एक एकल फ्लोरोफोरे से बंधे बहुलक मोती, सेल लेबलिंग प्रयोग में उपयोग किए जाने वाले प्रत्येक फ्लोरोफोर े के लिए आवश्यक होते हैं। फ्लो साइटोमीटर से मुआवजा कणों से डेटा का उपयोग प्रतिदीप्ति तीव्रता माप में सुधार लागू करने के लिए किया जाता है। यह प्रोटोकॉल फ्लोरोसेंट अभिकर्मक मेसो-टेट्रा (4-कार्बोक्सीफिनाइल) पोर्फिन (टीसीपीपी) और फ्लो साइटोमेट्री मुआवजे में उनके आवेदन के साथ सहसंयोजक रूप से कार्यात्मक पॉलीस्टाइनिन मुआवजा मोतियों की तैयारी और शुद्धि का वर्णन करता है। इस काम में, अमाइन-कार्यात्मक पॉलीस्टाइनिन मोतियों को टीसीपीपी और एमाइड युग्मन अभिकर्मक ईडीसी (एन-(3-डाइमिथाइलएमिनोप्रोपिल)-एन’-एथिलकार्बोडिमाइड हाइड्रोक्लोराइड) के साथ पीएच 6 पर और आंदोलन के साथ 16 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर इलाज किया गया था। टीसीपीपी मोतियों को सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा अलग किया गया था और भंडारण के लिए पीएच 7 बफर में फिर से निलंबित कर दिया गया था। टीसीपीपी से संबंधित कणों को एक उपोत्पाद के रूप में देखा गया था। वैकल्पिक निस्पंदन प्रोटोकॉल का उपयोग करके इन कणों की संख्या को कम किया जा सकता है। परिणामी टीसीपीपी मोतियों को कई फ्लोरोफोरे के साथ लेबल किए गए मानव थूक कोशिकाओं के साथ प्रयोगों में मुआवजे के लिए प्रवाह साइटोमीटर पर सफलतापूर्वक उपयोग किया गया था। 300 दिनों के लिए रेफ्रिजरेटर में भंडारण के बाद टीसीपीपी मोती स्थिर साबित हुए।
Introduction
पोर्फिरीन अपने प्रतिदीप्ति और ट्यूमर-लक्ष्यीकरणगुणों 1,2,3 के कारण बायोमेडिकल क्षेत्र में कई वर्षों से रुचि रखते हैं। फोटोडायनामिक थेरेपी (पीडीटी) और सोनोडायनामिक थेरेपी (एसडीटी) जैसे चिकित्सीय अनुप्रयोगों में कैंसर रोगी को पोर्फिरीन का प्रणालीगत प्रशासन, ट्यूमर में दवा का संचय और एक विशिष्ट तरंग दैर्ध्य या अल्ट्रासाउंड के लेजर प्रकाश के लिए ट्यूमर के स्थानीय जोखिम शामिल हैं। लेजर प्रकाश या अल्ट्रासाउंड के संपर्क में पोर्फिरीन द्वारा प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों की उत्पत्ति होती है और बाद में कोशिका मृत्यु 4,5 होती है। फोटोडायनामिक निदान (पीडीडी) में, पोर्फिरीन प्रतिदीप्ति का उपयोग कैंसर कोशिकाओं कोसामान्य कोशिकाओं से अलग करने के लिए किया जाता है। इस संदर्भ में, प्रोटोपोर्फिरीन IX, एक प्राकृतिक फ्लोरोसेंट पोर्फिरीन जो अपने अग्रदूत, 5-एमिनोलेवुलिनिक एसिड (5-एएलए) के प्रणालीगत या स्थानीय इंजेक्शन पर ट्यूमर में जमा होता है, का उपयोग गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल स्ट्रोमल ट्यूमर, मूत्राशय के कैंसर और मस्तिष्क कैंसर 7,8 की पहचान करने के लिए किया जाता है। हाल ही में, मल्टीपल मायलोमा9 में न्यूनतम अवशिष्ट बीमारी का पता लगाने के लिए एक दृष्टिकोण के रूप में 5-एएलए उपचार का पता लगाया गया था। हमारी प्रयोगशाला मानव थूक के नमूनों में फेफड़ों के कैंसर कोशिकाओं और कैंसर से जुड़ी कोशिकाओं को चुनिंदा रूप से दागने की क्षमता के लिए टेट्रारिल पोर्फिरीन टीसीपीपी (5,10,15,20-टेट्राकिस-(4-कार्बोक्सीफिनाइल)-21,23एच-पोर्फिन) का उपयोग कर रही है, जो एक ऐसा गुण है जिसका उपयोग स्लाइड-आधारित और फ्लो साइटोमेट्रिक डायग्नोस्टिक परख10 में किया गया है।
