שימוש בהליכון עכבר לכימות תפקוד לקוי של מנוע עכבר במודל עכבר של פגיעה בחוט השדרה
Summary
צינור ניסיוני לתיאור כמותי של דפוס הלוקומוטור של עכברים ההולכים בחופשיות באמצעות ארגז הכלים MouseWalker (MW) מסופק, החל מהקלטות וידאו ראשוניות ומעקב ועד ניתוח לאחר כימות. מודל פגיעה בחוט השדרה בעכברים משמש כדי להדגים את התועלת של מערכת MW.
Abstract
ביצוע תוכניות מוטוריות מורכבות ומתואמות מאוד, כגון הליכה וריצה, תלוי בהפעלה קצבית של מעגלים בעמוד השדרה ובמעגלים העל-שדרתיים. לאחר פגיעה בעמוד השדרה החזי, התקשורת עם מעגלים במעלה הזרם נפגעת. זה, בתורו, מוביל לאובדן קואורדינציה, עם פוטנציאל התאוששות מוגבל. לפיכך, כדי להעריך טוב יותר את מידת ההחלמה לאחר מתן תרופות או טיפולים, יש צורך בכלים חדשים, מפורטים ומדויקים יותר לכימות הליכה, תיאום גפיים והיבטים עדינים אחרים של התנהגות מוטורית במודלים של בעלי חיים של פגיעה בחוט השדרה. במהלך השנים פותחו מספר בדיקות להערכה כמותית של התנהגות הליכה חופשית במכרסמים; עם זאת, הם בדרך כלל חסרים מדידות ישירות הקשורות לאסטרטגיות הליכה צעד, דפוסי טביעת רגל וקואורדינציה. כדי להתמודד עם חסרונות אלה, מסופקת גרסה מעודכנת של MouseWalker, המשלבת מסלול הליכה מתוסכל של השתקפות פנימית כוללת (fTIR) עם תוכנת מעקב וכימות. מערכת קוד פתוח זו הותאמה לחילוץ מספר פלטים גרפיים ופרמטרים קינמטיים, ומערכת של כלים לאחר כימות יכולה להיות לנתח את נתוני הפלט שסופקו. כתב יד זה גם מדגים כיצד שיטה זו, בשילוב עם מבחנים התנהגותיים שכבר נקבעו, מתארת כמותית ליקויים מוטוריים בעקבות פגיעה בחוט השדרה.
Introduction
התיאום היעיל של ארבע גפיים אינו ייחודי לבעלי חיים מרובעים. תיאום פורלימב-גפיים אחוריות בבני אדם נותר חשוב לביצוע מספר משימות, כגון שחייה ושינויים במהירות תוך כדי הליכה1. קינמטיגפיים שונים 2 ותוכנית מוטורית 1,3,4, כמו גם מעגלי משוב פרופריוצפטיביים5, נשמרים בין בני אדם ליונקים אחרים ויש לשקול אותם בעת ניתוח אפשרויות טיפוליות להפרעות מוטוריות, כגון פגיעה בחוט השדרה (SCI)6,7,8.
על מנת ללכת, מספר קשרים בעמוד השדרה מהגפיים הקדמיות והאחוריות צריכים להיות מחווטים כראוי ומופעלים בקצב, מה שדורש קלט מהמוח ומשוב מהמערכת הסומטוסנסורית 2,9,10. קשרים אלה מגיעים לשיאם במחוללי הדפוסים המרכזיים (CPGs), הממוקמים ברמה צווארית ומותנית עבור הגפיים הקדמיות והאחוריות, בהתאמה 1,9,10. לעתים קרובות, לאחר SCI, שיבוש הקישוריות העצבית והיווצרות צלקת גלייה מעכבת12 מגבילים את התאוששות התפקוד המוטורי, כאשר התוצאות משתנות משיתוק מוחלט לתפקוד מוגבל של קבוצת גפיים בהתאם לחומרת הפציעה. כלים לכימות מדויק של תפקוד לוקומוטורי לאחר SCI הם קריטיים למעקב אחר התאוששות והערכת ההשפעות של טיפולים או התערבויות קליניות אחרות6.
