Мышиная модель неоваскуляризации роговицы с помощью щелочного ожога

Все работы с животными, включая экспериментальные процедуры и эвтаназию, были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных (IACUC) в Медицинском колледже Бэйлора под номером протокола AN-8790. 1. Приготовление 1 Н NaOH Добавьте 4 мл стерильной деионизированной воды в центрифужную пробирку объемом 15 мл. Взвесьте 400 мг гидроксида натрия (NaOH) и осторожно добавьте в пробирку. Растворите NaOH, медленно перемешивая раствор с помощью стеклянной палочки. Доведите объем до 10 мл, добавив в пробирку стерильную деионизированную воду, и снова перемешайте, осторожно переворачивая пробирку вверх и вниз. Плотно закройте крышку, и храните раствор при комнатной температуре. Готовьте свежий раствор каждый месяц, потому что концентрация раствора NaOH может быть снижена за счет поглощения раствором углекислого газа из воздуха. Всегда аккуратно перемешивайте раствор NaOH перед использованием.ВНИМАНИЕ: Приготовьте раствор внутри химического колпака и наденьте соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ). 2. Приготовление 4% раствора параформальдегида (PFA) Добавьте 30 мл 1x фосфатно-солевого буфера (PBS) в стеклянный стакан. Отвесьте 4 г параформальдегида (PFA) и добавьте его в стакан. Держите стакан на горячей плите при температуре 60 °C, помешивая. Добавьте по каплям раствор NaOH 1 N, чтобы повысить pH до тех пор, пока раствор не станет прозрачным. Проверьте и отрегулируйте рН до 7,4 с помощью 1 Н соляной кислоты (HCl). Отрегулируйте окончательный объем до 50 мл с помощью 1x PBS. Остудить и процедить раствор. Хранить раствор при температуре 4 °C.ВНИМАНИЕ: Приготовьте раствор в вытяжном шкафу, надев соответствующие СИЗ. 3. Приготовление коктейля кетамин/ксилазин Приготовьте коктейль кетамин/ксилазин, добавив 0,8 мл кетамина (концентрация бульона: 100 мг/мл) и 0,16 мл ксилазина (концентрация бульона: 100 мг/мл) к 9,4 мл физиологического раствора. Храните коктейль в стерильных флаконах для инъекций при комнатной температуре (RT). 4. Ожог щелочью роговицы мыши Ввести мелоксикам (4-6 мг/кг массы тела) подкожно за 30 мин до процедуры для облегчения боли. Обезболивайте мышей (C57BL/6J, 6-8-недельный возраст, самец) с помощью внутривенной инъекции коктейля кетамин/ксилазин (кетамин 80 мг/кг и ксилазин 16 мг/кг массы тела). Проверьте рефлекторную реакцию (отвод педали), зажав пальцы мыши, и подтвердите отсутствие рефлекса. Нанесите одну каплю местного анестетика, 0,5% пропаракаина, на поверхность роговицы одного глаза и каплю искусственной слезы на другой глаз. С помощью биопсийного пуансона диаметром 2 мм выбейте диски из ватмана из фильтровальной бумаги. Добавьте 2 мкл 1N NaOH в чистую чашку Петри. Поместите диск из фильтровальной бумаги диаметром 2 мм на каплю NaOH 1 N и дайте ему впитаться в течение 15 секунд. Возьмите фильтровальную бумагу щипцами и приложите фильтровальную бумагу к обработанному пропаракаином глазу в центре роговицы на 30 с.ПРИМЕЧАНИЕ: Фильтровальная бумага должна касаться только центра роговицы, и необходимо соблюдать осторожность, чтобы избежать смещения фильтровальной бумаги после размещения, так как перемещение фильтровальной бумаги может вызвать ожоги прилегающих тканей. Промыть глаз путем промывания 20 мл стерильного физиологического раствора в стерильном шприце.ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимо следить за тем, чтобы роговица вместе с конъюнктивальным мешком была тщательно промыта, чтобы предотвратить дальнейшее повреждение роговицы или окружающих тканей. Промывание конъюнктивального мешка еще больше предотвратит симблефарон. Аккуратно сотрите излишки физраствора с глаз и прилегающей области одноразовыми мягкими салфетками. После этого держите мышей в клетке для восстановления на теплой грелке до тех пор, пока они не станут амбулаторными.ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши наблюдаются ежедневно после ожога щелочью в течение 3 дней. Если наблюдаются симптомы боли или стресса, мелоксикам (4-6 мг/кг массы тела) вводят подкожно. 5. Обследование и оценка неоваскуляризации и помутнения У мышей, находящихся под наркозом, осмотрите глаза под диссекционным микроскопом на 10-й день после ожога и получите изображения с помощью камеры, прикрепленной к эндоскопу, чтобы оценить помутнение и неоваскуляризацию.