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Biología

DISPOSITIF DE PERFUSION DIRECTE POUR ADMINISTRATION DE MOLÉCULES DANS LES PLANTES

Published: June 02, 2023
doi:
10.3791/65194
, , , , , ,
1United States Department of Agriculture Agricultural Research Service U.S. Horticultural Research Laboratory, 2Agrosource Incorporated

Summary

Ce manuscrit décrit un nouveau dispositif d’infusion directe de plantes pour cribler l’efficacité de molécules contre la bactérie (Candidatus Liberibacter asiaticus) ou son insecte vecteur (Diaphorina citri, Kuwayama) qui, en combinaison, sont associées à la maladie des agrumes de Huanglongbing.

Abstract

Tester la fonction des composés thérapeutiques chez les plantes est une composante importante de la recherche agricole. Les méthodes foliaires et de trempage du sol sont courantes, mais présentent des inconvénients, notamment une absorption variable et la dégradation environnementale des molécules testées. L’injection de tronc d’arbres est bien établie, mais la plupart des méthodes pour cela nécessitent un équipement coûteux et exclusif. Pour dépister divers traitements pour Huanglongbing, une méthode simple et peu coûteuse pour administrer ces composés dans le tissu vasculaire de petits agrumes cultivés en serre infectés par la bactérie limitée en phloème Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) ou infestés par l’insecte vecteur de phloèmes Diaphorina citri Kuwayama (D. citri) est nécessaire.

Pour répondre à ces exigences de dépistage, un dispositif d’infusion directe de plantes (DPI) a été conçu pour se connecter au tronc de la plante. L’appareil est fabriqué à l’aide d’un système d’impression 3D à base de nylon et de composants auxiliaires faciles à obtenir. L’efficacité de l’absorption du composé de ce dispositif a été testée dans des plants d’agrumes à l’aide du marqueur fluorescent 5,6-carboxyfluorescéine-diacétate. Une distribution uniforme du marqueur dans les plantes a été régulièrement observée.

De plus, ce dispositif a été utilisé pour délivrer des molécules antimicrobiennes et insecticides afin de déterminer leurs effets sur CLas et D. citri respectivement. L’antibiotique aminoglycoside streptomycine a été administré dans des plants d’agrumes infectés par CLas à l’aide du dispositif, ce qui a entraîné une réduction du titre CLas de 2 semaines à 4 semaines après le traitement. L’administration de l’insecticide néonicotinoïde imidaclopride dans les plants d’agrumes infestés par D. citri a entraîné une augmentation significative de la mortalité des psylles après 7 jours. Ces résultats suggèrent que ce dispositif DPI représente un système utile pour délivrer des molécules dans les plantes à des fins de test et de recherche et de criblage.

Introduction

La gestion des plantes dans des environnements commerciaux et paysagers nécessite souvent l’utilisation de composés chimiques pour optimiser la croissance et la santé des plantes. La façon dont ces molécules sont livrées dépend du type de molécule, de la fonction de la molécule, du type de plante et du système de gestion en place. Les applications foliaires et au sol sont les stratégies d’administration les plus faciles, mais les limites de l’absorption de certaines molécules nécessitent une livraison directe. Un exemple de ces molécules est les molécules thérapeutiques qui fonctionnent mieux lorsqu’elles se déplacent systématiquement dans la plante, mais ne peuvent pas être délivrées efficacement par de simples applications topiques1. C’est le cas du Huanglongbing (HLB), également appelé maladie du verdissement des agrumes. Le HLB est une maladie associée à une bactérie limitée en phloème, Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas), qui ne peut pas être cultivée en dehors de la plante, ou à son insecte vecteur, Diaphorina citri Kuwayama (D. citri)2.

Si les molécules thérapeutiques présumées sont des produits géniques, elles peuvent être testées en créant des plantes transgéniques exprimant ces composés. Cependant, la production végétale transgénique peut exiger beaucoup de temps et de ressources, dépend fortement du génotype et peut être inhibée par le silençage génique3. De plus, même si ces transgéniques montrent des résultats prometteurs, les contraintes réglementaires et de perception du public réduisent la probabilité de leur acceptation commerciale 4,5. L’application exogène de composés, cependant, simplifie les tests de molécules biologiques et synthétiques car elle ne nécessite pas la production de plantes transgéniques stables ou exprimant transitoirement, ce qui réduit le temps et les ressources pour tester les effets d’une molécule. Une méthode d’administration systémique efficace et efficiente de composés exogènes pourrait être utilisée à des fins de recherche et de criblage.