המבחן המטרי הסטנדרטי עבור מודלים של קונטוזיה של עכבר SCI הוא סולם עכבר באסו (BMS)13,14, ציון לא פרמטרי הלוקח בחשבון את יציבות תא המטען, מיקום הזנב, דריכה פלנטרית וקואורדינציה בין הגפיים הקדמיות לגפיים האחוריות בזירת שדה פתוח. למרות BMS הוא אמין ביותר עבור רוב המקרים, זה דורש לפחות שני מעריכים מנוסים כדי לבחון את כל זוויות התנועה של בעלי חיים על מנת להסביר את השונות הטבעית ולהפחית הטיה.
בדיקות אחרות פותחו גם כדי להעריך את הביצועים המוטוריים לאחר SCI באופן כמותי. אלה כוללים את מבחן rotarod, אשר מודד את הזמן המושקע על גליל מסתובב15; הסולם האופקי, המודד את מספר המעקות שהוחמצו והסולם החיובי תופס16,17; ומבחן הליכת הקרן, המודד את הזמן שלוקח לבעל חיים ואת מספר הכשלים שהוא עושה בעת חציית קורה צרה18. למרות שהן משקפות שילוב של ליקויים מוטוריים, אף אחת מהבדיקות הללו אינה מייצרת מידע מוטורי ישיר על תיאום הגפיים הקדמיות-אחוריות.
כדי לנתח באופן ספציפי ויסודי יותר את התנהגות ההליכה, פותחו בדיקות אחרות כדי לשחזר מחזורי צעדים ואסטרטגיות הליכה. דוגמה אחת היא מבחן טביעת הרגל, שבו כפות הדיו של בעל חיים מציירות תבנית על גיליון נייר לבן19. למרות שהוא פשוט בביצועו, חילוץ פרמטרים קינמטיים כגון אורך צעד הוא מסורבל ולא מדויק. יתר על כן, היעדר פרמטרים דינמיים, כגון משך מחזור הצעדים או תיאום בתזמון רגליים, מגביל את יישומיו; ואכן, פרמטרים דינמיים אלה ניתן לרכוש רק על ידי ניתוח פריים אחר פריים קטעי וידאו של מכרסמים הולכים על משטח שקוף. עבור מחקרי SCI, החוקרים ניתחו התנהגות הליכה מנקודת מבט רוחבית באמצעות הליכון, כולל שחזור מחזור הצעדים ומדידת השינויים הזוויתיים של כל מפרק רגל 4,20,21. למרות שגישה זו יכולה להיות אינפורמטיבית ביותר6, היא נשארת ממוקדת בקבוצה ספציפית של גפיים וחסרה תכונות הליכה נוספות, כגון קואורדינציה.
כדי למלא את הפערים הללו, פיתחו המרס ועמיתיו מבחן כמותי המבוסס על חיישן מגע אופטי באמצעות fTIR (fTIR)22 מתוסכל. בשיטה זו, האור מתפשט דרך זכוכית באמצעות השתקפות פנימית, מתפזר בלחיצת כפות, ולבסוף נלכד על ידי מצלמה במהירות גבוהה. לאחרונה, גרסת קוד פתוח של שיטה זו, בשם MouseWalker, הפכה זמינה, וגישה זו משלבת מסלול fTIR עם חבילת תוכנת מעקב וכימות23. באמצעות שיטה זו, המשתמש יכול לחלץ קבוצה גדולה של פרמטרים כמותיים, כולל דפוסי צעד, מרחב והליכה, מיקום טביעת רגל ותיאום גפיים קדמיות-אחוריות, כמו גם פלטים חזותיים, כגון דפוסי טביעת רגל (המחקים את בדיקת כף הדיו6) או שלבי עמידה ביחס לציר הגוף. חשוב לציין, בשל אופי הקוד הפתוח שלו, ניתן לחלץ פרמטרים חדשים על ידי עדכון חבילת הסקריפט של MATLAB.
