Cuantificación basada en imágenes de alto rendimiento de la síntesis y distribución del ADN mitocondrial

Para la mayoría de las células eucariotas, las mitocondrias son orgánulos esenciales, ya que desempeñan un papel crucial en numerosos procesos celulares. En primer lugar, las mitocondrias son los principales proveedores de energía de las células¹. Las mitocondrias también están involucradas en la regulación de la homeostasis celular (por ejemplo, redox^{2 intracelular} y el balance de calcio³), la señalización celular ^4,5, la apoptosis⁶, la síntesis de diferentes compuestos bioquímicos ^7,8 y la respuesta inmune innata⁹. La disfunción mitocondrial está asociada a diversos estados patológicos y enfermedades humanas¹⁰.

El funcionamiento de las mitocondrias depende de la información genética localizada en dos genomas separados: el nuclear y el mitocondrial. El genoma mitocondrial codifica un pequeño número de genes en comparación con el genoma nuclear, pero todos los genes codificados por ADNmt son esenciales para la vida humana. La maquinaria de proteínas mitocondriales necesaria para mantener el ADNmt está codificada por el ADNn. Los componentes básicos del replisoma mitocondrial, así como algunos factores de biogénesis mitocondrial, ya han sido identificados (revisado en investigaciones anteriores^11,12). Sin embargo, la replicación del ADN mitocondrial y los mecanismos de mantenimiento aún están lejos de ser entendidos. En contraste con el ADNn, el genoma mitocondrial existe en múltiples copias, lo que proporciona una capa adicional para regular la expresión génica mitocondrial. Actualmente se sabe mucho menos sobre la distribución y segregación del ADNmt dentro de los orgánulos, en qué medida estos procesos están regulados y, si lo están, qué proteínas están involucradas¹³. El patrón de segregación es crucial cuando las células contienen una población mixta de ADNmt mutado y de tipo salvaje. Su distribución desigual puede conducir a la generación de células con una cantidad perjudicial de ADNmt mutado.

Hasta ahora, los factores proteicos necesarios para el mantenimiento del ADNmt se han identificado principalmente mediante métodos bioquímicos, análisis bioinformáticos o mediante estudios asociados a enfermedades. En este trabajo, con el fin de garantizar una alta probabilidad de identificar factores que previamente han escapado a la identificación, se describe una estrategia diferente. El método se basa en el etiquetado del ADNmt durante la replicación o reparación con 5-bromo-2′-desoxiuridina (BrdU), un análogo nucleósido de la timidina. BrdU se incorpora fácilmente en las hebras de ADN nacientes durante la síntesis de ADN y, en general, se utiliza para monitorear la replicación del ADN nuclear¹⁴. Sin embargo, el procedimiento desarrollado aquí ha sido optimizado para detectar BrdU incorporado en el ADNmt utilizando la inmunofluorescencia de anticuerpos anti-BrdU.

El enfoque permite la cuantificación de alto rendimiento de la síntesis y distribución de ADNmt en células humanas cultivadas in vitro. Es necesaria una estrategia de alto rendimiento para realizar pruebas en diferentes condiciones experimentales en un tiempo relativamente corto; Por lo tanto, en el protocolo se propone utilizar un formato de pocillos múltiples para el cultivo celular y microscopía de fluorescencia automatizada para la obtención de imágenes. El protocolo incluye la transfección de células HeLa humanas con una biblioteca de ARNip y el posterior monitoreo de la replicación o reparación del ADNmt utilizando el etiquetado metabólico del ADN recién sintetizado con BrdU. Este enfoque se combina con la inmunotinción del ADN con la ayuda de anticuerpos anti-ADN. Ambos parámetros se analizan mediante microscopía de fluorescencia cuantitativa. Además, las mitocondrias se visualizan con un tinte específico. Para demostrar la especificidad del protocolo, se probó la tinción de BrdU en células desprovistas de ADNmt (células rho0), en células HeLa tras el silenciamiento de factores de mantenimiento de ADNmt bien conocidos y en células HeLa después del tratamiento con un inhibidor de la replicación del ADNmt. Los niveles de ADNmt también se midieron mediante un método independiente, a saber, qPCR.