L’une de ces applications est l’analyse du mouvement systémique des molécules dans le système vasculaire d’une plante, qui peut être effectuée à l’aide de marqueurs traçables, qu’il s’agisse d’isotopes chimiquesfluorescents, visibles ou uniques 6,7,8,9. Un marqueur fluorescent couramment utilisé est le diacétate de 5,6-carboxyfluorescéine (CFDA), qui est un colorant perméable à la membrane qui est dégradé par les estérases intracellulaires en 5,6-carboxyfluorescéine (CF) et, par la suite, devient fluorescent et imperméable à la membrane10. CFDA a été largement utilisé pour surveiller le transport du phloème, les relations entre le puits et la source, et la structuration vasculaire dans les tissus végétaux11,12.

En plus de ces marqueurs, certains composés peuvent modifier directement la physiologie de la plante pour augmenter la productivité ou tuer la plante dans le cas des herbicides. Les insecticides et les composés antimicrobiens sont un moyen d’augmenter la productivité des plantes, en particulier en présence de HLB. Un exemple de molécule antimicrobienne utilisée pour contrôler CLas est la streptomycine. La streptomycine est un antibiotique aminoglycoside qui a été isolé à l’origine de Streptomyces griseus et dont il a été démontré qu’il inhibe la croissance bactérienne par l’inhibition de la biosynthèse des protéines13. En termes d’insecticides, la cible principale de la recherche HLB est D. citri, qui transmet CLas d’arbreà arbre 14. À cette fin, les néonicotinoïdes, tels que l’imidaclopride, sont couramment utilisés, car ils constituent l’étalon-or pour lutter contre les insectes nuisibles15. Toutes ces utilisations variées sont des aspects importants des stratégies actuelles de gestion des plantes, et le développement de nouveaux produits dépend d’essais de criblage efficaces.

Une méthode utilisée pour l’introduction de composés dans les plantes ligneuses est l’injection directe dans le tronc. Divers systèmes ont été conçus et leurs besoins en matière de sites d’injection préforés varient, et ces systèmes utilisent soit l’injection sous pression, soit le débit passif16. Bien que les systèmes basés sur la pression permettent l’introduction rapide d’un composé donné, les dommages physiques potentiels causés par le passage forcé du liquide à travers un système vasculaire bloqué ou embolisé doivent être pris en compte17. Bien que l’application foliaire ou humide des composés prenne moins de temps à mettre en œuvre, l’injection directe de plantes réduit le gaspillage du composé d’intérêt dû aux pertes dans l’air ou le sol et peut également allonger la durée pendant laquelle les composés sont à l’état actif en réduisant l’exposition à l’environnement extérieur18. Ces deux aspects sont importants pour préserver les réactifs coûteux et assurer la cohérence entre les répétitions dans les contextes de recherche.

Cette étude décrit la conception, la construction et l’utilisation d’un dispositif novateur d’infusion directe de plantes (DPI), qui peut être utilisé pour évaluer comment les composés d’intérêt affectent une plante hôte. Une imprimante 3D standard a été utilisée pour fabriquer à la fois l’appareil lui-même et plusieurs composants associés à sa construction. Cette méthode de construction interne permet aux chercheurs de modifier le dispositif et les composants du dispositif en fonction de leurs besoins expérimentaux spécifiques et réduit la dépendance à l’égard des dispositifs d’injection de plantes disponibles dans le commerce. La configuration de l’appareil est simple et efficace, et tous les composants auxiliaires sont facilement disponibles et peu coûteux. Bien que le système ait été conçu pour être utilisé avec une variété d’espèces végétales, les exemples présentés ici concernent les agrumes en pot. De plus, cette étude démontre que ce dispositif est capable de délivrer efficacement plusieurs types de composés par voie systémique aux jeunes plants d’agrumes sans causer de létalité. Les composés testés comprenaient le CFDA, qui a été utilisé pour évaluer la distribution des composés dans la plante, et la streptomycine et l’imidaclopride, qui ont été utilisés pour vérifier que les effets antimicrobiens et insecticides de ces composés ont été observés lorsqu’ils étaient administrés via DPI.