כאן, ההרכבה שפורסמה בעבר של מערכת MouseWalker23 מתעדכנת. תיאור כיצד להגדיר אותו מסופק, עם כל השלבים הנדרשים כדי להשיג את איכות הווידאו הטובה ביותר, תנאי מעקב ורכישת פרמטרים. כלים נוספים לאחר הכימות משותפים גם כדי לשפר את הניתוח של ערכת נתוני הפלט של MouseWalker (MW). לבסוף, התועלת של כלי זה מודגמת על ידי קבלת ערכים הניתנים לכימות עבור ביצועים מוטוריים כלליים, במיוחד מחזורי צעדים ותיאום גפיים קדמיות-אחוריות, בהקשר של פגיעה בחוט השדרה (SCI).
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן, הפוטנציאל של שיטת MouseWalker מודגם על ידי ניתוח התנהגות לוקומוטורית לאחר SCI. הוא מספק תובנות חדשות לגבי שינויים ספציפיים בדפוסי דריכה, טביעת רגל והליכה שאחרת היו מתפספסים במבחנים סטנדרטיים אחרים. בנוסף לאספקת גרסה מעודכנת של חבילת MW, כלי ניתוח נתונים מתוארים גם באמצעות סקריפטים Python שסופק?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים ללאורה טאקר ונטשה לונקרביץ’ על הערותיהם על כתב היד ועל התמיכה שניתנה על ידי מתקן המכרסמים של המכון המולקולרי לרפואה ז’ואאו לובו אנטונס. המחברים רוצים להודות על תמיכה כספית מ- Prémios Santa Casa Neurociências – Prize Melo e Castro for Spinal Cord Injury Research (MC-36/2020) ל- L.S. ו- C.S.M. עבודה זו נתמכה על ידי Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) (PTDC/BIA-COM/0151/2020), iNOVA4Health (UIDB/04462/2020 ו- UIDP/04462/2020) ו- LS4FUTURE (LA/P/0087/2020) ל- C.S.M. L.S. נתמכה על ידי חוזה חוקר ראשי פרטני של CEEC (2021.02253.CEECIND). A.F.I. נתמך על ידי מלגת דוקטורט מ FCT (2020.08168.BD). A.M.M. נתמך על ידי מלגת דוקטורט מ- FCT (PD/BD/128445/2017). I.M. נתמך על ידי מלגת פוסט-דוקטורט מ-FCT (SFRH/BPD/118051/2016). D.N.S. נתמך על ידי מלגת דוקטורט מ- FCT (SFRH/BD/138636/2018).
Materials
| 45º Mirror | |||
| 2 aluminum extrusion (2 x 2 cm), 16 cm height, 1 on each side | Misumi | ||
| 2 aluminum extrusion (2 x 2 cm), 23 cm, @ 45° , 1 on each side | Misumi | ||
| 1 aluminum extrusion (2 x 2 cm), 83 cm long | Misumi | ||
| 87 x 23 cm mirror | General glass supplier | ||
| black cardboard filler | General stationery supplier | We used 2, one with 69 x 6 cm and another with 69 x 3cm to limit the reflection on the mirror | |
| Background backlight | |||
| 109 x 23 cm plexiglass (0.9525 cm thick) | General hardware supplier | ||
| 2 lateral aluminum extrusion (4 x 4 cm), 20 cm long, 1 on each side | Misumi | ||
| multicolor LED strip | General hardware supplier | ||
| white opaque paper to cover the plexyglass | General stationery supplier | ||
| fTIR Support base and posts | |||
| 2 aluminum extrusion (4 x 4 cm), 100 cm height | Misumi | ||
| 60 x 30 cm metric breadboard | Edmund Optics | #54-641 | |
| M6 12 mm screws | Edmund Optics | ||
| M6 hex nuts and wahers | Edmund Optics | ||
| fTIR Walkway | |||
| 109 x 8.5 cm plexyglass (1.2 cm thick) | General hardware supplier | 109 x 8.5 cm plexyglass (1.2 cm thick) | |
| 109 cm long Base-U-channel aluminum with 1.6 cm height x 1.9 cm depth thick folds (to hold the plexyglass) | General hardware supplier | ||
| 2 lateral aluminum extrusion (4 x 4 cm) 20 cm length, 1 on each side | Misumi | ||
| black cardboard filler | General stationery supplier | we used 2 fillers on each side to cover the limits of the plexyglass, avoiding bright edges | |
| 12 mm screws | Edmund Optics | M6 | |
| High speed camera (on a tripod) | |||
| Blackfly S USB3 | Blackfly | USB3 | This is a reccomendation. The requirement is to record at least 100 frames per second |
| Infinite Horizon Impactor | |||
| Infinite Horizon Impactor | Precision Systems and Instrumentation, LLC. | ||
