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Biología

Direktinfusionsgerät zur Molekülabgabe in Pflanzen

Published: June 02, 2023
doi:
10.3791/65194
, , , , , ,
1United States Department of Agriculture Agricultural Research Service U.S. Horticultural Research Laboratory, 2Agrosource Incorporated

Summary

Dieses Manuskript beschreibt ein neuartiges direktes Pflanzeninfusionsgerät zum Screening der Wirksamkeit von Molekülen gegen das Bakterium (Candidatus Liberibacter asiaticus) oder seinen Insektenvektor (Diaphorina citri, Kuwayama), die in Kombination mit der Huanglongbing-Zitruskrankheit assoziiert sind.

Abstract

Die Überprüfung der Funktion von therapeutischen Wirkstoffen in Pflanzen ist ein wichtiger Bestandteil der Agrarforschung. Blatt- und Bodentränkungsmethoden sind Routine, haben aber Nachteile, einschließlich der variablen Aufnahme und des Abbaus der getesteten Moleküle in der Umwelt. Die Stamminjektion von Bäumen ist gut etabliert, aber die meisten Methoden dafür erfordern teure, proprietäre Geräte. Um verschiedene Behandlungen für Huanglongbing zu untersuchen, wird eine einfache und kostengünstige Methode benötigt, um diese Verbindungen in das Gefäßgewebe von kleinen Zitrusbäumen zu bringen, die mit dem Phloem-begrenzten Bakterium Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) infiziert sind oder mit dem Phloem-fressenden CLas-Insektenvektor Diaphorina citri Kuwayama (D. citri) befallen sind.

Um diese Screening-Anforderungen zu erfüllen, wurde ein Gerät für die direkte Pflanzeninfusion (DPI) entwickelt, das mit dem Stamm der Pflanze verbunden ist. Das Gerät wird mit einem 3D-Drucksystem auf Nylonbasis und leicht erhältlichen Hilfskomponenten hergestellt. Die Wirksamkeit der Wirkstoffaufnahme dieses Geräts wurde in Zitruspflanzen mit dem Fluoreszenzmarker 5,6-Carboxyfluorescein-diacetat getestet. Eine gleichmäßige Verteilung des Markers in den Pflanzen wurde routinemäßig beobachtet.

Darüber hinaus wurde dieses Gerät verwendet, um antimikrobielle und insektizide Moleküle zu verabreichen, um deren Wirkung auf CLas bzw . D. citri zu bestimmen. Das Aminoglykosid-Antibiotikum Streptomycin wurde mit dem Gerät in CLas-infizierte Zitruspflanzen eingebracht, was zu einer Reduktion des CLas-Titers von 2 Wochen auf 4 Wochen nach der Behandlung führte. Die Abgabe des Neonicotinoid-Insektizids Imidacloprid in von D. citri befallene Zitruspflanzen führte zu einem signifikanten Anstieg der Flohsterblichkeit nach 7 Tagen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass dieses DPI-Gerät ein nützliches System darstellt, um Moleküle zu Testzwecken in Pflanzen einzuschleusen und Forschungs- und Screeningzwecke zu erleichtern.

Introduction

Die Bewirtschaftung von Pflanzen in gewerblichen und landschaftlichen Umgebungen erfordert häufig den Einsatz chemischer Verbindungen, um das Wachstum und die Gesundheit der Pflanzen zu optimieren. Wie diese Moleküle abgegeben werden, hängt von der Art des Moleküls, der Funktion des Moleküls, der Art der Pflanze und dem vorhandenen Managementsystem ab. Blatt- und Bodenanwendungen sind die einfachsten Verabreichungsstrategien, aber Einschränkungen bei der Aufnahme einiger Moleküle erfordern eine direkte Verabreichung. Ein Beispiel für diese Moleküle sind therapeutische Moleküle, die am besten funktionieren, wenn sie sich systemisch innerhalb der Pflanze bewegen, aber durch einfache topische Anwendungen nicht effektiv abgegeben werden können1. Dies ist der Fall bei Huanglongbing (HLB), auch Citrus-Greening-Krankheit genannt. HLB ist eine Krankheit, die mit einem Phloem-begrenzten Bakterium, Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas), das nicht außerhalb der Pflanze kultiviert werden kann, oder seinem Insektenvektor, Diaphorina citri Kuwayama (D. citri)2, assoziiert ist.

Wenn es sich bei den vermeintlichen therapeutischen Molekülen um Genprodukte handelt, können sie getestet werden, indem transgene Pflanzen erzeugt werden, die diese Verbindungen exprimieren. Die transgene Pflanzenproduktion kann jedoch zeit- und ressourcenintensiv sein, ist stark genotypabhängig und kann durch Genstilllegung gehemmt werden3. Selbst wenn diese Transgene vielversprechende Ergebnisse zeigen, verringern regulatorische und öffentliche Wahrnehmungsbeschränkungen die Wahrscheinlichkeit ihrer kommerziellen Akzeptanz 4,5. Die exogene Anwendung von Verbindungen vereinfacht jedoch die Prüfung biologischer und synthetischer Moleküle, da sie nicht die Produktion stabiler oder transient exprimierender transgener Pflanzen erfordert, was den Zeit- und Ressourcenaufwand für die Prüfung der Wirkung eines Moleküls reduziert. Eine Methode zur effektiven und effizienten systemischen Verabreichung exogener Verbindungen durch Pflanzen könnte für eine Vielzahl von Forschungs- und Screening-Zwecken eingesetzt werden.

Eine dieser Anwendungen ist die Analyse der systemischen Molekülbewegung innerhalb des Gefäßsystems einer Pflanze, die mit verfolgbaren Markern durchgeführt werden kann, unabhängig davon, ob es sich um fluoreszierende, sichtbare oder einzigartige chemische Isotopehandelt 6,7,8,9. Ein häufig verwendeter Fluoreszenzmarker ist 5,6-Carboxyfluorescein-diacetat (CFDA), ein membrandurchlässiger Farbstoff, der von intrazellulären Esterasen zu 5,6-Carboxyfluorescein (CF) abgebaut wird und anschließend fluoreszierend und membranundurchlässig wird10. CFDA wurde in großem Umfang zur Überwachung des Phloemtransports, der Senken- und Quellbeziehungen sowie der Gefäßmuster im Pflanzengewebe eingesetzt11,12.

Zusätzlich zu diesen Markern können bestimmte Verbindungen die Physiologie der Pflanze direkt verändern, um die Produktivität zu steigern oder die Pflanze im Falle von Herbiziden abzutöten. Sowohl Insektizide als auch antimikrobielle Verbindungen sind ein Mittel zur Steigerung der Pflanzenproduktivität, insbesondere in Gegenwart von HLB. Ein Beispiel für ein antimikrobielles Molekül, das zur Kontrolle von CLas eingesetzt wird, ist Streptomycin. Streptomycin ist ein Aminoglykosid-Antibiotikum, das ursprünglich aus Streptomyces griseus isoliert wurde und nachweislich das Bakterienwachstum durch die Hemmung der Proteinbiosynthese hemmt13. In Bezug auf Insektizide ist das Hauptziel der HLB-Forschung D. citri, das CLas von Baum zu Baum überträgt14. Zu diesem Zweck werden häufig Neonicotinoide wie Imidacloprid verwendet, da sie der Goldstandard für die Bekämpfung von Schadinsekten sind15. All diese vielfältigen Einsatzmöglichkeiten sind wichtige Aspekte aktueller Anlagenmanagementstrategien, und die Entwicklung neuartiger Produkte hängt von effizienten Screening-Assays ab.