Protocol

1. Production d’agrumes destinés à l’injection expérimentale de composés Multipliez les petits agrumes en pot à partir de boutures végétatives ou de graines enracinées. Cultivez les lignes d’agrumes en pot sous une longueur de jour clair/foncé de 16 h/8 h et à 28 °C. Sélectionnez des plants d’agrumes de la taille appropriée pour l’expérience. Les applications décrites exigeaient que les plantes aient entre 12 cm et 100 cm de hauteur avec des diamètres de tronc de 4 à 14 mm. Si une nouvelle croissance de chasse d’eau est nécessaire, coupez les plantes avant l’expérience. 2. Impression tridimensionnelle du dispositif DPI et des composants du moule Appliquez une fine couche de colle à base d’acétate de polyvinyle sur le lit d’impression. Chargez le filament de nylon dans l’imprimante 3D et préparez l’imprimante conformément aux instructions du fabricant. Importez le fichier . STL (fichier supplémentaire 1, dossier supplémentaire 2, dossier supplémentaire 3, dossier supplémentaire 4, dossier supplémentaire 5, dossier supplémentaire 6, dossier supplémentaire 7, dossier supplémentaire 8, dossier supplémentaire 9, dossier supplémentaire 10, dossier supplémentaire 11, dossier supplémentaire 12, dossier supplémentaire 13 et dossier supplémentaire 14), mise en place et lancez l’impression. Retirez la pièce du lit d’impression. Rincez la colle à base d’acétate de polyvinyle de la base du composant imprimé avec de l’eau et retirez toutes les structures de support. Vaporisez le composant DPI avec deux couches de peinture en aérosol brillante transparente. 3. Fabrication du moule à anneau plastisol Assemblez une forme de moule suffisamment grande pour contenir les pièces du motif en construisant une enceinte rectangulaire à l’aide de blocs de plastique encliquetables sur une base (figure supplémentaire S1A). Mélanger le monomère de silicone RTV et le catalyseur ensemble à un rapport de 10:1, et remuer sans introduire de bulles pendant 1 min. Colorer en ajoutant du colorant alimentaire (3 gouttes/25 mL de mélange de silicone) et du savon pour les mains (1 mL de savon/25 mL de mélange de silicone) (Figure supplémentaire S1B). Versez une fine couche de silicone dans la forme du moule qui est suffisante pour couvrir complètement le fond. Tamp pour aplatir la surface et attendre 24 h que le silicone durcisse (Figure supplémentaire S1C). Versez une deuxième couche de silicone, comme décrit ci-dessus, suffisamment profonde pour couvrir l’empreinte du noyau du trou central sur le motif (visible en haut du motif dans la figure supplémentaire S1D). Insérez le motif dans le silicone liquide avec l’impression du noyau du trou central vers le bas. Assurez-vous qu’aucune bulle n’est piégée et que les motifs sont bien séparés et ne se touchent pas (figure supplémentaire S1E). Fixez les motifs avec un objet lourd et / ou du ruban adhésif pour les empêcher de flotter hors du silicone pendant qu’il prend. Attendez 24 heures que la couche nouvellement coulée prenne (figure supplémentaire S1F). Versez des couches supplémentaires de silicone jusqu’à ce que le niveau affleure le haut du motif. Attendre 24 h pour guérir (Figure supplémentaire S1G). Démontez les blocs de plastique encliquetables pour libérer le moule. Supprimer les motifs (figure supplémentaire S1H). Inspectez la moisissure à la recherche de déchirures ou de déformations (figure supplémentaire S1I). 4. Coulée des anneaux plastisols Enduisez l’intérieur du moule, tous les composants principaux et les joints toriques d’huile de cuisson (figure supplémentaire S2A, B). Placez un joint torique autour de l’encoche au milieu du noyau du poteau central et placez le noyau dans le trou central du moule de l’anneau en plastisol (figure supplémentaire S2C). Insérez le noyau du canal de livraison dans le trou sur le côté du moule à anneau plastisol. Orientez l’extrémité en forme de V à l’extrémité du noyau du canal de distribution pour l’aligner sur le joint torique sur le noyau du poteau central (figure supplémentaire S2D,E). Faire chauffer le plastisol au micro-ondes pendant de courtes rafales de 10 s (Figure supplémentaire S2F, G). Remuer doucement le plastisol pour éviter les bulles (figure supplémentaire S2H). Répéter le chauffage et l’agitation jusqu’à ce que la solution atteigne une température comprise entre 160 °C et 170 °C (figure supplémentaire S2I).ATTENTION : La surchauffe du plastisol peut entraîner le dégagement de fumées toxiques. Effectuez la procédure dans un endroit bien ventilé ou une hotte. Ne pas chauffer le plastisol à plus de 170 °C. Verser le plastisol fondu dans le moule à anneau plastisol près du bord extérieur du moule sans introduire de bulles (Figure supplémentaire S2J). Attendez 1 h que les anneaux plastisols refroidissent (figure supplémentaire S2K). Retirez les anneaux du moule. S’assurer qu’il est bien ajusté avec le dispositif DPI avant de l’utiliser dans des essais expérimentaux (figure supplémentaire S2L). 