| Lens | |||
| Nikkon AF Zoom-Nikkor 24-85mm | Nikkon | 2.8-4D IF | This lens is reccomended, however other lens can be used. Make sure it contains a large aperture (i.e., smaller F-stop values), to capture fTIR signals |
| Software | |||
| MATLAB R2022b | MathWorks | ||
| Python 3.9.13 | Python Software Foundation | ||
| Anaconda Navigator 2.1.4 | Anaconda, Inc. | ||
| Spyder 5.1.5 | Spyder Project Contributors | ||
| Walkway wall | |||
| 2 large rectagular acrilics with 100 x 15 cm | Any bricolage convenience store | ||
| 2 Trapezian acrilic laterals with 6-10 length x 15 cm height | Any bricolage convenience store | ||
| GitHub Materials | |||
| Folder name | URL | ||
| Boxplots | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Boxplots | Script to create Boxplots | |
| Docs | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Docs | Additional documents | |
| Heatmap | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Heatmaps | Script to create heatmap | |
| Matlat script | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Matlab%20Script | MouseWalker matlab script | |
| PCA | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/PCA%20plots | Script to perform Principal Component Analysis | |
| Raw data Plots | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Rawdata%20Plots | Script to create Raw data plots | |
| Residual Analysis | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Residual_Analysis | Code to compute residuals from Raw data |
Referencias
- Frigon, A. The neural control of interlimb coordination during mammalian locomotion. Journal of Neurophysiology. 117 (6), 2224-2241 (2017).
- Grillner, S. Biological pattern generation: The cellular and computational logic of networks in motion. Neuron. 52 (5), 751-766 (2006).
- Dominici, N., et al. locomotor primitives in newborn babies and their development. Science. 334 (6058), 997-999 (2011).
- Courtine, G., et al. Kinematic and EMG determinants in quadrupedal locomotion of a non-human primate (Rhesus). Journal of Neurophysiology. 93 (6), 3127-3145 (2005).
- Clarac, F., Cattaert, D., le Ray, D. Central control components of a ‘simple’ stretch reflex. Trends Neuroscience. 23 (5), 199-208 (2000).
- Squair, J. W., Gautier, M., Sofroniew, M. V., Courtine, G., Anderson, M. A. Engineering spinal cord repair. Current Opinion in Biotechnology. 72, 48-53 (2021).
- Wenger, N., et al. Spatiotemporal neuromodulation therapies engaging muscle synergies improve motor control after spinal cord injury. Nature Medicine. 22 (2), 138-145 (2016).
- Grillner, S. The spinal locomotor CPG: A target after spinal cord injury. Progress in Brain Research. 137, 97-108 (2002).
- Boulain, M., et al. Synergistic interaction between sensory inputs and propriospinal signalling underlying quadrupedal locomotion. Journal of Physiology. 599 (19), 4477-4496 (2021).
- Skarlatou, S., et al. Afadin signaling at the spinal neuroepithelium regulates central canal formation and gait selection. Cell Reports. 31 (10), 107741 (2020).
- Viala, D., Vidal, C. Evidence for distinct spinal locomotion generators supplying respectively fore-and hindlimbs in the rabbit. Brain Research. 155 (1), 182-186 (1978).
- Silver, J., Miller, J. H. Regeneration beyond the glial scar. Nature Reviews Neuroscience. 5 (2), 146-156 (2004).
- Basso, D. M., Beattie, M. S., Bresnahan, J. C. A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats. Journal of Neurotrauma. 12 (1), 1-21 (1995).
