Alkali Yanığı ile Kornea Neovaskülarizasyonu için Bir Fare Modeli

Deneysel prosedürler ve ötenazi de dahil olmak üzere tüm hayvan çalışmaları, Baylor Tıp Fakültesi’ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından AN-8790 Protokol Numarası ile onaylandı. 1. 1 N NaOH hazırlanması 15 mL’lik bir santrifüj tüpüne 4 mL steril deiyonize su ekleyin. 400 mg sodyum hidroksit (NaOH) tartın ve tüpe dikkatlice ekleyin. Çözeltiyi bir cam çubuk kullanarak yavaşça karıştırarak NaOH’yi çözün. Tüpe steril deiyonize su ekleyerek hacmi 10 mL’ye çıkarın ve tüpü hafifçe yukarı ve aşağı çevirerek tekrar karıştırın. Kapağı sıkıca kapatın ve çözeltiyi oda sıcaklığında saklayın. Taze çözeltiyi her ay hazırlayın, çünkü NaOH çözeltisinin konsantrasyonu, havadaki karbondioksiti emen çözelti tarafından azaltılabilir. Kullanmadan önce daima NaOH çözeltisini hafifçe karıştırın.DİKKAT: Çözeltiyi kimyasal bir başlık içinde hazırlayın ve uygun kişisel koruyucu ekipman (KKD) kullanın. 2.% 4 paraformaldehit (PFA) çözeltisinin hazırlanması Bir cam behere 30 mL 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ekleyin. 4 g paraformaldehit (PFA) tartın ve behere ekleyin. Beheri karıştırarak 60 °C’de sıcak bir tabakta tutun. Çözelti temizlenene kadar pH’ı yükseltmek için 1 N NaOH çözeltisini damla damla ekleyin. 1 N hidroklorik asit (HCl) kullanarak pH’ı kontrol edin ve 7,4’e ayarlayın. Son hacmi 1x PBS ile 50 mL’ye ayarlayın. Çözeltiyi soğutun ve süzün. Çözeltiyi 4 °C’de saklayın.DİKKAT: Uygun KKD giyerken çözeltiyi çeker ocakta hazırlayın. 3. Ketamin / ksilazin kokteylinin hazırlanması 9.4 mL saline 0.8 mL ketamin (stok konsantrasyonu: 100 mg/mL) ve 0.16 mL ksilazin (stok konsantrasyonu: 100 mg/mL) ekleyerek ketamin/ksilazin kokteylini hazırlayın. Kokteyli steril enjeksiyon şişelerinde oda sıcaklığında (RT) saklayın. 4. Fare korneasında alkali yanığı Ağrının giderilmesi için işlemden 30 dakika önce deri altına meloksikam (4-6 mg / kg vücut ağırlığı) enjekte edin. Fareleri (C57BL / 6J, 6-8 haftalık, erkek) ketamin / ksilazin kokteylinin (Ketamin 80 mg / kg ve Xylazine 16 mg / kg vücut ağırlığı) bir ip enjeksiyonu kullanarak uyuşturun. Farenin ayak parmaklarını sıkıştırarak refleks tepkisini (pedal çekme) kontrol edin ve refleksin olmadığını onaylayın. Bir gözün kornea yüzeyine bir damla topikal anestezik,% 0.5 proparakain ve diğer göze bir damla suni gözyaşı uygulayın. 2 mm’lik bir biyopsi zımbası kullanarak Whatman filtre kağıdı disklerini delin. Temiz bir Petri kabına 2 μL 1N NaOH ekleyin. 2 mm’lik filtre kağıdı diskini 1 N NaOH damlasının üzerine koyun ve 15 saniye bekletin. Filtre kağıdını forseps ile alın ve filtre kağıdını korneanın ortasındaki proparakain ile tedavi edilmiş göze 30 saniye boyunca uygulayın.NOT: Filtre kağıdı sadece korneanın ortasına temas etmelidir ve filtre kağıdının hareket ettirilmesi bitişik dokularda yanıklara neden olabileceğinden, yerleştirildikten sonra filtre kağıdının hareket etmemesine özen gösterilmelidir. Steril bir şırıngada 20 mL