5. Fixation du dispositif DPI à l’usine Trouvez un site lisse et sain sur le coffre pour la fixation de l’appareil. Évitez les bosses ou les nœuds, car ils peuvent contribuer aux fuites de l’appareil. Utilisez un foret de 2 mm de diamètre pour percer horizontalement un trou au centre de la tige à un angle de 90° avec la surface du tronc (figure supplémentaire S3A). Passez le foret à travers le trou plusieurs fois pour le nettoyer et le lisser afin de créer un trou dégagé (figure supplémentaire S3B). Créer une tranche verticale dans l’anneau plastisol du côté opposé du canal de distribution du composé (figure supplémentaire S3C). Ajustez l’anneau autour de la plante et alignez le canal de livraison avec le trou précédemment foré (figure supplémentaire S3D).REMARQUE: L’anneau doit être bien ajusté autour du coffre pour éviter les fuites; Des assemblages de noyaux de différents diamètres peuvent être utilisés pour fabriquer des anneaux de plastisol pour des tiges de plantes de différentes tailles. Ajoutez le dispositif DPI à l’anneau plastisol, en veillant à ce qu’ils s’emboîtent parfaitement. Alignez le bec du dispositif DPI avec le canal de distribution de l’anneau plastisol et le trou foré (figure supplémentaire S3E).REMARQUE: L’utilisation d’un foret pour aligner le trou et le bec du périphérique DPI peut être utile. Envelopper hermétiquement avec du ruban de silicone pour maintenir l’appareil en place (figure supplémentaire S3F). Inspectez l’appareil entièrement assemblé et fixé pour vous assurer d’un alignement et d’une orientation appropriés sur la plante. 6. Application du composé d’intérêt à l’aide du dispositif DPI Utiliser une seringue ou une pipette pour remplir le dispositif DPI avec la solution d’intérêt (figure supplémentaire S3G). Utilisez une seringue pour pénétrer le ruban de silicone et l’anneau de plastisol du côté opposé du dispositif DPI afin d’extraire l’air du canal intérieur et d’éviter l’introduction de bulles d’air dans le système vasculaire de la plante (figure supplémentaire S3H). Replacez tout composé extrait dans le périphérique DPI. Ajoutez un petit morceau supplémentaire de ruban adhésif de silicone sur le trou créé par la seringue pour renforcer la zone et prévenir les déchirures. Inspecter l’appareil pour détecter les fuites visibles au point de fixation et inspecter le réservoir de l’appareil pour vérifier s’il y a un niveau de liquide stable.NOTE: L’eau peut être utilisée initialement pour tester les fuites afin d’éviter le gaspillage de la solution d’essai. Couvrir l’extrémité ouverte du dispositif DPI avec un film d’étanchéité à la cire et tirer vers le bas pour former un joint et réduire l’évaporation du composé expérimental. Percez un seul trou dans le film de cire avec un embout de seringue pour éviter le développement d’un vide, puis remplissez le dispositif (figure supplémentaire S3I). Vérifiez quotidiennement l’appareil pour s’assurer du bon alignement des composants (figure supplémentaire S3J) et complétez le liquide à l’aide d’une seringue pour éviter que le réservoir ne s’assèche. Répétez ce processus jusqu’à ce que la quantité désirée de solution expérimentale ait été introduite.REMARQUE: Les composés peuvent être introduits avec succès à partir d’un dispositif donné jusqu’à 1 mois. Les durées d’absorption de la solution qui dépassent ce délai doivent être testées empiriquement avant la configuration expérimentale. 