전기천공된 Cas9-sgRNA 복합체를 사용한 일차 골수 유래 대식세포의 고효율 유전자 파괴
Summary
이 프로토콜은 시험관내에서 조립되고 전기천공법으로 전달되는 Cas9-sgRNA 리보핵단백질 복합체를 사용하여 마우스 골수 유래 대식세포에서 게놈 편집 절차를 설명합니다.
Abstract
생쥐의 골수 유래 대식세포(BMDM)는 조직 대식세포의 복잡한 생물학을 연구하기 위한 핵심 도구입니다. 일차 세포로서 생체 내 대식세포의 생리학을 불멸화된 대식세포 세포주보다 더 밀접하게 모델링하며 이미 정의된 유전적 변화를 가지고 있는 마우스에서 파생될 수 있습니다. 그러나 BMDM에서 유전자 기능을 방해하는 것은 기술적으로 여전히 어려운 과제입니다. 여기서는 BMDM에서 효율적인 CRISPR/Cas9 게놈 편집을 위한 프로토콜을 제공하며, 이를 통해 유전자 기능을 방해하는 프레임시프트 돌연변이를 초래하는 작은 삽입 및 결실(indel)을 도입할 수 있습니다. 이 프로토콜은 단일 가이드 RNA(sgRNA-Cas9)를 합성하고 전기천공법으로 전달할 수 있는 정제된 sgRNA-Cas9 리보핵단백질 복합체(RNP)를 형성하는 방법을 설명합니다. 또한 일상적인 Sanger 염기서열분석과 무료로 제공되는 온라인 분석 프로그램을 사용하여 편집 효율성을 모니터링하는 효율적인 방법을 제공합니다. 프로토콜은 1주일 이내에 수행할 수 있으며 플라스미드 구축이 필요하지 않습니다. 일반적으로 85%에서 95%의 편집 효율성을 얻을 수 있습니다.
Introduction
대식세포는 조직 복구와 면역에 중요한 역할을 하는 선천성 면역 세포입니다 1,2. 마우스 RAW 264.7 세포 또는 인간 THP-1 세포와 같은 불멸화된 대식세포 세포주는 RNA 간섭 또는 CRISPR/Cas9 3,4에 대한 벡터를 전달하여 강력한 성장과 유전자 파괴 용이성을 포함하여 여러 가지 유익한 특성을 가지고 있습니다. 그러나 종양 변형은 생리학을 극적으로 변화시켜 일부 경로의 비정상적인 활성화와 다른 경로의 음소거 반응을 초래합니다 5,6. 일차 골수 유래 대식세포(BMDM)는 생체 내 대식세포 생리학을 보다 밀접하게 재현하지만, 이러한 일차 면역 세포에서 플라스미드 형질주입 및 바이러스 형질주입의 효율성이 낮기 때문에 유전적으로 조작하는 것이 여전히 어렵습니다 7,8. 따라서 유전자 기능을 교란하기 위한 보다 효율적인 방법이 필요하다.
CRISPR/Cas9 게놈 편집은 포유류 세포 9,10,11,12를 포함한 다양한 생물학적 시스템에서 유전자 조작을 위한 강력한 도구입니다. Streptococcus pyogenes Cas9 단백질은 염기서열 특이적 가이드 RNA와 복합체될 때 이중 가닥 DNA를 효율적이고 특이적으로 절단합니다. 절단된 DNA의 NHEJ(non-homologous end joining)를 통한 DNA 복구는 프레임시프트 돌연변이를 생성하는 작은 삽입 또는 결실(indels)을 초래합니다. 초기 연구에서 Cas9 및 sgRNA는 플라스미드 또는 렌티바이러스 벡터를 통해 전달되었으며, 이는 많은 세포주에 대한 효과적인 전달 방법입니다 9,10. 그러나, 일차 세포, 특히 일차 면역 세포는 형질주입 또는 형질도입에 의한 벡터 전달의 효율이 낮기 때문에 종종 이러한 방법에 불응한다. 그 후, 시험관 내에서 sgRNA-Cas9 복합체를 생성하고 전기천공법을 통해 전달하는 방법이 개발되었으며, 이러한 방법은 다양한 세포 유형에서 높은 효율을 달성했습니다13,14. 결과는 1차 대식세포에서 게놈 편집을 수행하기 위해 이 접근법을 사용할 가능성을 시사했습니다.
여기서는 sgRNA-Cas9 리보핵단백질 복합체(RNP)를 사용하여 1차 BMDM에서 게놈 편집을 수행하기 위한 프로토콜을 제공합니다. 여기에는 일차 면역 세포에 존재하는 면역 센서의 활성화를 완화하는 단계가 포함되어 있으며 최소한의 독성으로 표적 유전자좌에서 최대 95%까지 편집됩니다. 이 프로토콜에는 일상적인 중합효소연쇄반응(PCR) 및 Sanger 염기서열분석을 사용하여 편집 효율성을 평가하는 워크플로우와 검증된 온라인 소프트웨어 도구인 TIDE(Tracking of Indels by Decomposition)15를 통한 인실리코(in silico) 분석도 포함됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
전기천공된 Cas9-sgRNA 복합체를 사용한 게놈 편집은 BMDM에서 유전자 기능을 효과적으로 방해할 수 있습니다. 편집 효율은 표적 염기서열과 유전자에 따라 다릅니다. 일반적으로 4-5개의 sgRNA를 스크리닝하여 활성이 높은 sgRNA를 식별합니다. 일부 유전자좌는 편집 효율이 낮은데, 이는 염색질 구조 때문일 가능성이 큽니다. 이러한 경우 편집 효율성을 높이기 위해 몇 가지 수정을 수행할 수 있습니다. ?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 NIH 보조금 5R01AI144149의 지원을 받았습니다. 회로도는 BioRender로 제작되었습니다.
Materials
| 3T3-MCSF Cell Line | Gift from Russell Vance | not applicable | |
| Alt-R Cas9 Electroporation Enhancer | IDT | 1075915 | |
| Ampure XP Reagent Beads | Beckman Coulter | A63880 | |
| Calf intestinal alkaline phosphatase | NEB | M0525S | |
| DNase | NEB | M0303S | |
| DPBS +Ca/Mg (0.9mM CaCl2 and 0.5mM MgCl2) | Thermo Fisher | 14040-133 | |
| DPBS -Ca/Mg | Thermo Fisher | 14190-144 | |
| ExoI | NEB | M0293S | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Corning | 35-015-CV | |
| Herculase DNA polymerase & buffer | Agilent | 600677 | |
| HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit | NEB | E2040S | |
| LoBind conical tubes 15 mL | Eppendorf | 30122216 | |
| LoBind Eppendorf tubes 2 mL | Eppendorf | 22431102 | |
| NEBuffer r2.1 | NEB | B6002S | |
| Neon Transfection System | Thermo Fisher | MPK5000, MPP100, MPS100 | |
| Neon Transfection System 10 uL Tips | Thermo Fisher | MPK1025 or MPK1096 | |
| PBS + 1mM EDTA | Lonza | BE02017F | |
| Proteinase K | Thermo Fisher | EO0491 | |
| rCutSmart Buffer for ExoI | NEB | B6004S | |
| Ribolock | Thermo Fisher | EO0384 | |
| RNA loading dye | NEB | B0363S | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| S. pyogenes Cas9-NLS | University of California Macro Lab | not applicable | Available to non-UC investigators through https://qb3.berkeley.edu |
| S. pyogenes Cas9-NLS, modified 3rd Generation | IDT | 1081059 | |
| SAP | NEB | M0371S |
Referencias
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