Quantificazione basata su immagini ad alto rendimento della sintesi e della distribuzione del DNA mitocondriale
Summary
Viene descritta una procedura per studiare la dinamica del metabolismo del DNA mitocondriale (mtDNA) nelle cellule utilizzando un formato di piastra multi-pozzetto e l’imaging automatizzato di immunofluorescenza per rilevare e quantificare la sintesi e la distribuzione del mtDNA. Questo può essere ulteriormente utilizzato per studiare gli effetti di vari inibitori, stress cellulari e silenziamento genico sul metabolismo del mtDNA.
Abstract
La stragrande maggioranza dei processi cellulari richiede una fornitura continua di energia, il cui vettore più comune è la molecola di ATP. Le cellule eucariotiche producono la maggior parte del loro ATP nei mitocondri mediante fosforilazione ossidativa. I mitocondri sono organelli unici perché hanno il loro genoma che viene replicato e trasmesso alla prossima generazione di cellule. In contrasto con il genoma nucleare, ci sono più copie del genoma mitocondriale nella cellula. Lo studio dettagliato dei meccanismi responsabili della replicazione, riparazione e mantenimento del genoma mitocondriale è essenziale per comprendere il corretto funzionamento dei mitocondri e delle cellule intere sia in condizioni normali che di malattia. Qui viene presentato un metodo che consente la quantificazione ad alto rendimento della sintesi e della distribuzione del DNA mitocondriale (mtDNA) in cellule umane coltivate in vitro . Questo approccio si basa sulla rilevazione in immunofluorescenza di molecole di DNA sintetizzate attivamente marcate mediante incorporazione di 5-bromo-2′-deossiuridina (BrdU) e sulla rilevazione simultanea di tutte le molecole di mtDNA con anticorpi anti-DNA. Inoltre, i mitocondri sono visualizzati con coloranti o anticorpi specifici. La coltura di cellule in un formato multi-pozzetto e l’utilizzo di un microscopio a fluorescenza automatizzato rendono più facile studiare la dinamica del mtDNA e la morfologia dei mitocondri in una varietà di condizioni sperimentali in un tempo relativamente breve.
Introduction
Per la maggior parte delle cellule eucariotiche i mitocondri sono organelli essenziali, in quanto svolgono un ruolo cruciale in numerosi processi cellulari. Innanzitutto, i mitocondri sono i principali fornitori di energia delle cellule1. I mitocondri sono anche coinvolti nella regolazione dell’omeostasi cellulare (ad esempio, redox intracellulare2 e l’equilibrio del calcio3), segnalazione cellulare4,5, apoptosi6, sintesi di diversi composti biochimici 7,8 e risposta immunitaria innata9. La disfunzione mitocondriale è associata a vari stati patologici e malattie umane10.
Il funzionamento dei mitocondri dipende dall’informazione genetica situata in due genomi separati: il genoma nucleare e mitocondriale. Il genoma mitocondriale codifica per un piccolo numero di geni rispetto al genoma nucleare, ma tutti i geni codificati dal mtDNA sono essenziali per la vita umana. Il meccanismo proteico mitocondriale necessario per mantenere il mtDNA è codificato dall’nDNA. I componenti di base del replisoma mitocondriale, così come alcuni fattori di biogenesi mitocondriale, sono già stati identificati (rivisti nella ricerca precedente11,12). Tuttavia, i meccanismi di replicazione e mantenimento del DNA mitocondriale sono ancora lontani dall’essere compresi. A differenza dell’nDNA, il genoma mitocondriale esiste in più copie, il che fornisce un ulteriore strato per regolare l’espressione genica mitocondriale. Molto meno si sa attualmente sulla distribuzione e la segregazione del mtDNA all’interno degli organelli, in che misura questi processi sono regolati e, se lo sono, quali proteine sono coinvolte13. Il modello di segregazione è cruciale quando le cellule contengono una popolazione mista di mtDNA wild-type e mutato. La loro distribuzione ineguale può portare alla generazione di cellule con una quantità dannosa di mtDNA mutato.
Finora, i fattori proteici necessari per il mantenimento del mtDNA sono stati identificati principalmente con metodi biochimici, analisi bioinformatiche o attraverso studi associati alla malattia. In questo lavoro, al fine di garantire un’alta probabilità di identificare fattori che in precedenza sono sfuggiti all’identificazione, viene descritta una strategia diversa. Il metodo si basa sulla marcatura del mtDNA durante la replicazione o la riparazione con 5-bromo-2′-deossiuridina (BrdU), un analogo nucleosidico della timidina. BrdU è facilmente incorporato nei filamenti di DNA nascente durante la sintesi del DNA e, in generale, viene utilizzato per monitorare la replicazione del DNA nucleare14. Tuttavia, la procedura sviluppata qui è stata ottimizzata per rilevare BrdU incorporato nel mtDNA utilizzando l’immunofluorescenza degli anticorpi anti-BrdU.