7. Utilisation de CFDA pour observer le mouvement vasculaire avec les agrumes Fixez l’appareil DPI à des plants de cédrat (Citrus medica L.) de 25 cm de haut, appliquez un seul traitement de 2,0 ml de DMSO à 20 % dans un contrôle H2O ou CFDA au dispositif DPI et laissez-le absorber pendant 24 h. Pour suivre ce protocole, préparez la solution de CFDA fonctionnelle en ajoutant 1,6 mL deH2Oà 400 μL de solution mère de CFDA (la solution mère contient 10 mM de CFDA dissous dans 100% de diméthylsulfoxyde [DMSO]) pour générer une concentration finale de CFDA de 2 mM et 20% de DMSO. Faites des coupes transversales de divers tissus de la plante et utilisez un stéréoscope ou un microscope composé avec un filtre fluorescent qui comprend la longueur d’onde de 498 nm pour visualiser le CFDA dans les tissus végétaux. Comparez les images au DMSO à 20 % dans les témoins H2O pour tenir compte de l’autofluorescence dans le tissu. 8. Mesure des changements dans le titre CLas dans les échantillons de feuilles après un traitement à la streptomycine À l’aide de plantes de Valence (Citrus sinensis (L .) Osbeck « Valencia ») infectées par CLas et cultivées en serre de 0,75 m de haut, prélever le pétiole et la nervure médiane de deux feuilles symptomatiques HLB de chaque plante, les couper en petites sections, regrouper chaque type de tissu et les stocker séparément dans des tubes d’échantillon résistants aux chocs de 2 ml contenant une bille d’acier de 6,35 mm de diamètre. Broyer l’échantillon à l’aide d’un homogénéisateur programmé pour deux cycles de 15 s à 3,4 m/s. Extraire l’acide nucléique total comme décrit précédemment19. Effectuer la qPCR sur les échantillons de feuilles infectés par CLas en utilisant le mélange qPCR défini dans le tableau 1 et les conditions de réaction définies dans le tableau 2. Utilisez des plantes présentant des infections CLas robustes (l’infection robuste est généralement définie comme des valeurs Ct basées sur la qPCR < 30 pour le jeu d’amorces CLas 16S LasLong (LL)) pour une analyse plus approfondie.REMARQUE : Le titre bactérien est estimé à l’aide des amorces de l’ADN de CLas 16S Las Long (LL) et de la déshydrine d’agrumes pour estimer les équivalents relatifs du génome, comme décrit précédemment20. Équiper les plants d’agrumes qui répondent au titre d’infection minimal décrit ci-dessus avec des dispositifs DPI et les soumettre à un traitement unique de 2,0 mL de solution H2O ou de solution de streptomycine à la concentration désirée. Pour suivre cette étude, utiliser un seul traitement de 2,0 mL de 9,5 mg/mL (19 mg au total) de streptomycine dissoute dans H2O. Prélever des échantillons de feuilles 7 jours, 14 jours et 28 jours après le traitement. Doser les feuilles échantillonnées pour le titre CLas en utilisant le même protocole que celui décrit ci-dessus. 60 jours après le traitement, obtenir des photographies des plantes traitées avecH2Oou streptomycine. Utilisez des observations visuelles de l’infection CLas pour évaluer la gravité de l’infection. Recherchez <50% des feuilles présentant une chlorose internervaire et un bouchon veineux ainsi qu’une croissance de rinçage des feuilles comme signes d’infection bénigne et plus de 50% des feuilles présentant une chlorose internervaire et un bouchon veineux ainsi qu’une abscission foliaire et un retard de croissance de la plante comme signes d’infections plus graves. 9. Mesure de la mortalité de D. citri après un traitement par imidaclopride Tailler les plants de cédrat (Citrus medica L.) de 0,5 m de haut à une hauteur de 12 cm pour favoriser la croissance de nouvelles rougeurs.REMARQUE : La vitesse de croissance des chasses d’eau peut dépendre de la santé de la plante et de la période de l’année; Donc, tenez-en compte lors de la conception expérimentale. Après >6 chasses de 1 à 2 cm de long, introduisez les plantes dans des cages contenant du D. citri adulte. Laissez les plantes dans les cages pendant 24 h pour permettre le dépôt des œufs. Effectuer un comptage représentatif des œufs sur trois pousses rinçantes 1 à 2 jours après la ponte, puis appliquer les dispositifs DPI. Remplissez ces dispositifs avec 2,0 mL d’un témoin d’eau ou la concentration désirée d’imidaclopride (ingrédient actif à 21,8 %). Pour suivre ce protocole, utilisez 528 μL/L, 52,8 μL/L et 5,28 μL/L d’imidaclopride.REMARQUE : Le nombre d’œufs est une mesure destructrice, de sorte que les comptages à ce stade sont utilisés pour estimer le nombre d’œufs sur la chasse d’eau non comptée de la même plante et aider à fournir une base de référence pour les dénombrements ultérieurs d’émergence de nymphes qui sont effectués à la fin de l’expérience. Recueillir le taux d’émergence de D. citri sur au moins trois des pousses flush restantes. Acquérir des photographies de plantes représentatives 7 jours après l’introduction du composé.