Eine Methode, die für die Einbringung von Verbindungen in Gehölze verwendet wird, ist die direkte Injektion in den Stamm. Es wurde eine Vielzahl von Systemen entwickelt, die sich in ihren Anforderungen an vorgebohrte Injektionsstellen unterscheiden, und diese Systeme verwenden entweder eine druckbasierte Injektion oder einen passiven Durchfluss16. Obwohl druckbasierte Systeme das schnelle Einbringen einer bestimmten Verbindung ermöglichen, muss die potenzielle physikalische Schädigung berücksichtigt werden, die durch das Drücken von Flüssigkeit durch blockierte oder embolisierte Gefäße verursacht wird17. Obwohl die Blatt- oder Drench-Anwendung von Verbindungen weniger zeitintensiv durchzuführen ist, verringert die direkte Pflanzeninjektion die Verschwendung der interessierenden Verbindung aufgrund von Verlusten an die Luft oder den Boden und kann auch die Zeit verlängern, in der sich Verbindungen in einem aktiven Zustand befinden, indem die Exposition gegenüber der äußeren Umgebung verringertwird 18. Beide Aspekte sind wichtig, um teure Reagenzien zu konservieren und die Konsistenz zwischen den Replikaten in Forschungsumgebungen zu gewährleisten.

Diese Studie beschreibt das Design, den Bau und die Verwendung eines innovativen Geräts zur direkten Pflanzeninfusion (DPI), mit dem beurteilt werden kann, wie sich die interessierenden Verbindungen auf eine Wirtspflanze auswirken. Ein Standard-3D-Drucker wurde verwendet, um sowohl das Gerät selbst als auch mehrere Komponenten herzustellen, die mit seiner Konstruktion verbunden sind. Diese hauseigene Bauweise ermöglicht es den Forschern, das Gerät und die Gerätekomponenten an ihre spezifischen experimentellen Anforderungen anzupassen, und verringert die Abhängigkeit von kommerziell erhältlichen Pflanzeninjektionsgeräten. Die Einrichtung des Geräts ist einfach und effizient, und alle Zusatzkomponenten sind sofort verfügbar und kostengünstig. Obwohl das System für den Einsatz mit einer Vielzahl von Pflanzenarten konzipiert wurde, beziehen sich die hier vorgestellten Beispiele auf Zitruspflanzen im Topf. Darüber hinaus zeigt diese Studie, dass dieses Gerät in der Lage ist, mehrere Arten von Verbindungen systematisch an junge Zitruspflanzen zu verabreichen, ohne Letalität zu verursachen. Zu den getesteten Verbindungen gehörten CFDA, das zur Beurteilung der Wirkstoffverteilung in der Pflanze verwendet wurde, sowie Streptomycin und Imidacloprid, die verwendet wurden, um zu überprüfen, ob die antimikrobiellen und insektiziden Wirkungen dieser Verbindungen beobachtet wurden, wenn sie über DPI verabreicht wurden.