- Basso, D. M., et al. Basso mouse scale for locomotion detects differences in recovery after spinal cord injury in five common mouse strains. Journal of Neurotrauma. 23 (5), 635-659 (2006).
- Jones, B. J., Roberts, D. J. The quantitative measurement of motor inco-ordination in naive mice using an accelerating rotarod. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 20 (4), 302-304 (1968).
- Metz, G. A., Whishaw, I. Q. The ladder rung walking task: A scoring system and its practical application. Journal of Visualized Experiments. (28), e1204 (2009).
- Metz, G. A., Whishaw, I. Q. Cortical and subcortical lesions impair skilled walking in the ladder rung walking test: A new task to evaluate fore-and hindlimb stepping, placing, and coordination. Journal of Neuroscience Methods. 115 (2), 169-179 (2002).
- Wallace, J. E., Krauter, E. E., Campbell, B. A. Motor and reflexive behavior in the aging rat. Journal of Gerontology. 35 (3), 364-370 (1980).
- Carter, R. J., et al. Characterization of progressive motor deficits in mice transgenic for the human Huntington’s disease mutation. The Journal of Neuroscience. 19 (8), 3248-3257 (1999).
- Leblond, H., L’espérance, M., Orsal, D., Rossignol, S. Behavioral/systems/cognitive treadmill locomotion in the intact and spinal mouse. The Journal of Neuroscience. 23 (36), 11411-11419 (2003).
- Courtine, G., et al. Recovery of supraspinal control of stepping via indirect propriospinal relay connections after spinal cord injury. Nature Medicine. 14 (1), 69-74 (2008).
- Hamers, F. P. T., Koopmans, G. C., Joosten, E. A. J. CatWalk-assisted gait analysis in the assessment of spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 23 (3-4), 537-548 (2006).
- Mendes, C. S., et al. Quantification of gait parameters in freely walking rodents. BMC Biology. 13 (1), 50 (2015).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Stauch, K. L., et al. Applying the ratwalker system for gait analysis in a genetic rat model of Parkinson’s disease. Journal of Visualized Experiments. (167), e62002 (2021).
- Mendes, C. S., Rajendren, S. V., Bartos, I., Márka, S., Mann, R. S. Kinematic responses to changes in walking orientation and gravitational load in Drosophila melanogaster. PLoS One. 9 (10), e109204 (2014).
- Cabrita, A., et al. Motor dysfunction in Drosophila melanogaster as a biomarker for developmental neurotoxicity. iScience. 25 (7), 104541 (2022).
- Bishop, C. M. . Pattern Recognition and Machine Learning. , (2006).
- vander Maaten, L., Postma, E., vanden Herik, J. . Dimensionality reduction: A comparative review. , (2009).
- Courtine, G., et al. Performance of locomotion and foot grasping following a unilateral thoracic corticospinal tract lesion in monkeys (Macaca mulatta). Brain. 128 (10), 2338-2358 (2005).
- Drew, T., Jiang, W., Kably, B., Lavoie, S. Role of the motor cortex in the control of visually triggered gait modifications. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 74 (4), 426-442 (1996).
- Cheng, H., et al. Gait analysis of adult paraplegic rats after spinal cord repair. Experimental Neurology. 148 (2), 544-557 (1997).
- Thibaudier, Y., et al. Interlimb coordination during tied-belt and transverse split-belt locomotion before and after an incomplete spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 34 (9), 1751-1765 (2017).
- Bellardita, C., Kiehn, O. Phenotypic characterization of speed-associated gait changes in mice reveals modular organization of locomotor networks. Current Biology. 25 (11), 1426-1436 (2015).
- Machado, A. S., Marques, H. G., Duarte, D. F., Darmohray, D. M., Carey, M. R. Shared and specific signatures of locomotor ataxia in mutant mice. eLife. 9, 55356 (2020).
- Takeoka, A., Vollenweider, I., Courtine, G., Arber, S. Muscle spindle feedback directs locomotor recovery and circuit reorganization after spinal cord injury. Cell. 159 (7), 1626-1639 (2014).