Representative Results

Composants du dispositif de perfusion directeLa version de base du dispositif de perfusion directe mesure 8 cm de haut et 3,3 cm de large à l’avant et sur le côté (figure 1A). Il contient un seul réservoir central contigu au bec, et le volume total pouvant être contenu dans ces composants est de 2,0 mL (figure 1D). L’anneau plastisol mesure 1,8 cm de haut et a un diamètre de 2,7 cm (Figure 1C). Cet anneau contient également deux canaux : un pour accueillir le bec du dispositif DPI et un autre de diamètre variable qui s’adapte autour du tronc de l’arbre à traiter. De plus, il y a une rainure autour du canal vertical pour diriger l’excès de traitement autour de l’arbre, ce qui permet une absorption supplémentaire du composé à travers l’écorce (Figure 1F). Lorsqu’il est assemblé correctement, l’anneau de plastisol doit affleurer le dispositif DPI et le bec doit s’aligner avec le trou percé dans l’arbre (Figure 1B et Figure 1E). L’Pour étudier l’efficacité du dispositif DPI pour introduire des produits chimiques exogènes dans les agrumes, 2,0 mL de CFDA 2 mM ont été infiltrés à l’aide du dispositif. Un signal de fluorescence a été détecté dans le système vasculaire de la plante traitée (figure 2A) mais était absent dans les usines témoins traitées avec 20% de DMSO dansH2O(figure 2B). Ce signal a été observé dans tous les types de tissus végétaux disséqués, y compris le mésophylle foliaire, le système vasculaire pétiolaire, le système vasculaire de la tige et le système vasculaire racinaire (figure 2C). Ce signal a été observé dans la plante dans les 24 heures suivant le traitement et a été réparti relativement uniformément dans les tissus. StreptomycinePour vérifier si les composés introduits avaient un effet thérapeutique sur la maladie HLB, 2,0 mL d’un composé bactéricide, la streptomycine, ont été introduits dans des plants d’oranges douces de Valencia (Citrus sinensis) CLas positifs à une concentration de 9,5 mg/mL (19 mg au total). Ces plantes ont été maintenues dans des pots de serre, et le titre CLas (mesuré par les équivalents génome CLas par équivalent génome d’agrumes) a été surveillé au fil du temps à l’aide de qPCR (Figure 3A). Les titres moyens initiaux CLas de l’ADN pour les plantes traitées à la streptomycine et à H2 O étaient respectivement de 0,562 CLas génome/agrumes et de 0,49 CLas génome/génome d’agrumes. Des réductions du titre bactérien moyen ont été détectées par qPCR 7 à 28 jours après le traitement à la streptomycine par rapport aux témoinsH2Oau même moment. De plus, la différence entre les titres bactériens moyens de temps 0 et jour 28 était de 0,314 et 0,117 pour les plantes traitées à la streptomycine et les plantes traitées à l’H2O, respectivement. Cette expérience a été conçue pour mesurer la réponse de la plante à différents traitements sur différentes périodes. Un plan de surface de réponse quadratique à deux facteurs a été utilisé, le temps étant traité comme un facteur discret quantitatif à quatre niveaux (0 jour, 7 jours, 14 jours et 28 jours) et le traitement comme facteur catégorique à deux niveaux (H2O et streptomycine). Cinq répétitions ont été utilisées pour chacune des huit combinaisons de traitement, et le titre CLas a été mesuré comme variable de réponse. Les données ont été transformées à l’aide du log10 basé sur une analyse de la parcelle de Box-Cox. La réduction du modèle a été réalisée