Protocol

1. Herstellung von Zitruspflanzen für die experimentelle Injektion von Verbindungen Vermehre kleine Zitrusbäume im Topf entweder aus bewurzelten vegetativen Stecklingen oder Samen. Züchten Sie die Zitruslinien im Topf bei einer Länge von 16 h/8 h hell/dunkel und bei 28 °C. Wählen Sie Zitruspflanzen in der für das Experiment geeigneten Größe aus. Die beschriebenen Anwendungen erforderten eine Höhe zwischen 12 cm und 100 cm mit Stammdurchmessern von 4-14 mm. Wenn ein neuer Schub erforderlich ist, schneiden Sie die Pflanzen vor dem Experiment zurück. 2. Dreidimensionaler Druck des DPI-Gerätes und der Formteile Trage eine dünne Schicht Kleber auf Polyvinylacetat-Basis auf das Druckbett auf. Legen Sie Nylonfilament in den 3D-Drucker und bereiten Sie den Drucker gemäß den Anweisungen des Herstellers vor. Importieren Sie die gewünschte . STL-Datei (Ergänzungsdatei 1, Ergänzungsdatei 2, Ergänzungsdatei 3, Ergänzungsdatei 4, Ergänzungsdatei 5, Ergänzungsdatei 6, Ergänzungsdatei 7, Ergänzungsdatei 8, Ergänzungsdatei 9, Ergänzungsdatei 10, Ergänzungsdatei 11, Ergänzungsdatei 12, Ergänzungsdatei 13 und Ergänzungsdatei 14), einrichten und mit dem Drucken beginnen. Entferne das Teil vom Druckbett. Spülen Sie den Kleber auf Polyvinylacetatbasis von der Basis des gedruckten Bauteils mit Wasser ab und entfernen Sie alle Stützstrukturen. Sprühen Sie das DPI-Bauteil mit zwei Schichten Klarglanz-Sprühlack ein. 3. Herstellung der Plastisol-Ringform Bauen Sie eine Formform zusammen, die groß genug ist, um die Modellteile aufzunehmen, indem Sie ein rechteckiges Gehäuse aus zusammensteckbaren Kunststoffblöcken auf einem Sockel bauen (ergänzende Abbildung S1A). Mischen Sie das RTV-Silikonmonomer und den Katalysator im Verhältnis 10:1 und rühren Sie 1 Minute lang ohne Blasenbildung um. Färben durch Zugabe von Lebensmittelfarbe (3 Tropfen/25 ml Silikonmischung) und Handseife (1 ml Seife/25 ml Silikonmischung) (ergänzende Abbildung S1B). Gießen Sie eine dünne Schicht Silikon in die Formform, die ausreicht, um den Boden vollständig zu bedecken. Stampfen Sie, um die Oberfläche zu glätten, und warten Sie 24 Stunden, bis das Silikon ausgehärtet ist (Ergänzende Abbildung S1C). Gießen Sie wie oben beschrieben eine zweite Schicht Silikon, die tief genug ist, um den Kerndruck in der Mitte des Musters zu bedecken (sichtbar oben im Muster in der ergänzenden Abbildung S1D). Legen Sie das Muster mit dem Kerndruck in der Mitte nach unten in das flüssige Silikon ein. Stellen Sie sicher, dass keine Blasen eingeschlossen sind und dass die Muster gut getrennt sind und sich nicht berühren (ergänzende Abbildung S1E). Befestigen Sie die Muster entweder mit einem schweren Gegenstand und/oder Klebeband, um zu verhindern, dass sie beim Aushärten aus dem Silikon schwimmen. Warten Sie 24 h, bis die neu gegossene Schicht ausgehärtet ist (Ergänzende Abbildung S1F). Gießen Sie zusätzliche Schichten Silikon, bis die Ebene bündig mit der Oberseite des Musters ist. Warten Sie 24 Stunden, um auszuhärten (Ergänzende Abbildung S1G). Zerlegen Sie die zusammensteckbaren Kunststoffblöcke, um die Form zu lösen. Entfernen Sie die Muster (Ergänzungsbild S1H). Untersuchen Sie die Form auf Risse oder Verformungen (ergänzende Abbildung S1I). 4. Gießen der Plastisolringe Beschichten Sie das Innere der Form, alle Kernkomponenten und die O-Ringe mit Speiseöl (ergänzende Abbildung S2A, B). Legen Sie einen O-Ring um die Kerbe in der Mitte des mittleren Pfostenkerns und legen Sie den Kern in das mittlere Loch der Plastisolringform (ergänzende Abbildung S2C). Setzen Sie den Zuführkanalkern in das Loch an der Seite der Plastisol-Ringform ein. Richten Sie die V-förmige Spitze am Ende des Einführkanalkerns so aus, dass sie mit dem O-Ring auf dem mittleren Pfostenkern ausgerichtet ist (ergänzende Abbildung S2D, E). Erhitzen Sie Plastisol in der Mikrowelle für kurze 10-Sekunden-Stöße (ergänzende Abbildung S2F, G). Plastisol vorsichtig umrühren, um Blasen zu vermeiden (Ergänzende Abbildung S2H). Wiederholen Sie das Erhitzen und Rühren, bis die Lösung eine Temperatur zwischen 160 °C und 170 °C erreicht hat (ergänzende Abbildung S2I).ACHTUNG: Eine Überhitzung des Plastisols kann zur Freisetzung giftiger Dämpfe führen. Führen Sie den Eingriff in einem gut belüfteten Bereich oder Abzug durch. Erhitzen Sie das Plastisol nicht über 170 °C. Gießen Sie das geschmolzene Plastisol in die Plastisol-Ringform in der Nähe der Außenkante der Form, ohne Blasen einzubringen (ergänzende Abbildung S2J). Warten Sie 1 h, bis die Plastisolringe abgekühlt sind (Ergänzende Abbildung S2K). Entfernen Sie die Ringe aus der Form. Stellen Sie sicher, dass das DPI-Gerät richtig sitzt, bevor Sie es in experimentellen Assays verwenden (ergänzende Abbildung S2L). 5. Befestigung des DPI-Gerätes an der Anlage Suchen Sie eine glatte, fehlerfreie Stelle auf dem Kofferraum für die Gerätebefestigung. Vermeiden Sie Unebenheiten oder Knoten, da diese zum Auslaufen des Geräts beitragen können. Bohren Sie mit einem Bohrer mit einem Durchmesser von 2 mm ein Loch horizontal durch die Mitte des Schaftes in einem 90°-Winkel zur Stammoberfläche (ergänzende Abbildung S3A). Führen Sie den Bohrer mehrmals durch das Loch, um es zu reinigen und zu glätten, um ein ungehindertes Loch zu erzeugen (ergänzende Abbildung S3B). Erstellen Sie eine vertikale Scheibe im Plastisolring auf der gegenüberliegenden Seite des Verbindungszufuhrkanals (ergänzende Abbildung S3C). Legen Sie den Ring um die Pflanze und richten Sie den Förderkanal mit dem zuvor gebohrten Loch aus (ergänzende Abbildung S3D).Anmerkungen: Der Ring muss eng um den Kofferraum passen, um Leckagen zu vermeiden. Aus Kernbaugruppen mit unterschiedlichen Durchmessern lassen sich Plastisolringe für unterschiedlich große Pflanzenstängel herstellen. Setzen Sie das DPI-Gerät in den Plastisolring ein und stellen Sie sicher, dass sie eng zusammenpassen. Richten Sie den Auslauf des DPI-Geräts auf den Plastisolring-Zuführkanal und die Bohrung aus (ergänzende Abbildung S3E).Anmerkungen: Die Verwendung eines Bohrers zum Ausrichten des Lochs und des Auslaufs des DPI-Geräts kann hilfreich sein. Wickeln Sie das Gerät fest mit Silikonband ein, um es an Ort und Stelle zu halten (Ergänzende Abbildung S3F). Überprüfen Sie das vollständig montierte und angebrachte Gerät, um die richtige Ausrichtung und Ausrichtung auf der Anlage sicherzustellen. 