कुछ पोर्फिरीन द्विक्रियाशील हैं कि उन्हें चिकित्सीय और नैदानिक एजेंटों 2,11 के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। बायोमेडिकल अनुसंधान में, इस तरह के द्विक्रियाशील पोर्फिरीन का उपयोग यह मूल्यांकन करने के लिए किया जाता है कि कैंसर कोशिकाओं को चुनिंदा रूप से लक्षित करने और मारने की उनकी क्षमता उनकी संरचना का एक कार्य है और साथ ही यह अन्य यौगिकों 12,13,14,15,16 की उपस्थिति से कैसे प्रभावित होता है। पोर्फिरीन के सेलुलर उत्थान और उनके साइटोटॉक्सिसिटी दोनों को उच्च-थ्रूपुट तरीके से फ्लो साइटोमेट्रिक प्लेटफॉर्म पर मापा जा सकता है। फ्लोरोसेंट पोर्फिरीन के अवशोषण और उत्सर्जन स्पेक्ट्रा जटिल हैं, लेकिन अधिकांश प्रवाह साइटोमेट्रिक प्लेटफॉर्म उन्हें सही ढंग से पहचानने के लिए सुसज्जित हैं। फ्लोरोसेंट पोर्फिरीन के अवशोषण स्पेक्ट्रम को 380-500 एनएम रेंज में एक मजबूत अवशोषण बैंड की विशेषता है, जिसे सोरेट बैंड के रूप में जाना जाता है। दो से चार कमजोर अवशोषण बैंड आमतौर पर 500-750 एनएम रेंज (क्यू बैंड) 17 में देखे जाते हैं। एक नीला 488 एनएम लेजर, जो अधिकांश प्रवाह साइटोमीटर में मौजूद है, या एक बैंगनी लेजर (405 एनएम) पोर्फिरीन को उत्तेजित करने के लिए उपयुक्त तरंग दैर्ध्य का प्रकाश उत्पन्न कर सकता है। पोर्फिरीन का उत्सर्जन स्पेक्ट्रा आमतौर पर 600-800 एनएम रेंज18 में चोटियों को प्रदर्शित करता है, जिसके परिणामस्वरूप फ्लोरेसिन आइसोथियोसाइनेट या फाइकोएरिथ्रिन (पीई) फ्लोरोफोरे के साथ बहुत कम वर्णक्रमीय ओवरलैप होता है, लेकिन अन्य अक्सर इस्तेमाल किए जाने वाले फ्लोरोफोरे के साथ काफी ओवरलैप होता है, जैसे कि एलोफिकोसाइनिन (एपीसी), साथ ही साथ टेंडम फ्लोरोफोरेस, जैसे पीई-साइ 5 और अन्य। इसलिए, बहु-रंग प्रवाह साइटोमेट्री परख में पोर्फिरीन का उपयोग करते समय, पोर्फिरीन के प्रतिदीप्ति को मापने के लिए निर्दिष्ट चैनलों के अलावा अन्य चैनलों में प्रतिदीप्ति के स्पिलओवर को पर्याप्त रूप से सही करने के लिए एकल-फ्लोरोफोर नियंत्रण आवश्यक हैं।
आदर्श रूप से, फ्लोरोफोर के पैनल के लिए स्पिलओवर मैट्रिक्स की गणना करने के लिए उपयोग किए जाने वाले एकल-फ्लोरोफोर नियंत्रण (जिसे “मुआवजा नियंत्रण” भी कहा जाता है) में नमूने के समान सेल प्रकार (ओं) शामिल होना चाहिए। हालांकि, इस उद्देश्य के लिए नमूने का उपयोग करना इष्टतम नहीं है यदि शुरू करने के लिए बहुत कम नमूना है या यदि नमूने के भीतर लक्षित आबादी बहुत छोटी है (उदाहरण के लिए, यदि कोई बीमारी के शुरुआती चरणों में न्यूनतम अवशिष्ट रोग या कैंसर कोशिकाओं को देखना चाहता है)। कोशिकाओं का एक उपयोगी विकल्प उसी फ्लोरोफोरे के साथ युग्मित मोती है जिसका