Иммунофлуоресцентная визуализация внеклеточных ловушек нейтрофилов в тканях человека и мыши

Внеклеточные ловушки нейтрофилов (НВЛ) были впервые визуализированы Brinkmann et al. как путь клеточной гибели, отличный от апоптоза и некроза в 2004^году. По этому пути нейтрофилы высвобождают свой деконденсированный хроматин во внеклеточное пространство, чтобы сформировать большие паутинчатые структуры, покрытые антимикробными белками, которые ранее хранились в гранулах или цитозоле. Эти антимикробные белки включают нейтрофильную эластазу (NE), миелопероксидазу (MPO) и цитруллинированный гистон H3 (H3cit), которые обычно используются для непрямой иммунофлуоресцентной детекции НВЛ-2. Этот метод не только определяет количественное присутствие этих белков; более того, его преимущество заключается в специфическом обнаружении NET-подобных структур. В НВЛ упомянутые белки локализуются с внеклеточной ДНК, что может быть обнаружено по перекрытию сигналов флуоресценции каждого окрашенного белка и внеклеточной ДНК. В отличие от перекрывающихся сигналов, обусловленных внеклеточной локализацией ДНК и белков в НВЛ, интактные нейтрофилы не демонстрируют колокализации. Здесь компоненты НВЛ обычно хранятся отдельно в гранулах, ядрах и цитозоле³.

С момента их первого открытия было показано, что НВЛ играют центральную роль во многих заболеваниях, особенно в тех, которые связаны с воспалением. НВЛ проявляют антимикробные функции во время инфекции путем захвата и уничтожения внеклеточных патогенов в крови и тканях ^4,5. Тем не менее, НВЛ также связаны с аутоиммунными заболеваниями и гипервоспалительными реакциями, такими как системная красная волчанка, ревматический артрит и аллергическая астма ^6,7,8. НВЛ способствуют вазоокклюзии и воспалению при атеросклерозе, адгезии тромбоцитов и, как предполагается, играют роль в развитии метастатического рака 9,10,11. Тем не менее, считается, что они обладают противовоспалительными свойствами, снижая уровень провоспалительных цитокинов¹². В то время как НЭО вызывают все больший интерес в более широкой области исследований, надежный метод обнаружения НЭО имеет фундаментальное значение для будущих исследований.

Несмотря на то, что визуализация НВЛ в различных тканях с помощью иммунофлуоресцентной визуализации сложна и требует адаптации, помимо электронной микроскопии, в настоящее время она является одним из наиболее известных методов визуализации взаимодействий между НВЛ и клетками и преимущественно используется в фиксированных формалином тканях, залитых парафином (FFPE)^13,14. Тем не менее, сравнение NET-изображений затруднено, так как разные лаборатории используют свои собственные индивидуальные протоколы. Эти протоколы отличаются использованием антител, методом извлечения антигена или пермеабилизации и часто оптимизированы для определенного типа тканей 3,13,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 ^,27.

После того, как Brinkmann et al. опубликовали первое методическое исследование с использованием иммунофлуоресцентной визуализации НВЛ в тканях FFPE, мы захотели оптимизировать этот протокол для более широкого спектра тканей и^видов15. Кроме того, чтобы создать широко применимый протокол иммунофлюоресценции, мы протестировали различные модифицированные протоколы исследований, в которых использовались методы иммунофлуоресценции в тканях FFPE для обнаружения НВЛ 3,13,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25^{, 26,27}. Кроме того, мы попробовали новое антитело H3cit для более специфического внеклеточного окрашивания²⁸. Мы предполагаем, что, систематически адаптируя существующие протоколы окрашивания к различным видам и тканям, визуализация in vitro может быть улучшена, что приведет к лучшему представлению взаимодействия между нейтрофилами и НВЛ как локально, так и системно.