6. Auftragen des Zinseszinses mit dem DPI-Gerät Verwenden Sie eine Spritze oder Pipette, um das DPI-Gerät mit der gewünschten Lösung zu füllen (ergänzende Abbildung S3G). Verwenden Sie eine Spritze, um das Silikonband und den Plastisolring auf der gegenüberliegenden Seite des DPI-Geräts zu durchdringen, um Luft aus dem inneren Kanal zu ziehen und das Eindringen von Luftblasen in das Pflanzengefäßsystem zu vermeiden (ergänzende Abbildung S3H). Setzen Sie alle extrahierten Verbindungen wieder in das DPI-Gerät ein. Füge ein zusätzliches kleines Stück Silikonklebeband über das Loch der Spritze an, um den Bereich zu verstärken und Risse zu vermeiden. Prüfen Sie das Gerät auf sichtbare Leckagen an der Befestigungsstelle und prüfen Sie den Gerätebehälter auf einen stabilen Flüssigkeitsstand.Anmerkungen: Wasser kann zunächst verwendet werden, um auf Dichtheit zu prüfen, um eine Verschwendung der Testlösung zu vermeiden. Decken Sie das offene Ende des DPI-Geräts mit Wachsversiegelungsfolie ab und ziehen Sie es nach unten, um eine Versiegelung zu bilden und die Verdunstung der Versuchsverbindung zu reduzieren. Stechen Sie mit einer Spritzenspitze ein einzelnes Loch in den Wachsfilm, um die Entwicklung eines Vakuums zu verhindern, und füllen Sie das Gerät anschließend wieder auf (ergänzende Abbildung S3I). Überprüfen Sie das Gerät täglich, um sicherzustellen, dass die Komponenten richtig ausgerichtet sind (ergänzende Abbildung S3J), und füllen Sie die Flüssigkeit mit einer Spritze auf, um ein Austrocknen des Reservoirs zu vermeiden. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis die gewünschte Menge an experimenteller Lösung eingebracht wurde.HINWEIS: Verbindungen können bis zu 1 Monat lang erfolgreich von einem bestimmten Produkt eingeführt werden. Lösungsaufnahmedauern, die diesen Zeitraum überschreiten, sollten vor dem Versuchsaufbau empirisch überprüft werden. 7. Verwendung von CFDA zur Beobachtung von Gefäßbewegungen bei Zitruspflanzen Befestigen Sie das DPI-Gerät an 25 cm hohen Zitronatzitronenpflanzen (Citrus medica L.), tragen Sie eine einzelne 2,0-ml-Behandlung mit entweder 20 % DMSO inH2O-Kontrolleoder CFDA auf das DPI-Gerät auf und lassen Sie es 24 Stunden lang aufnehmen. Um diesem Protokoll zu folgen, bereiten Sie die funktionierende CFDA-Lösung vor, indem Sie 1,6 mlH2Ozu 400 μl CFDA-Stammlösung hinzufügen (die Stammlösung enthält 10 mM CFDA, gelöst in 100 % Dimethylsulfoxid [DMSO]), um eine endgültige CFDA-Konzentration von 2 mM und 20 % DMSO zu erzeugen. Machen Sie Querschnitte durch verschiedene Gewebe der Pflanze und verwenden Sie ein Stereoskop oder ein zusammengesetztes Mikroskop mit einem Fluoreszenzfilter, der die Wellenlänge von 498 nm enthält, um die CFDA im Pflanzengewebe sichtbar zu machen. Vergleichen Sie die Bilder mit dem 20%igen DMSOin H2O-Kontrollen, um die Autofluoreszenz im Gewebe zu berücksichtigen. 8. Messung von Veränderungen des CLas-Titers in Blattproben nach Streptomycin-Behandlung Sammeln Sie mit 0,75 m hohen, im Gewächshaus gezüchteten CLas-infizierten Valencia-Pflanzen (Citrus sinensis (L .) Osbeck “Valencia”) den Blattstiel und die Mittelrippe von zwei HLB-symptomatischen Blättern von jeder Pflanze, hacken Sie sie in kleine Abschnitte, fassen Sie jeden Gewebetyp zusammen und lagern Sie sie separat in schlagfesten 2-ml-Probenröhrchen, die eine Stahlkugel mit einem Durchmesser von 6,35 mm enthalten. Mahlen Sie die Probe mit einem Homogenisator, der für zwei 15-Sekunden-Zyklen mit 3,4 m/s programmiert ist. Extrahieren Sie die gesamte Nukleinsäure wie zuvor beschrieben19. Führen Sie eine qPCR an den CLas-infizierten Blattproben durch, indem Sie die in Tabelle 1 definierte qPCR-Mischung und die in Tabelle 2 definierten Reaktionsbedingungen verwenden. Verwenden Sie Pflanzen mit robusten CLas-Infektionen (robuste Infektion ist im Allgemeinen definiert als qPCR-basierte Ct-Werte < 30 für das CLas 16S LasLong (LL)-Primer-Set) für die weitere Analyse.HINWEIS: Der bakterielle Titer wird unter Verwendung von CLas 16S Las Long (LL) und Citrus-Dehydrin-DNA-Primern geschätzt, um die relativen Genomäquivalente zu schätzen, wie zuvor beschrieben20. Rüsten Sie die Zitruspflanzen, die den oben beschriebenen Mindestinfektionstiter erfüllen, mit DPI-Geräten aus und unterziehen Sie sie einer einmaligen Behandlung mit 2,0 mlH2O-Lösungoder Streptomycin-Lösung in der gewünschten Konzentration. Um diese Studie zu verfolgen, verwenden Sie eine einzige 2,0-ml-Behandlung mit 9,5 mg/ml (insgesamt 19 mg) Streptomycin, gelöst inH2O. Sammeln Sie Blattproben 7 Tage, 14 Tage und 28 Tage nach der Behandlung. Untersuchen Sie die beprobten Blätter auf den CLas-Titer unter Verwendung desselben Protokolls wie oben beschrieben. Machen Sie 60 Tage nach der Behandlung Fotos der Pflanzen, die mit H2O oder Streptomycin behandelt wurden. Verwenden Sie visuelle Beobachtungen der CLas-Infektion, um den Schweregrad der Infektion zu bewerten. Achten Sie auf <50 % der Blätter, die intervenale Chlorose und Venenverkorkung zusammen mit Blattspülungen als Anzeichen einer leichten Infektion aufweisen, und auf mehr als 50 % der Blätter mit intervenaler Chlorose und Venenverkorkung sowie Blattabszession und Wachstumsverzögerung der Pflanze als Anzeichen für schwerere Infektionen. 9. Messung der Mortalität von D. citri nach Behandlung mit Imidacloprid Schneiden Sie 0,5 m hohe Zitronatzitronenpflanzen (Citrus medica L.) auf eine Höhe von 12 cm zurück, um das Wachstum neuer Schübe zu fördern.Anmerkungen: Die Geschwindigkeit des Flush-Wachstums kann von der Pflanzengesundheit und der Jahreszeit abhängen. Berücksichtigen Sie dies also bei der Versuchsplanung. Nachdem sich >6 Spülungen mit einer Länge von 1-2 cm entwickelt haben, setzen Sie die Pflanzen in Käfige mit ausgewachsenen D. citri ein. Lassen Sie die Pflanzen 24 Stunden lang in den Käfigen, damit sich die Eier ablegen können. Führen Sie 1-2 Tage nach dem Legen repräsentative Eierzählungen an drei Spültrieben durch und wenden Sie anschließend die DPI-Geräte an. Füllen Sie diese Geräte mit 2,0 ml einer Wasserkontrolle oder der gewünschten Konzentration von Imidacloprid (21,8 % Wirkstoff). Um dieses Protokoll zu befolgen, verwenden Sie 528 μl/l, 52,8 μl/l und 5,28 μl/l Imidacloprid.HINWEIS: Die Anzahl der Eier ist ein destruktives Maß, daher werden die Zählungen in dieser Phase verwendet, um die Anzahl der Eier auf der ungezählten Spülung derselben Pflanze zu schätzen und eine Grundlage für die nachfolgenden Nymphenschlüpfzählungen zu schaffen, die am Ende des Experiments durchgeführt werden. Erfassen Sie die D. citri-Auflaufrate an mindestens drei der verbleibenden Flush-Triebe . Erfassen Sie repräsentative Pflanzenfotos 7 Tage nach der Einführung der Verbindung.

