Een muismodel voor neovascularisatie van het hoornvlies door alkaliverbranding

Al het dierwerk, inclusief de experimentele procedures en euthanasie, werd goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van het Baylor College of Medicine met protocolnummer AN-8790. 1. Bereiding van 1 N NaOH Voeg 4 ml steriel gedeïoniseerd water toe aan een centrifugebuis van 15 ml. Weeg 400 mg natriumhydroxide (NaOH) af en voeg voorzichtig toe aan de tube. Los de NaOH op door de oplossing langzaam te roeren met behulp van een glazen staaf. Vul het volume aan tot 10 ml door steriel gedeïoniseerd water aan de buis toe te voegen en meng opnieuw door de buis voorzichtig op en neer te keren. Sluit de dop goed en bewaar de oplossing bij kamertemperatuur. Bereid de verse oplossing elke maand voor, omdat de concentratie van de NaOH-oplossing kan worden verlaagd doordat de oplossing kooldioxide in de lucht absorbeert. Meng de NaOH-oplossing altijd voorzichtig voor gebruik.LET OP: Bereid de oplossing in een chemische kap en draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM). 2. Bereiding van de 4% paraformaldehyde (PFA)-oplossing Voeg 30 ml 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) toe aan een glazen bekerglas. Weeg 4 g paraformaldehyde (PFA) af en voeg dit toe aan het bekerglas. Bewaar het bekerglas al roerend op een hete plaat bij 60 °C. Voeg de 1 N NaOH-oplossing druppelsgewijs toe om de pH te verhogen totdat de oplossing helder is. Controleer de pH en stel deze in op 7,4 met behulp van 1 N zoutzuur (HCl). Pas het uiteindelijke volume aan tot 50 ml met 1x PBS. Koel en filter de oplossing. Bewaar de oplossing bij 4 °C.LET OP: Bereid de oplossing in een zuurkast terwijl u geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen draagt. 3. Bereiding van de ketamine/xylazine-cocktail Bereid de ketamine/xylazinecocktail door 0,8 ml ketamine (voorraadconcentratie: 100 mg/ml) en 0,16 ml xylazine (voorraadconcentratie: 100 mg/ml) toe te voegen aan 9,4 ml zoutoplossing. Bewaar de cocktail in steriele injectieflessen bij kamertemperatuur (RT). 4. Alkalische brandwond op het hoornvlies van de muis Injecteer meloxicam (4-6 mg/kg lichaamsgewicht) subcutaan 30 minuten voorafgaand aan de ingreep voor pijnverlichting. Verdoof de muizen (C57BL/6J, 6-8 weken oud, mannelijk) met behulp van een i.p. injectie van de ketamine/xylazine-cocktail (ketamine 80 mg/kg en xylazine 16 mg/kg lichaamsgewicht). Controleer de reflexrespons (terugtrekking van het pedaal) door de tenen van de muis samen te knijpen en bevestig de afwezigheid van de reflex. Breng een druppel plaatselijke verdoving, 0,5% proparacaïne, aan op het hoornvliesoppervlak van het ene oog en een druppel kunsttranen op het andere oog. Gebruik een biopsiepons van 2 mm om de schijven van het Whatman-filterpapier uit te ponsen. Voeg 2 μL 1N NaOH toe aan een schone petrischaal. Plaats de schijf van 2 mm filtreerpapier op de 1 N NaOH-druppel en laat deze 15 s weken. Pak het filtreerpapier met een pincet op en breng het filtreerpapier gedurende 30 seconden aan op het met proparacaïne behandelde oog in het midden van het hoornvlies.NOTITIE: Het filterpapier mag alleen het midden van het hoornvlies raken en er moet voor worden gezorgd dat het filtreerpapier niet beweegt nadat het is geplaatst, omdat het verplaatsen van het filterpapier brandwonden aan de aangrenzende weefsels kan veroorzaken. Was het oog door te spoelen met 20 ml steriele zoutoplossing in een steriele spuit.OPMERKING: Er moet voor worden gezorgd dat het hoornvlies, samen met de conjunctivale zak, grondig wordt gewassen om verdere schade aan het hoornvlies of het omliggende weefsel te voorkomen. Het wassen van de conjunctivale zak zal symblefaron verder voorkomen. Veeg de overtollige zoutoplossing voorzichtig van de ogen en de omgeving met zachte wegwerpdoekjes. Houd de muizen daarna in een herstelkooi op een warm verwarmingskussen tot ze ambulant zijn.OPMERKING: Muizen worden dagelijks gecontroleerd na de alkaliverbranding gedurende 3 dagen. Als symptomen van pijn of stress worden waargenomen, wordt meloxicam (4-6 mg/kg lichaamsgewicht) subcutaan toegediend. 5. Onderzoek en beoordeling van neovascularisatie en opaciteit Onderzoek bij verdoofde muizen de ogen onder een dissectiemicroscoop op dag 10 na de verbranding en verkrijg beelden met behulp van een camera die aan de dissectiescoop is bevestigd om de troebelheid en neovascularisatie te scoren.OPMERKING: Een gewone dissectiescoop met een camera eraan is voldoende. Terwijl u het hoornvlies door de dissectiemicroscoop observeert, scoort u de troebelheid na de brandwond op basis van de volgende schaal12:0 = Geen dekking; helder hoornvlies1 = Lichte opaciteit; lichte wazigheid in de iris- en pupilgebieden; Iris en pupil goed zichtbaar2 = Matige dekking; Iris en pupil nauwelijks zichtbaar3 = Ernstige opaciteit; iris of pupil niet zichtbaar4 = Ondoorzichtig hoornvlies; Iris en