उपयोग नमूने का विश्लेषण करने के लिए किया जाता है। ऐसे कई मोती व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं; इन मोतियों को या तो वांछित फ्लोरोफोरे (प्रीलेबल फ्लोरोफोरे-विशिष्ट मोती) 19,20 के साथ प्रीलेबल किया जाता है, या एक फ्लोरोसेंटली लेबल एंटीबॉडी को उनसे जोड़ा जा सकता है (एंटीबॉडी कैप्चर बीड्स) 20,21। जबकि वाणिज्यिक क्षतिपूर्ति मोती कई फ्लोरोफोरे के लिए उपलब्ध हैं, ऐसे मोती पोर्फिरीन के लिए अनुपलब्ध हैं, बुनियादी और नैदानिक अनुसंधान में उनके बढ़ते उपयोग के बावजूद।
नमूना संरक्षण और उचित आकार के सकारात्मक बनाम नकारात्मक आबादी के अलावा, मुआवजा नियंत्रण के रूप में मोतियों का उपयोग करने के अन्य फायदे तैयारी में आसानी, कम पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति, और समयके साथ उत्कृष्ट स्थिरता हैं। क्षतिपूर्ति नियंत्रण के रूप में मोतियों का उपयोग करने का संभावित नुकसान यह है कि मोतियों पर कैप्चर किए गए फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी का उत्सर्जन स्पेक्ट्रम कोशिकाओं को लेबल करने के लिए उपयोग किए जाने वाले उसी एंटीबॉडी से भिन्न हो सकता है। वर्णक्रमीय प्रवाह साइटोमीटर20 का उपयोग करते समय यह विशिष्ट महत्व का हो सकता है। इसलिए, मुआवजा नियंत्रण के रूप में मोतियों के विकास को प्रवाह साइटोमीटर पर किया जाना चाहिए जिसका उपयोग परख के लिए किया जाएगा जिसके लिए मोती विकसित किए गए हैं। इसके अलावा, मोतियों के विकास में एक ही फ्लोरोसेंट स्टेनिंग अभिकर्मक के साथ लेबल की गई कोशिकाओं के साथ तुलना शामिल करने की आवश्यकता होती है।
यहां, हम टीसीपीपी अमाइन-कार्यात्मक पॉलीस्टाइनिन मुआवजा मोतियों की तैयारी का वर्णन करते हैं, जिनकी पहचान चैनल में औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता थूक में टीसीपीपी-लेबल कोशिकाओं के बराबर थी, और प्रवाह साइटोमेट्री के लिए मुआवजा नियंत्रण के रूप में उनका उपयोग किया गया था। समकक्ष, गैर-कार्यात्मक मोतियों की ऑटोफ्लोरेसेंस नकारात्मक प्रतिदीप्ति मुआवजा नियंत्रण के रूप में उनके उपयोग के लिए पर्याप्त रूप से कम थी। इसके अलावा, इन मोतियों ने लगभग 1 वर्ष तक भंडारण में स्थिरता का प्रदर्शन किया।
Protocol
Representative Results
Discussion
कैंसर निदान और चिकित्सीय2 में पोर्फिरीन के कई अनुप्रयोगों के बावजूद, प्राथमिक मानव ऊतकों में कैंसर बनाम गैर-कैंसर कोशिका आबादी की पहचान के लिए प्रवाह साइटोमेट्रिक अभिकर्मक के रूप में उनके सं…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम डेविड रोड्रिग्ज को आंकड़ा तैयार करने और प्रेसिजन पैथोलॉजी सर्विसेज (सैन एंटोनियो, टेक्सास) के साथ सहायता के लिए अपने नेवियस ईएक्स फ्लो साइटोमीटर के उपयोग के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं।
Materials
| Amber plastic vials, 2 mL, U- bottom, polypropylene | Research Products International | ZC1028-500 | |