L’approccio consente la quantificazione ad alto rendimento della sintesi e della distribuzione del mtDNA in cellule umane coltivate in vitro. È necessaria una strategia ad alto rendimento per condurre test in diverse condizioni sperimentali in un tempo relativamente breve; Pertanto, si propone nel protocollo di utilizzare un formato multi-pozzo per la coltura cellulare e la microscopia a fluorescenza automatizzata per l’imaging. Il protocollo include la trasfezione di cellule HeLa umane con una libreria di siRNA e il successivo monitoraggio della replicazione o riparazione del mtDNA utilizzando la marcatura metabolica del DNA appena sintetizzato con BrdU. Questo approccio è combinato con l’immunocolorazione del DNA con l’aiuto di anticorpi anti-DNA. Entrambi i parametri vengono analizzati utilizzando la microscopia quantitativa a fluorescenza. Inoltre, i mitocondri vengono visualizzati con un colorante specifico. Per dimostrare la specificità del protocollo, la colorazione BrdU è stata testata su cellule prive di mtDNA (cellule rho0), su cellule HeLa dopo il silenziamento di noti fattori di mantenimento del mtDNA e su cellule HeLa dopo trattamento con un inibitore della replicazione del mtDNA. I livelli di mtDNA sono stati misurati anche con un metodo indipendente, vale a dire qPCR.
Protocol
Representative Results
Discussion
Storicamente, l’etichettatura del DNA mediante incorporazione BrdU e rilevamento di anticorpi è stata utilizzata nella replicazione del DNA nucleare e nella ricerca sul ciclo cellulare 14,27,28. Finora, tutti i protocolli per rilevare il DNA marcato con BrdU hanno incluso una fase di denaturazione del DNA (acida o termica) o digestione enzimatica (DNasi o proteinasi) per consentire l’esposizione all’epitopo e facilitare la pene…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Science Centre, Polonia (numero di sovvenzione / premio: 2018/31 / D / NZ2/03901).
Materials
| 2′,3′-Dideoxycytidine (ddC) | Sigma-Aldrich | D5782 | |
| 384 Well Cell Culture Microplates, black | Greiner Bio-One | #781946 | |
| 5-Bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) | Sigma-Aldrich | B5002-1G | Dissolve BrdU powder in water to 20 mM stock solution and aliquot. Use 20 µM BrdU solution for labeling. |
| Adhesive sealing film | Nerbe Plus | 04-095-0060 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21121 | |
| Alexa Fluor 555 goat anti-mouse IgM secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21426 | |
| BioTek 405 LS microplate washer | Agilent | ||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| Cell counting chamber Thoma | Heinz Herenz | REF:1080339 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Cytiva | SH30243.01 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | 41965-062 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| Formaldehyde solution | Sigma-Aldrich | F1635 | Formaldehyde is toxic; please read the safety data sheet carefully. |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| IgG1 mouse monoclonal anti-BrdU (IIB5) primary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-32323 | |
| IgM mouse monoclonal anti-DNA (AC-30-10) primary antibody | Progen | #61014 | |
| LightCycler 480 System | Roche | ||
| Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | #13778150 | |
| MitoTracker Deep Red FM | Thermo Fisher Scientific | M22426 | Mitochondria tracking dye |
| Multidrop Combi Reagent Dispenser | Thermo Fisher Scientific | ||
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 51985-042 | |
| Orca-R2 (C10600) CCD Camera | Hamamatsu | ||
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781-100ML | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Thermo Fisher Scientific | A25742 | |
| qPCR primer Fw B2M (reference) | CAGGTACTCCAAAGATTCAGG | ||
| qPCR primer Fw GPI (reference gene) | GACCTTTACTACCCAGGAGA | ||
| qPCR primer Fw MT-ND1 | TAGCAGAGACCAACCGAACC | ||
| qPCR primer Fw POLG | TGGAAGGCAGGCATGGTCAAACC | ||
| qPCR primer Fw TFAM | GATGAGTTCTGCCTGCTTTAT | ||
| qPCR primer Fw TWNK | GCCATGTGACACTGGTCATT | ||
| qPCR primer Rev B2M (reference) | GTCAACTTCAATGTCGGATGG | ||
| qPCR primer Rev GPI (reference gene) | AGTAGACAGGGCAACAAAGT | ||
| qPCR primer Rev MT-ND1 | ATGAAGAATAGGGCGAAGGG | ||
| qPCR primer Rev POLG | GGAGTCAGAACACCTGGCTTTGG | ||
| qPCR primer Rev TFAM | GGACTTCTGCCAGCATAATA | ||
| qPCR primer Rev TWNK | AACATTGTCTGCTTCCTGGC | ||
| ScanR microscope | Olympus | ||
| siRNA Ctrl | Dharmacon | D-001810-10-5 | |
| siRNA POLG | Invitrogen | POLGHSS108223 | |
| siRNA TFAM | Invitrogen | TFAMHSS144252 | |
| siRNA TWNK | Invitrogen | C10orf2HSS125597 | |
| Suction device | NeoLab | 2-9335 | Suction device for cell culture |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-500ML | |
| Trypsin | Biowest | L0931-500 | |
| UPlanSApo 20x 0.75 NA objective | Olympus |
Referencias
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