pupil niet zichtbaar Terwijl u het hoornvlies door de dissectiemicroscoop observeert, scoort u de CoNV op basis van de volgende schaal12:0 = Geen neovascularisatie; Geen nieuwe vaten uit de limbus1 = Milde neovascularisatie; nieuwe vaartuigen afkomstig uit de limbus2 = Matige neovascularisatie; Bloedvaten zijn afkomstig uit de limbus en groeien naar het midden van het hoornvlies3 = Ernstige neovascularisatie; bloedvaten die afkomstig zijn van de limbus en het midden van het hoornvlies bereiken en/of kruisen Gebruik de t-toets van een student om de scores voor opaciteit en neovascularisatie tussen de alkalische brandwonden en gezonde ooggroepen statistisch te vergelijken. Euthanaseer de muizen op dag 10 door blootstelling aan isofluraan bij 5% tot 1 minuut na het stoppen van de ademhaling, gevolgd door cervicale dislocatie, en verzamel de hoornvliezen voor flat-mount beeldvorming. 6. Optische coherentietomografie (OCT) beeldvorming Maak OCT-beelden van het voorste segment van de ogen bij verdoofde muizen op dag 10 na de verbranding. Voer OCT-beeldacquisitie uit als een volumescan met behulp van de IR + OCT-modus met een gezichtsveld van 30° en 100% IR-intensiteit. Kwantificeer de dikte van de hoornvliezen met behulp van ImageJ-software. Om de dikte te meten, gebruikt u het gereedschap Lijnselectie in de ImageJ-software om een rechte lijn te maken tussen het voorste en achterste oppervlak van het centrale hoornvlies. Klik op Analyze > Measure in de softwaretools om de waarden over te brengen naar het gegevensvenster. Kopieer de waarden naar een spreadsheetbestand en vergelijk statistisch de dikte van het hoornvlies tussen de alkalische verbranding en gezonde ooggroepen met behulp van een t-toets van een student.NOTITIE: De dikte van het hoornvlies is de afstand van een punt op het voorste hoornvliesoppervlak tot het dichtstbijzijnde punt op het achterste hoornvliesoppervlak in het hoornvliescentrum. 7. Immunokleuring voor CoNV op flat-mount hoornvliezen Euthanaseer de muizen op dag 10 na alkalische verbranding en verwijder de ogen door stompe dissectie. Trek de oogleden uit elkaar met duim en wijsvinger en plaats een pincet onder de oogbol. Sluit de pincet en trek de oogbol voorzichtig uit de baan. Plaats de oogbollen in 1x PBS. Verwijder voor elke oogbol het hoornvlies uit de oogbol door eerst een incisie te maken met een naald van 30 G onder het limbusgebied. Knip rond het limbusgebied met een microschaar van het hoornvlies, met de incisie als uitgangspunt, en scheid langzaam het hoornvlies en de limbus van de bol. Reinig de hoornvliezen voorzichtig met een fijn penseel om de iris te verwijderen. Fixeer de hoornvliezen gedurende 1 uur in 4% paraformaldehyde. Was de hoornvliezen drie keer gedurende 20 minuten elk in 1x PBS op kamertemperatuur (RT). Incubeer in een blokkerende buffer (1x PBS aangevuld met 0,1% Triton-X 100 en 5% runderserumalbumine [BSA]) gedurende 1 uur bij RT. Breng de hoornvliezen over naar een antilichaamoplossing die primaire antilichamen bevat. Bereid de antilichaamoplossing in 1x PBS aangevuld met 1% BSA, 0.1% Triton-X 100, Dylight550-geconjugeerde anti-CD31 mAb (1:100) en Alexa Fluor488-geconjugeerde anti-LYVE-1 mAb (1:100). Incubeer gedurende 3 dagen bij 4 °C. Was de hoornvliezen in 1x PBS drie keer gedurende 20 minuten elk. Kleuring van de kernen met Hoechst kleurstofoplossing (1:1.000) gedurende 5 minuten in het donker. Druk de hoornvliezen plat met radiale sneden en monteer ze op een vooraf gereinigd objectglaasje met behulp van montagemedium en dekglaasjes. Sluit de dekglaasjes af met doorzichtige nagellak en droog de glaasjes een nacht in het donker voordat ze worden geanalyseerd met confocale microscopie. Breng de plat gemonteerde hoornvliezen in beeld met behulp van confocale microscopie door individuele Z-stack-afbeeldingen aan elkaar te naaien; Gebruik een 10x objectief, 488 nm en 561 nm lasers en een resolutie van 512 pixels x 512 pixels per plak op niet-resonante galvanoscanners. Kwantificeer de dichtheid van CD31+ bloed en LYVE-1+ lymfevaten met behulp van ImageJ-software. Om de vasculaire dichtheid te bepalen, converteert u de confocale beelden naar een 8-bits beeld. Kies Vasculaire dichtheid uit de plug-ins. Kies het interessegebied op de afbeelding en klik op OK. De metingen worden geopend in een nieuw gegevensvenster. Kopieer de waarden naar een spreadsheetbestand en vergelijk statistisch de vasculaire dichtheid tussen de alkalische brandwond en gezonde ooggroepen met behulp van een t-toets van een student.OPMERKING: CD31, ook wel bloedplaatjes endotheelceladhesiemolecuul-1 (PECAM-1) genoemd, is een celadhesiemolecuul dat betrokken is bij angiogenese en komt sterk tot expressie in de endotheelcellen van vroege en rijpe bloedvaten13. LYVE-1 (lymfevaat endotheliale hyaluronreceptor-1) is een celoppervlaktemarker op lymfatische endotheelcellen en kan worden gebruikt als lymfangiogenesemarker14.