| Amine-funtionalized polystyrene divinylbenzene crosslinked (PS/DVB) beads, 10.6 μm diameter, 2.5% w/v aqueous suspension, 3.82 x 107 beads/mL, 7.11 x 1011 amine groups/ bead | Spherotech | APX-100-10 | Diameter spec. 8.0-12.9 um, suspension 2.5% w/v 3.82 x 107 beads/mL, 7.11 x 1011 amine groups/ bead |
| Conical tubes, 50 mL, Falcon | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Centrifuge | with appropriate rotor | ||
| Disposable polystyrene bottle with cap, 150 mL | Fisher Scientific | 09-761-140 | |
| EDC (N- (3- dimethylaminopropyl)- N'- ethylcarbodiimide hydrochloride), ≥98% | Sigma | 03450-1G | CAS No: 25952-53-8 |
| FlowJo Single Cell Analysis Software (v10.6.1) | BD | ||
| Glass coverslips, 22 x 22 mm | Fisher Scientific | 12-540-BP | |
| Glass fiber syringe filters (Finneran, 5 µm, 13 mm diameter) | Thomas Scientific | 1190M60 | |
| Glass microscope slides, 275 x 75 x 1 mm | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Fisher Scientific | 14-175-095 | |
| Isopropanol, ACS grade | Fisher Scientific | AC423830010 | |
| Mechanical pipette, 1 channel, 100-1000 uL with tips | Eppendorf | 3123000918 | |
| MES (22- (N- mopholino)- N'- ethanesulfonic acid, hemisodium salt | Sigma | M0164 | CAS No: 117961-21-4 |
| Navios EX flow cytometer | Beckman Coulter | ||
| Olympus BX-40 microscope with DP73 camera and 40X objective with cellSens software | Olympus | or similar | |
| Pasteur pipettes, glass, 5.75" | Fisher Scientific | 13-678-6B | |
| pH meter (UB 10 Ultra Basic) | Denver Instruments | ||
| Pipette controller (Drummond) | Pipete.com | DP101 | |
| Plastic Syringe, 5 mL | Fisher Scientific | 14955452 | |
| Polystyrene Particles (non-functionalized), SPHERO, 2.5% w/v, 8.0-12.9 µm | Spherotech | PP-100-10 | |
| Polypropylene tubes, 15mL, conical | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| Polystyrene tubes, round bottom | Fisher Scientific | 14-959-2A | |
| Rainbow Beads (Spherotech URCP-50-2K) | Fisher Scientific | NC9207381 | |
| Serological pipettes, disposable – 10 mL | Fisher Scientific | 07-200-574 | |
| Serological pipettes, disposable – 25 mL | Fisher Scientific | 07-200-576 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma | S6014 | CAS No: 144-55-8 |
| TCPP (meso-tetra(4-carboxyphenyl)porphine) Frontier Scientific | Fisher Scientific | 50-393-68 | CAS No: 14609-54-2 |
| Tecan Spark Plate Reader (or similar) | Tecan Life Sciences | ||
| Tube revolver/rotator | Thermo Fisher | 88881001 | |
| Vortex mixer | Fisher Scientific | 2215365 |
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