Representative Results

Komponenten des DirektinfusionsgerätsDie Basisversion des Direktinfusionsgeräts ist 8 cm hoch und vorne und seitlich 3,3 cm breit (Abbildung 1A). Es enthält ein einzelnes zentrales Reservoir, das an den Ausguss angrenzt, und das Gesamtvolumen, das in diesen Komponenten enthalten sein kann, beträgt 2,0 ml (Abbildung 1D). Der Plastisolring ist 1,8 cm hoch und hat einen Durchmesser von 2,7 cm (Abbildung 1C). Dieser Ring enthält auch zwei Kanäle: einen für die Aufnahme des Auslaufs des DPI-Geräts und einen weiteren mit variablem Durchmesser, der um den Stamm des zu behandelnden Baumes passt. Darüber hinaus gibt es eine Rille um den vertikalen Kanal, um die überschüssige Behandlung in die Umgebung des Baumes zu leiten, was eine zusätzliche Aufnahme der Verbindung durch die Rinde ermöglicht (Abbildung 1F). Bei richtiger Montage sollte der Plastisolring bündig mit dem DPI-Gerät abschließen und der Ausguss sollte mit dem in den Baum gebohrten Loch ausgerichtet sein (Abbildung 1B und Abbildung 1E). CFDAUm die Wirksamkeit des DPI-Geräts zur Einbringung exogener Chemikalien in Zitruspflanzen zu untersuchen, wurden 2,0 ml 2 mM CFDA mit dem Gerät infiltriert. Ein Fluoreszenzsignal wurde im Gefäßsystem der behandelten Pflanze detektiert (Abbildung 2A), fehlte jedoch in den Kontrollpflanzen, die mit 20% DMSO inH2Obehandelt wurden (Abbildung 2B). Dieses Signal wurde in allen präparierten Pflanzengewebetypen beobachtet, einschließlich des Blattmesophylls, des Blattstielgefäßes, des Stammgefäßsystems und des Wurzelgefäßsystems (Abbildung 2C). Dieses Signal wurde in der Pflanze innerhalb von 24 Stunden nach der Behandlung beobachtet und war relativ gleichmäßig im Gewebe verteilt. StreptomycinUm zu testen, ob die eingeführten Verbindungen eine therapeutische Wirkung auf die HLB-Krankheit haben, wurden 2,0 ml einer bakteriziden Verbindung, Streptomycin, in CLas-positive Valencia (Citrus sinensis) Süßorangenpflanzen in einer Konzentration von 9,5 mg/ml (insgesamt 19 mg) eingebracht. Diese Pflanzen wurden in Gewächshaustöpfen gehalten, und der CLas-Titer (gemessen anhand von CLas-Genomäquivalenten pro Zitrusgenomäquivalent) wurde im Laufe der Zeit mittels qPCR überwacht (Abbildung 3A). Die anfänglichen durchschnittlichen DNA-CLas-Titer für die mit Streptomycin und H2O behandelten Pflanzen betrugen 0,562 CLas-Genom/Zitrusgenom bzw. 0,49 CLas-Genom/Zitrusgenom. Eine Verringerung des mittleren Bakterientiters wurde mittels qPCR 7-28 Tage nach Streptomycin-Behandlung im Vergleich zu denH2O-Kontrollenzum gleichen Zeitpunkt nachgewiesen. Darüber hinaus betrug die Differenz zwischen dem Zeitpunkt 0 und dem Tag 28 der mittleren bakteriellen Titer 0,314 bzw. 0,117 für mit Streptomycin behandelte Pflanzen bzw. H2O-behandelte Pflanzen. Dieses Experiment wurde entwickelt, um die Reaktion der Pflanze auf verschiedene Behandlungen über verschiedene Zeiträume hinweg zu messen. Es wurde ein zweifaktorielles quadratisches Response-Surface-Design verwendet, wobei die Zeit als quantitativer diskreter Faktor mit vier Stufen (0 Tage, 7 Tage, 14 Tage und 28 Tage) und die Behandlung als kategorialer Faktor mit zwei Stufen (H2O und Streptomycin) behandelt wurde. Für jede der acht Behandlungskombinationen wurden fünf Replikate verwendet, wobei der CLas-Titer als Ansprechvariable gemessen wurde. Die Daten wurden mit log10 basierend auf einer Box-Cox-Plot-Analyse transformiert. Die Modellreduktion erfolgte durch Vorwärtsselektion unter Verwendung des Informationskriteriums (AICc)21 von Akaike, was dazu führte, dass sowohl die Zeit- als auch die Interaktionseffekte entfernt wurden. Der verbleibende Faktor, die Behandlung, war signifikant (p = 0,0252), wobei die mit Streptomycin behandelten Pflanzen über alle Zeitpunkte zusammen einen niedrigeren mittleren CLas-Titer (0,349) aufwiesen als die mitH2O behandelten Pflanzen (0,496) (Abbildung 3B). Diese Verringerung des CLas-Titers korrespondierte mit gelegentlichen Anstiegen des neuen gesunden Schubwachstums nach 60 Tagen in den mit Streptomycin behandelten Pflanzen, wie Fotos von repräsentativen Bäumen belegen, die mit H2O (Abbildung 3C) im Vergleich zu 19 mg Streptomycin behandelt wurden (Abbildung 3D). ImidaclopridImidacloprid wurde mit dem DPI-Gerät in juvenile asiatische Zitrus-Psyllide (ACP)-befallene Zitronatzitronenpflanzen eingeführt, um sein Potenzial als insektiziden D. citri-Screening-Assay zu testen. Eine einzelne 2,0-ml-Behandlung mit einer handelsüblichen Imidacloprid-Insektizidlösung wurde in drei verschiedenen Konzentrationen (5,28 μl/l, 52,8 μl/l und 528 μl/l) zusammen mit einer Wasserkontrolle getestet. Die durchschnittliche Gesamtzahl der Eier pro drei Triebe vor der Behandlung lag zwischen 280,5 und 321, und es gab keine signifikanten Unterschiede zwischen den Pflanzen, die für jede Behandlungsgruppe verwendet werden sollten (Abbildung 4A). Die durchschnittliche Gesamtzahl der überlebenden Nymphen an drei Flush-Trieben 7 Tage nach der Behandlung betrug 293,75, 268, 97,5 und 2 für die Wasserkontrolle und 5,28 μL/L, 52,8 μL/L bzw. 528 μL/L Imidacloprid-Lösungen (Abbildung 4B). Dies bedeutete eine signifikante Verringerung des Auftretens von Psyllidennympphen bei 52,8 μL/L (p = 0,029) und 528 μL/L (p = 0,002) Imidacloprid-Lösung im Vergleich zur Wasserkontrolle gemäß einer Einfaktor-ANOVA gefolgt von einer Tukey-Post-hoc-Analyse. Darüber hinaus wurde dieser Anstieg der Sterblichkeit von Psyllidennymphen bei der höchsten Imidacloprid-Lösungskonzentration visuell durch die Verringerung der Nymphenhonigtauproduktion auf den mit Imidacloprid behandelten Linien (Abbildung 4D) im Vergleich zur Wasserkontrolle (Abbildung 4C) deutlich. Abbildung 1: Die direkte Pflanzeninfusionsvorrichtung und der Plastisolring. (A) Die intakte direkte Pflanzeninfusionsvorrichtung und (C) der Plastisolring zusammen mit ihren Abmessungen. (B) Die direkte Pflanzeninfusionsvorrichtung und der Plastisolring, die mit einem Zitrusbaum verbunden und befestigt sind. Vertikale Querschnitte der (D) direkten Pflanzeninfusionsvorrichtung, (F) Plastisolring und (E) dieser beiden Komponenten, die mit einem Zitrusbaum verbunden und befestigt sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Abbildung 2: Querschnitt durch die Blattmittelrippe einer 25 cm großen Zitruspflanze. Die Bilder zeigen 24 Stunden nach der Behandlung mit (A) 2 mM CFDA oder (B) 20 % DMSO inH2Ounter Verwendung des direkten Pflanzeninfusionsgeräts. (C) Querschnitte verschiedener Pflanzengewebe 24 h nach 2 mM CFDA-Behandlung, einschließlich des Stammes 5 cm über der direkten Pflanzeninfusionsvorrichtung (oben links), des Stammes 5 cm unterhalb der direkten Pflanzeninfusionsvorrichtung (Mitte links), der Wurzel (unten links), der Blattmittelrippe (oben rechts), des Blattstiels (Mitte rechts) und des Blattmesophylls (unten rechts). Maßstabsbalken = 1 mm. Abkürzungen: CFDA = 5,6-Carboxyfluorescein-diacetat; DMSO = Dimethylsulfoxid. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Abbildung 3: Überwachung des CLas-Titers (gemessen anhand von CLas-Genomäquivalenten pro Zitrusgenomäquivalent) über die Zeit mittels qPCR. (A) Zeitverlauf mit Veränderungen des CLas-DNA-Titers im Vergleich der fünf Pflanzen, die mit 19 mg Streptomycin behandelt wurden, mit den fünf Pflanzen, die mit einerH2O-Kontrollebehandelt wurden. Die Punkte stellen den Durchschnitt für eine bestimmte Behandlung zu einem bestimmten Zeitpunkt dar. Die Fehlerbalken stellen den Standardfehler des Mittelwerts dar. (B) Balkendiagramm mit dem mittleren CLas-Titer derH2-O- und Streptomycin-behandelten Pflanzen über alle Zeitpunkte. Die Fehlerbalken stellen das 95%-Konfidenzintervall dar, und die Sternchen zeigen signifikante Differenzen (* = p < 0,05) zwischen den mittleren CLas-Titern für die Streptomycin- undH2O-behandeltenPflanzen gemäß einer einfaktoriellen ANOVA. (C) Repräsentative Bilder von Zitruspflanzen 0 Monate und 2 Monate nach direkter Pflanzeninfusionsbehandlung mit (C)H2Ooder (D) Streptomycin. Die mit Streptomycin behandelten Pflanzen zeigen nach 2 Monaten ein neues hellgrünes Blattwachstum, was auf eine Reduktion des CLas-Titers hindeutet. Abkürzung: CLas = Candidatus Liberibacter asiaticus. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Abbildung 4: Überwachung der Mortalität von Psyllidennymphen in juvenilen ACP-befallenen Zitronatzitronenpflanzen. Balkendiagramme, die (A) die geschätzte anfängliche Eizahl und (B) die überlebenden D. citri-Nymphen bei drei Zitrusspülungen 7 Tage nach der Behandlung mit einer Wasserkontrolle und verschiedenen Verdünnungen von Imidacloprid zeigen. Die Fehlerbalken stellen den Standardfehler des Mittelwerts dar, und die Sternchen kennzeichnen signifikante Unterschiede (* = p < 0,05, ** = p < 0,01) zwischen einer bestimmten Aufbereitungsstufe und der Wasserkontrolle gemäß einer einfaktoriellen ANOVA, gefolgt von einer Tukey-Post-hoc-Analyse. Bilder von mit D. citri-Nymphen befallenen Zitrusfrüchten 7 Tage nach der Behandlung entweder mit (C) der Wasserkontrolle oder (D) 528 μL/L Imidacloprid unter Verwendung des direkten Pflanzeninfusionsgeräts. Abkürzungen: ACP = Asian Citrus Psyllid; D. citri = Diaphorina citri Kuwayama. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Volumen pro Probe (μL) Bestandteil 12.5 2x GoTaq qPCR mit BRYT Green Dye Master Mix 5 DNA-Template (20 ng/μl) 0.5 10 μM Primer F und R für CLas Clas: CTTACCAGCCCTTGACATGTATAGG (Vorwärts);TCCCTATAAAGTACCCAACATCTAGGTAAA (Rückwärts) 0.5 10 μM Primer F und R für den Zitrushaushalt Zitrusdehydrin: TGAGTACGAGCCGAGTGTTG (Vorwärts);AAAACTTCACCGATCCACCAG (Rückwärts) 6.5 H2O Tabelle 1: Die qPCR-Mischung, die zur Quantifizierung des CLas-Titers in mit Streptomycin behandelten Zitruslinien verwendet wird. Die Sequenz der 16S Las Long-Primer und Citrus-Dehydrin-Primer für die CLas-DNA-Quantifizierung und die Citrus-DNA-Quantifizierung wird gezeigt. Schritt Temperatur (°C) Zeit 1 Anfängliche Denaturierung 95 2 Minuten 2 Vergällen 95 15 s 3 Glühen 60 20 s 4 Erweiterung 72 20 s 5 Fahren Sie mit Schritt 2 fort und wiederholen Sie den Vorgang 39x 6 Schmelzkurve 60 Rampe auf 95 bei 0,2 °C/s 3 Minuten Tabelle 2: Reaktionsbedingungen für die qPCR zur Quantifizierung des CLas-Titers in Streptomycin-behandelten Zitruslinien. Ergänzende Abbildung S1: Bilder, die den Montageprozess der Form zur Erzeugung des Plastisolrings zeigen. (A) Zusammensteckbare Kunststoffblöcke wurden verwendet, um die erste Schicht der Plastisol-Ringform zu erzeugen. (B) Gleichmäßig gemischte Lösung, die den Silikon-RTV-Kautschuk, den Katalysator, die Lebensmittelfarbe und die Seife enthält. (C) Gleichmäßig gegossene erste Schicht der Plastisol-Ringform. (D) Bild der Plastisol-Ringmuster mit dem mittleren Haltekerndruck oben. (E) Plastisol-Ringmuster, die in die nicht ausgehärtete zweite Schicht der Form eingebracht werden. (F) Abdeckband und Gummihammer zur Befestigung der Muster beim Aushärten der zweiten Schicht. (G) Die dritte Schicht der Form wird hinzugefügt, bis sie bündig mit der Oberseite der Muster abschließt. (H) Entfernen der Muster aus der Form. (I) Vollständig konstruierte Plastisol-Ringform. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen. Ergänzende Abbildung S2: Bilder, die den Montageprozess des Plastisolrings zeigen, der mit der Direktinfusionsvorrichtung für Pflanzen verbunden ist. (A) Plastisolring-Baugruppenkomponenten, einschließlich der Form, des Mittelkerns mit einem O-Ring und des Förderkanalkerns. (B) Beschichten der Kerne mit Antihaft-Sprühspeiseöl, um das Entfernen des Plastisolrings nach dem Aushärten zu erleichtern. (C) Einsetzen des Mittelkerns und des O-Rings in die Form. (D) Einsetzen des Zuführkanalkerns senkrecht zum Mittelkern. (E) Ordnungsgemäße Montage der Plastisolring-Kernkomponenten im Formhohlraum. (F) Plastisol, das zur Erzeugung des Plastisolrings verwendet wird. (G) Erhitzen des Plastisols in der Mikrowelle. (H) Rühren des Plastisols nach dem Erhitzen. (I) Überprüfung der Plastisoltemperatur. (J) Gießen des erhitzten Plastisols in den zusammengesetzten Kern. (K) Ermöglichung der Abkühlung des Plastisols um den zusammengesetzten Kern. (L) Vollständig montierte Plastisolringe, die an der Vorrichtung für die direkte Pflanzeninfusion befestigt sind. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen. Ergänzende Abbildung S3: Bilder, die den Montageprozess der Direktinfusionsvorrichtung zeigen. (A) Bohren eines Lochs durch die Mitte der Zitruspflanze, um einen Kanal für die Abgabe von Verbindungen zu schaffen. (B) Frontalansicht des Bohrlochs. (C) Durchschneiden des Plastisolrings mit einer Rasierklinge gegenüber dem Verbindungsabgabekanal. (D) Befestigen des Plastisolrings fest um den Stiel an der Stelle des zuvor gebohrten Lochs. (E) Anbringen der Vorrichtung für die direkte Pflanzeninfusion am Plastisolring, wobei der Verbindungsabgabestutzen an der Vorrichtung in den Kanal des Plastisolrings eingeführt wird. (F) Verwenden Sie Silikonklebeband, um die Vorrichtung für die direkte Pflanzeninfusion am Plastisolring zu befestigen und die gesamte Vorrichtung an Ort und Stelle zu halten. (G) Füllen der Kammer der Vorrichtung für die direkte Pflanzeninfusion mit der gewünschten Verbindung. (H) Verwenden Sie eine Spritze, um Luft aus dem gebohrten Loch in der Anlage zu ziehen und den Fluss der Verbindung zu starten. (I) Aufbringen von Wachsversiegelungsfolie auf die Öffnung in der Kammer des Direktinfusionsgeräts und Stechen eines Lochs, um ein Vakuum zu verhindern. (J) Vollständig zusammengebaute Vorrichtung für die direkte Infusion von Pflanzen auf einer Zitruspflanze. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen. Ergänzungsdatei 1: Der Plastisol-Ringmittelpfostenkern . STL-Datei für einen 4 mm Baum. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen. Ergänzungsdatei 2: Der Plastisol-Ringmittelpfostenkern . STL-Datei für einen 6 mm Baum. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen. Ergänzungsdatei 3: Der Plastisol-Ringmittelpfostenkern . STL-Datei für einen 8 mm Baum. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen. Ergänzungsdatei 4: Der Plastisol-Ringmittelpfostenkern . STL-Datei für einen 10 mm Baum. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen. Ergänzungsdatei 5: Der Plastisol-Ringmittelpfostenkern . STL-Datei für einen 12 mm Baum. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen. Ergänzungsdatei 6: Der Plastisol-Ringmittelpfostenkern . STL-Datei für einen 14 mm Baum. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen. Ergänzungsdatei 7: Der Plastisolring-Zuführkanalkern . STL-Datei für einen 4 mm Baum. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen. Ergänzungsdatei 8: Der Plastisolring-Abgabekanalkern . STL-Datei für einen 6 mm Baum. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen. Ergänzungsdatei 9: Der Plastisolring-Abgabekanalkern . STL-Datei für einen 8 mm Baum. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen. Ergänzungsdatei 10: Der Plastisolring-Zuführkanalkern . STL-Datei für einen 10 mm Baum. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen. Ergänzungsdatei 11: Der Plastisolring-Zuführkanalkern . STL-Datei für einen 12 mm Baum. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen. Ergänzungsdatei 12: Der Plastisolring-Zuführkanalkern . STL-Datei für einen 14 mm Baum. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen. Ergänzungsdatei 13: Die Vorrichtung zur direkten Infusion von Pflanzen. STL-Datei. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen. Ergänzungsdatei 14: Das Muster, mit dem die Form für den Plastisolring hergestellt wurde. STL-Datei. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Discussion