ПРИМЕЧАНИЕ: Достаточно обычного эндоскопа для вскрытия с прикрепленной камерой. Наблюдая за роговицей через диссекционный микроскоп, оценивайте помутнение после ожога по следующей шкале12:0 = непрозрачность отсутствует; прозрачная роговица1 = умеренная непрозрачность; незначительная мутность в области радужки и зрачка; радужная оболочка и зрачок хорошо видны2 = умеренная непрозрачность; радужная оболочка и зрачок едва видны3 = сильная непрозрачность; радужная оболочка или зрачок не видны4 = Непрозрачная роговица; радужная оболочка и зрачок не видны Наблюдая за роговицей через диссекционный микроскоп, оценивайте CoNV по следующей шкале12:0 = неоваскуляризация отсутствует; Никаких новых сосудов из лимба1 = легкая неоваскуляризация; Новые сосуды, происходящие из лимба2 = умеренная неоваскуляризация; Кровеносные сосуды берут начало от лимба и растут к центру роговицы3 = тяжелая неоваскуляризация; кровеносные сосуды, берущие начало из лимба и достигающие и/или пересекающие центр роговицы Используйте t-критерий Стьюдента для статистического сравнения показателей непрозрачности и неоваскуляризации между группами со щелочным ожогом и здоровыми глазами. Усыпляют мышей на 10-й день путем воздействия изофлурана в дозе 5% до 1 мин после остановки дыхания с последующим вывихом шейки матки и собирают роговицы для плоской визуализации. 6. Оптическая когерентная томография (ОКТ) Сделайте ОКТ-снимки переднего отрезка глаза у мышей, находящихся под наркозом, на 10-е сутки после ожога. Получение ОКТ-изображений в виде объемного сканирования в режиме ИК-+ ОКТ с углом обзора 30° и интенсивностью ИК-излучения 100%. Количественная оценка толщины роговицы с помощью программного обеспечения ImageJ. Чтобы измерить толщину, используйте инструмент «Выделение линии » в программном обеспечении ImageJ, чтобы создать прямую линию между передней и задней поверхностями в центральной части роговицы. Нажмите « Анализ > измерение » в программных инструментах, чтобы перенести значения в окно данных. Скопируйте значения в файл электронной таблицы и статистически сравните толщину роговицы между группами со щелочным ожогом и здоровыми глазами с помощью t-критерия Стьюдента.ПРИМЕЧАНИЕ: Толщина роговицы – это расстояние от точки на передней поверхности роговицы до ближайшей точки на задней поверхности роговицы в центре роговицы. 7. Иммуноокрашивание на CoNV на плоской роговице Усыпляйте мышей на 10-й день после ожога щелочью и проклейте глаза тупым вскрытием. Раздвиньте веки большим и указательным пальцами и поместите щипцы под глазное яблоко. Закройте щипцы и осторожно оттяните глазное яблоко от орбиты. Поместите глазные яблоки в 1x PBS. Для каждого глазного яблока удалите роговицу из глазного яблока, предварительно сделав надрез иглой 30 G ниже области лимба. Разрежьте область лимба с помощью роговичных микроножниц, сделав разрез в качестве отправной точки, и медленно отделите роговицу и лимб от глобуса. Аккуратно очистите роговицу тонкой кистью, чтобы удалить радужную оболочку. Зафиксируйте роговицу в 4% параформальдегиде на 1 ч. Промойте роговицу три раза по 20 минут каждый в 1x PBS при комнатной температуре (RT). Инкубируют в блокирующем буфере (1x PBS с добавлением 0,1% Triton-X 100 и 5% бычьего сывороточного альбумина [BSA]) в течение 1 ч при RT. Перенесите роговицу в раствор антител, содержащий первичные антитела. Приготовьте раствор антител в 1x PBS с добавлением 1% BSA, 0,1% Triton-X 100, Dylight550-конъюгированного анти-CD31 mAb (1:100) и Alexa Fluor488-конъюгированного анти-LYVE-1 mAb (1:100). Выдерживают 3 дня при температуре 4 °C. Промыть роговицу в 1x PBS три раза по 20 мин каждый. Окрасьте ядра раствором красителя Хёхста (1:1,000) в течение 5 минут в темноте. Расплющите роговицы радиальными надрезами и установите их на предварительно очищенное предметное стекло с помощью монтажной среды и покровных стекол. Запечатайте покровные стекла прозрачным лаком для ногтей и высушите предметные стекла в течение ночи в темноте перед анализом с помощью конфокальной микроскопии. Визуализация плоских роговиц с помощью конфокальной микроскопии путем сшивания отдельных изображений Z-стека; Используйте 10-кратный объектив, лазеры с длиной волны 488 нм и 561 нм и разрешением 512 x 512 пикселей на срез на нерезонансных сканерах Galvano. Количественная оценка плотности CD31+ кровеносных и лимфатических сосудов LYVE-1+ с помощью программного обеспечения ImageJ. Чтобы определить сосудистую плотность, преобразуйте конфокальные изображения в 8-битное изображение. Выберите Vascular Density (Плотность сосудов) из списка плагинов. Выберите интересующую область на изображении и нажмите кнопку ОК. Измерения откроются в новом окне данных. Скопируйте значения в файл электронной таблицы и статистически сравните плотность сосудов между группами со щелочным ожогом и здоровыми глазами с помощью t-критерия Стьюдента.ПРИМЕЧАНИЕ: CD31, также называемый молекулой адгезии эндотелиальных клеток тромбоцитов-1 (PECAM-1), представляет собой молекулу клеточной адгезии, участвующую в ангиогенезе и высоко экспрессируемую в эндотелиальных клетках ранних и зрелых кровеносных сосудов13. LYVE-1 (эндотелиальный гиалуроновый рецептор-1 лимфатических сосудов) является маркером клеточной поверхности лимфатических эндотелиальных клеток и может использоваться в качестве маркера лимфангиогенеза14.