Цельный препарат на основе метанола для исследования ганглиозных клеток сетчатки

Ганглиозные клетки сетчатки (RGCs) являются единственными проекционными нейронами в сетчатке, и они интегрируют и передают внешнюю визуальную информацию в мозг¹. Многие нейродегенеративные заболевания, такие как глаукома и травматическая нейропатия зрительного нерва, характеризуются необратимым повреждением и потерей RGCs ^2,3. Анализ морфологических и количественных изменений RGC является важным шагом в определении того, как развиваются и прогрессируют нейродегенеративные заболевания ^4,5.

Непрямой иммунофлюоресцентный анализ является широко распространенным методом мониторинга распределения белков и подсчета клеток. В лабораторных условиях иммуноокрашивание сетчатки обычно используется в экспериментальных исследованиях RGC для оценки физиологических и патологических состояний сетчатки⁶. Наиболее распространенные маркеры, используемые для количественной оценки RGC во всей сетчатке, включают Brn3a, РНК-связывающий белок с множественным сплайсингом (RBPMS) и так далее ^7,8. Характеристика количества и распределения RGC требует высококачественного цельного иммуноокрашивания сетчатки. Как правило, в протоколах иммуноокрашивания сетчатка погружается в химические фиксаторы перед инкубацией в антителах. Идеальные фиксаторы не должны изменять форму клеток, доступность или сродство эпитопов к антителам или линейные размеры ткани ^9,10.

Из-за сложной структуры сетчатки такие проблемы, как хрупкость и складчатость сетчатки, а также некоторые общие трудности, включая усадку клеток и неясные ядра, могут возникать при изготовлении цельного патча сетчатки, что отрицательно сказывается на экспериментальных исследованиях. Кроме того, не все сетчатки подвергаются немедленному иммуноокрашиванию, особенно когда речь идет о сетчатке трансгенных мышей с дорогими ценами, которые имеют драгоценное происхождение, что требует сохранения дополнительных образцов сетчатки для дальнейшего использования.

Соответствующий фиксирующий раствор может быстро фиксировать ткань, избегать тканевого аутолиза, сохранять нормальную морфологию и структуру клеток ткани и сохранять антигенность белков и других веществ¹⁰. В настоящее время фиксация на основе формальдегида широко используется в различных тканях, включая разделенные сетчатки, гемисектированные наглазники и целые глазные яблоки¹⁰. Усадка тканей и морфологическое изменение клеток являются двумя критическими проблемами, возникающими после погружения в формальдегид¹¹. Кроме того, все чаще появляются модифицированные составы фиксации, чтобы максимизировать сохранение первоначальных свойств сетчатки и клеток-мишеней ^9,10. Различные методы фиксации сетчатки могут по-разному влиять на структуру сетчатки, иммуногенность белка, возбуждение флуоресценции и цикл гашения затухания^{затухания 12,13}. Сетчатки, зафиксированные раствором Дэвидсона, более морфологически интактны по сравнению с сетчатками, фиксированными формалином, но раствор Дэвидсона менее совместим с некоторыми антителами, такими как ионизированная микроглиальным маркером кальций молекула адаптера 1¹². Учитывая хрупкую природу сетчатки, исследователи, естественно, задаются вопросом, изменится ли целостность сетчатки, а также свойства и морфология клеток-мишеней после длительного хранения. Однако о возможном влиянии фиксирующего раствора на морфологию клеток сетчатки и RGC после хранения в течение нескольких месяцев сообщалось редко. Оптимизация фиксации сетчатки имеет решающее значение для оценки и сохранения RGC.

Мы приводим подробное описание надежного и технически простого метода, который мы используем для окрашивания сетчатки мыши целиком. Наш метод подчеркивает надлежащую подготовку и хранение сетчатки для исследования RGC, принимая во внимание необходимость длительного хранения ткани сетчатки, а также специфические аспекты образования или деградации флуорофоров.