Damit das DPI-Gerät als praktikable Methode für die exogene Verabreichung von Verbindungen in Pflanzen angesehen werden kann, muss es zu einer robusten und konsistenten Aufnahme von Verbindungen in eine Vielzahl von Gewebetypen beitragen. Das Experiment mit CFDA zeigte deutlich sowohl akropetale als auch basipetale Verbindungsbewegungen sowie sowohl im Gefäßsystem als auch in den Mesophyllzellen des Blattes. Zusätzlich, und vermutlich weil das in dieser DPI-Vorrichtung verwendete Bohrloch eine große Menge an Oberfläche für die Aufnahme von Verbindungen bietet, war die CFDA in relativ gleichen Mengen in allen Abschnitten des Stängels vorhanden, nicht nur in einer kleinen Teilmenge des Gefäßsystems neben der Vorrichtung, wie es in früheren Farbstoffaufnahmestudien in Pflanzen mit Stamminjektion beobachtet wurde6. Darüber hinaus wurde die Abgabe von grün fluoreszierendem Protein und Blütenfarbstoff mit dem DPI-Gerät getestet und eine Verteilung dieser Verbindungen ähnlich wie bei CFDA beobachtet (Daten nicht gezeigt). Diese Daten deuten darauf hin, dass das Gerät verwendet werden kann, um eine Vielzahl von Verbindungen, die sich in Größe und molekularer Struktur unterscheiden, systemisch zu verabreichen. Es ist jedoch erwähnenswert, dass es Unterschiede in der Aufnahme von Verbindungen gab, die auf dem Stadium der Blattentwicklung basierten, wobei jünger entwickelnde Blätter mehr Verbindung aufnehmen als ältere, etablierte Blätter. Dies kann auf die Veränderungen der Gefäßeigenschaften im Senken- und Quellgewebe zurückzuführen sein und sollte für ein bestimmtes Experiment optimiert werden.