steril salin solüsyonu ile yıkayarak gözü yıkayın.NOT: Korneaya veya çevresindeki dokuya daha fazla zarar vermemek için korneanın konjonktival kese ile birlikte iyice yıkanmasına özen gösterilmelidir. Konjonktival kesenin yıkanması semblefaronu daha da önleyecektir. Tek kullanımlık yumuşak mendiller kullanarak fazla tuzlu suyu gözlerden ve çevresinden nazikçe silin. Daha sonra, fareleri ambulatuvar olana kadar ılık bir ısıtma yastığı üzerinde bir kurtarma kafesinde tutun.NOT: Fareler, alkali yanığından sonra 3 gün boyunca günlük olarak izlenir. Ağrı veya stres belirtileri görülürse, meloksikam (4-6 mg / kg vücut ağırlığı) deri altına uygulanır. 5. Neovaskülarizasyon ve opaklığın incelenmesi ve değerlendirilmesi Anestezi uygulanmış farelerde, yanıktan sonraki 10. günde gözleri diseksiyon mikroskobu altında inceleyin ve opaklığı ve neovaskülarizasyonu puanlamak için diseksiyon kapsamına bağlı bir kamera kullanarak görüntüler elde edin.NOT: Kamera takılıyken normal bir diseksiyon kapsamı yeterlidir. Korneayı diseksiyon mikroskobu ile gözlemlerken, yanıktan sonraki opaklığı aşağıdaki ölçek12’ye göre puanlayın:0 = Opaklık yok; korneayı temizle1 = Hafif opaklık; iris ve öğrenci bölgelerinde hafif bulanıklık; iris ve göz bebeği kolayca görülebilir2 = Orta derecede opaklık; iris ve göz bebeği zar zor görülebilir3 = Şiddetli opaklık; iris veya göz bebeği görünmüyor4 = Opak kornea; iris ve göz bebeği görünmüyor Korneayı diseksiyon mikroskobu ile gözlemlerken, CoNV’yi aşağıdaki ölçek12’ye göre puanlayın:0 = Neovaskülarizasyon yok; Limbus’tan yeni damar yok1 = Hafif neovaskülarizasyon; Limbustan kaynaklanan yeni damarlar2 = Orta derecede neovaskülarizasyon; Kan damarları limbustan kaynaklanır ve korneanın merkezine doğru büyür3 = Şiddetli neovaskülarizasyon; Limbustan kaynaklanan ve korneanın merkezine ulaşan ve/veya geçen kan damarları Alkali yanığı ve sağlıklı göz grupları arasındaki opaklık ve neovaskülarizasyon skorlarını istatistiksel olarak karşılaştırmak için bir Öğrenci t-testi kullanın. Fareleri 10. günde, solunum durduktan 1 dakika sonrasına kadar% 5’te izofluran maruziyeti ile ötenazi yapın, ardından servikal çıkık yapın ve düz montajlı görüntüleme için korneaları toplayın. 6. Optik koherens tomografi (OCT) görüntüleme Yanıktan sonraki 10. günde anestezi uygulanmış farelerde gözlerin ön segmentinin OCT görüntülerini alın. 30° görüş alanı ve 0 IR yoğunluğu ile IR + OCT modunu kullanarak OCT görüntü alımını hacim taraması olarak gerçekleştirin. ImageJ yazılımını kullanarak korneaların kalınlığını ölçün. Kalınlığı ölçmek için, merkezi korneadaki ön ve arka yüzeyler arasında düz bir çizgi oluşturmak için ImageJ yazılımındaki Çizgi Seçimi aracını kullanın. Değerleri veri penceresine aktarmak için yazılım araçlarında Analiz Et > Ölç’e tıklayın. Değerleri bir elektronik tablo dosyasına kopyalayın ve bir Öğrenci t-testi kullanarak alkali yanığı ve sağlıklı göz grupları arasındaki kornea kalınlığını istatistiksel olarak karşılaştırın.NOT: Korneanın kalınlığı, kornea ön yüzeyindeki bir noktadan kornea merkezindeki arka kornea yüzeyine en yakın noktaya olan mesafedir. 