Das DPI-Gerät zeigte eine ausreichende Aufnahme von Verbindungen für die Visualisierung von CFDA, GFP und Blütenfarbstoffen, und es nahm auch genug auf, um die antibakterielle und insektizide Wirkung von Streptomycin bzw. Imidacloprid zu zeigen. Beide Verbindungen führten 1 Woche nach einer einmaligen Behandlung mit 2,0 ml zu Veränderungen der Lebensfähigkeit des Zielorganismus. Diese Daten deuten darauf hin, dass das DPI-Gerät in Ganzpflanzenassays eingesetzt werden könnte, um die Lebensfähigkeit einer Vielzahl von Verbindungen zur Bekämpfung von mikrobiellen und Insektenschädlingen zu testen. Darüber hinaus kann dieses Gerät aufgrund seines direkten Kontakts mit dem Gefäßsystem sogar die Möglichkeit bieten, Verbindungen zu testen, die von den Wurzeln oder Epidermiszellen nicht effizient aufgenommen werden. Von besonderem Interesse wäre die RNA-Interferenz (RNAi), da diese genutzt werden könnte, um die Genexpression innerhalb der Wirtspflanze, des Erregers oder des Erregervektors zu modulieren. Frühere Forschungen, bei denen Haarnadel-RNA durch ein gebohrtes Loch in den Stamm von Apfel- und Traubenpflanzen eingeführt wurde, zeigten, dass die RNA-Moleküle auf das Xylemgewebe beschränkt waren, was darauf hindeutet, dass diese Moleküle möglicherweise nur gegen kauende und Xylemsaft fressende Organismen wirksam sind22. Angesichts der Tatsache, dass das DPI-Gerät ein ähnliches Bohrloch-Verabreichungssystem verwendet, liegt es nahe, dass die mit diesem Gerät gelieferte Haarnadel-RNA auch auf das Xylemgewebe beschränkt sein kann. Die beobachtete Abnahme des Titers der phloembegrenzten CLas nach Streptomycin-Behandlung mit dem DPI-Gerät deutet jedoch stark darauf hin, dass dieses Antibiotikum im Phloem vorhanden war. Daher ist es wahrscheinlich, dass die vaskuläre Verteilung der Verbindungen, die mit dem DPI-Gerät verabreicht werden, von ihrer Größe und Chemie abhängt, und jedes Molekül sollte individuell bewertet werden.

Obwohl es eine Reihe von handelsüblichen DPI-Geräten auf dem Markt gibt, kann das hier beschriebene Gerät im eigenen Haus hergestellt werden und ist modifizierbar. Auf diese Weise können Verbesserungen und Größenänderungen auf der Grundlage der verwendeten Pflanzenart und des Versuchsdesigns vorgenommen werden, und es ist nicht auf kommerzielle Produkte angewiesen. Darüber hinaus ist das Gerät semi-permanent mit der Anlage verbunden, was bedeutet, dass mehrere Behandlungen einer bestimmten Verbindung gleichzeitig durchgeführt werden können, ohne dass die Pflanze durch mehrere Injektionen von Verbindungen erneut verletzt werden muss. Vorsichtsmaßnahmen: Das Gerät kann auslaufen, wenn es nicht richtig installiert wird. Dadurch geht die Verbindung an die Umwelt verloren, anstatt an die Pflanze abgegeben zu werden. Daher sollte darauf geachtet werden, das Gerät während der Einrichtung und in den ersten Tagen danach auf Anzeichen von Undichtigkeiten zu überprüfen. Obwohl das Bohren eines Lochs in den Baum potenziell schädlich ist, wurde diese Methode gewählt, um eine robuste und gleichmäßige Aufnahme von Verbindungen zu gewährleisten. Darüber hinaus wurden in diesen Experimenten keine nachteiligen Auswirkungen auf die Pflanzengesundheit durch das Anbringen des DPI-Geräts festgestellt. Es sollten jedoch zusätzliche Pflanzen in das Versuchsdesign einbezogen werden, um diejenigen zu ersetzen, die im Laufe eines bestimmten Versuchs an Kraft verlieren könnten. Da dieses Gerät passiven Fluss verwendet, um Verbindungen einzubringen, kann es schwierig sein, die Aufnahmerate verschiedener Pflanzenarten oder Entwicklungsstadien derselben Art vorherzusagen. Dies kann Experimente erschweren, wenn die Geschwindigkeit der Aufnahme von Verbindungen ein limitierender Faktor ist. Um die besten Ergebnisse zu erzielen, sollten die Experimente so geplant werden, dass der Pflanze genügend Zeit zur Verfügung steht, um die 2,5 ml der Verbindung vollständig aufzunehmen, was bis zu 1 Woche dauern kann. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses DPI-Gerät ein effektives Werkzeug für die schnelle Bewertung der In-planta-Aktivität von antimikrobiellen oder insektiziden Verbindungen gegen CLas und seinen Vektor D. citri darstellt und somit mehr Informationen über die systemische Wirksamkeit und den Einfluss auf die Pflanzenleistung liefert als der zuvor vorgestellte Test für abgelöste Blätter23. Zweifelsohne geht die Anwendungsvielfalt dieses Systems weit über die in dieser Studie beschriebenen spezifischen Anwendungen hinaus.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren bedanken sich bei Mant Acon für die in dieser Studie verwendeten Pflanzen. Die Finanzierung erfolgte durch das CRIS-Projekt 8062-22410-007-000-D des US-Landwirtschaftsministeriums (USDA) und den USDA-NIFA-Zuschuss 2020-70029-33176.

Materials

0.5 cm Diameter Steel Balls Ballistic Products Inc. #SHT #T
10 mL Luer-Lok Syringe Becton Dickinson 382903029952
20 G 1 Syringe Needle Becton Dickinson 305175
2 mL Screw Cap Tubes USA Scientific 1420-9710
3/32nd Inch Black Oxide Drill Bit Sears 964077
3D Printer Markforged F-PR-2027
3D Printing Software Markforged F-SW-FDVX
3D Printing Software Markforged S-FW-OEVX
5(6)-CFDA (5-(and-6)-Carboxyfluorescein Diacetate) Invitrogen C195
5/64th Inch Black Oxide Drill Bit Sears 964502
96 Well qPCR Machine Roche 5815916001
Centrifuge Eppendorf 22621408
Fluorescent Microscope Olympus SP-BX43-BI
Fluorescent Microscope Filter Chroma 69401-ET
Gloss Clear Spray Paint Rustoleum 249117
Grey Lego Baseplate Lego 11024
Handheld Cordless Drill Makita 6349D
Homogenizer Fisher Scientific 15-340-163
Imidacloprid 2F Quali-Pro 83080133
Liquid Plastisol Medium Hardness Fusion X Fishing Lures XSOL-505
Red Silicone 70 Shore A O-Ring Grainger Varies by Size
Non-Stick Cooking Spray PAM 64144030217
NucleoSpin Plant II Macherey-Nagel 740770.5
Parafilm Bemis HS234526A
Poly Viyl Acetate Based Glue Elmers E301
qPCR Master Mix Promega A6001
qPCR Primers Integrated DNA Technologies Varies by DNA sequence
Reverse Transcriptase Promega A5003
Single Edge Razor Blade Garvey 40475
Translucent Silicone RTV Rubber Aero Marine Products AM 115T
Transparent Silicone Tape Maxwell KE30S
Truncated Oncocin 112 Genscript Varies by peptide sequence
White 1 x 6 Lego Piece Lego 300901
White Nylon Markforged F-MF-0003
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Referencias

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Rhodes, B. H., Stange, R. R., Zagorski, P., Hentz, M. G., Niedz, R. P., Shatters, R. G., Pitino, M. Direct Infusion Device for Molecule Delivery in Plants. J. Vis. Exp. (196), e65194, doi:10.3791/65194 (2023).
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