7. Düz monteli kornealarda CoNV için immün boyama Alkali yanığından sonraki 10. günde farelere ötenazi yapın ve künt diseksiyonla gözleri enüklee edin. Başparmak ve işaret parmaklarını kullanarak göz kapaklarını ayırın ve forsepsleri göz küresinin altına yerleştirin. Forsepsleri kapatın ve göz küresini yavaşça yörüngeden çekin. Gözbebeklerini 1x PBS’ye yerleştirin. Her göz küresi için, önce limbus bölgesinin altında 30 G’lık bir iğne kullanarak bir kesi yaparak korneayı göz küresinden çıkarın. Kesi başlangıç noktası olacak şekilde kornea mikro makası kullanarak limbus bölgesini kesin ve kornea ile limbusu küreden yavaşça ayırın. İrisi çıkarmak için ince bir boya fırçası kullanarak korneaları nazikçe temizleyin. Korneaları 1 saat boyunca% 4 paraformaldehit içinde sabitleyin. Korneaları oda sıcaklığında (RT) 1x PBS’de her biri 20 dakika boyunca üç kez yıkayın. RT’de 1 saat boyunca bir bloke edici tamponda (% 0.1 Triton-X 100 ve% 5 sığır serum albümini [BSA] ile desteklenmiş 1x PBS) inkübe edin. Korneaları primer antikorlar içeren bir antikor çözeltisine aktarın. Antikor solüsyonunu %1 BSA, %0.1 Triton-X 100, Dylight550-konjuge anti-CD31 mAb (1:100) ve Alexa Fluor488-konjuge anti-LYVE-1 mAb (1:100) ile takviye edilmiş 1x PBS’de hazırlayın. 4 °C’de 3 gün inkübe edin. Korneaları 1x PBS’de her biri 20 dakika boyunca üç kez yıkayın. Karanlıkta 5 dakika boyunca Hoechst boyama solüsyonu (1:1.000) kullanarak çekirdekleri boyayın. Korneaları radyal kesimlerle düzleştirin ve montaj ortamı ve lameller kullanarak önceden temizlenmiş bir cam kızak üzerine monte edin. Lamelleri şeffaf oje ile kapatın ve konfokal mikroskopi ile analiz edilmeden önce slaytları gece boyunca karanlıkta kurutun. Düz monte edilmiş korneaları, tek tek Z-yığını görüntülerini dikerek konfokal mikroskopi kullanarak görüntüleyin; Rezonanssız galvano tarayıcılarda 10x objektif, 488 nm ve 561 nm lazerler ve dilim başına 512 piksel x 512 piksel çözünürlük kullanın. ImageJ yazılımını kullanarak CD31+ kan ve LYVE-1+ lenf damarlarının yoğunluğunu ölçün. Vasküler yoğunluğu belirlemek için konfokal görüntüleri 8 bitlik bir görüntüye dönüştürün. Eklentilerden Vasküler Yoğunluk’u seçin. Görüntüde ilgilendiğiniz bölgeyi seçin ve Tamam’a tıklayın. Ölçümler yeni bir veri penceresinde açılacaktır. Değerleri bir elektronik tablo dosyasına kopyalayın ve bir Öğrenci t-testi kullanarak alkali yanığı ile sağlıklı göz grupları arasındaki vasküler yoğunluğu istatistiksel olarak karşılaştırın.NOT: Trombosit endotel hücre adezyon molekülü-1 (PECAM-1) olarak da adlandırılan CD31, anjiyogenezde yer alan bir hücre adezyon molekülüdür ve erken ve olgun kan damarlarının endotel hücrelerinde yüksek oranda eksprese edilir13. LYVE-1 (lenfatik damar endotelyal hyaluronan reseptörü-1), lenfatik endotel hücreleri üzerinde bir hücre yüzeyi belirtecidir ve bir lenfanjiyogenez belirteciolarak kullanılabilir 14.