par sélection directe à l’aide du critère d’information d’Akaike (AICc)21, ce qui a entraîné la suppression des effets de temps et d’interaction. Le facteur restant, le traitement, était significatif (p = 0,0252), les plantes traitées à la streptomycine affichant un titre CLas moyen inférieur (0,349) à celui des plantes traitées H2O (0,496) sur tous les points temporels combinés (figure 3B). Cette réduction du titre CLas correspondait à des augmentations occasionnelles de la nouvelle croissance saine après 60 jours chez les plantes traitées à la streptomycine, comme en témoignent les photographies d’arbres représentatifs traités avec H2O (Figure 3C) contre 19 mg de streptomycine (Figure 3D). ImidacloprideL’imidaclopride a été introduit dans des plants de cédrat infestés de psylles asiatiques d’agrumes (ACP) juvéniles à l’aide du dispositif DPI pour tester son potentiel en tant que test de dépistage insecticide de D. citri. Un seul traitement de 2,0 mL d’une solution insecticide imidaclopride commerciale a été testé à trois concentrations différentes (5,28 μL/L, 52,8 μL/L et 528 μL/L), ainsi qu’un contrôle de l’eau. Le nombre total moyen d’œufs par trois pousses flush avant le traitement variait de 280,5 à 321, et il n’y avait pas de différences significatives entre les plantes à utiliser pour chaque groupe de traitement (figure 4A). Le nombre total moyen de nymphes survivantes sur trois pousses de rinçage 7 jours après le traitement était de 293,75, 268, 97,5 et 2 pour les solutions de contrôle de l’eau et de 5,28 μL/L, 52,8 μL/L et 528 μL/L de solutions d’imidaclopride (figure 4B). Cela représentait une réduction significative de l’émergence des nymphes psylles aux niveaux de solution imidaclopride de 52,8 μL/L (p = 0,029) et 528 μL/L (p = 0,002) par rapport au contrôle de l’eau selon une ANOVA unidirectionnelle suivie d’une analyse post-hoc de Tukey. De plus, cette augmentation de la mortalité des nymphes psyllides au niveau le plus élevé de solution imidaclopride était visuellement apparente par la réduction de la production de miellat de nymphe sur les lignées traitées à l’imidacloprid (figure 4D) par rapport au témoin de l’eau (figure 4C). Figure 1 : Le dispositif d’infusion directe de la plante et l’anneau plastisol. (A) Le dispositif de perfusion directe intacte de la plante et (C) l’anneau plastisol avec leurs dimensions. (B) Le dispositif d’infusion directe de plantes et l’anneau plastisol reliés et fixés à un agrumes. Coupes transversales verticales du (D) dispositif d’infusion directe de la plante, (F) cycle plastisol, et (E) ces deux composants reliés et fixés à un agrumes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 2 : Coupe transversale de la nervure médiane d’une plante d’agrumes de 25 cm. Images montrant 24 h après traitement avec (A) 2 mM CFDA ou (B) 20% DMSO dansH2Oen utilisant le dispositif de perfusion directe de plantes. (C) Coupes transversales de divers tissus végétaux 24 h après un traitement CFDA 2 mM, y compris le tronc à 5 cm au-dessus du dispositif d’infusion directe de la plante (en haut à gauche), le tronc à 5 cm sous le dispositif d’infusion directe de la plante (au milieu gauche), la racine (en bas à gauche), la nervure médiane de la feuille (en haut à droite), le pétiole de la feuille (au milieu à droite) et le mésophylle foliaire (en bas à droite). Barres d’échelle = 1 mm. Abréviations : CFDA = 5,6-carboxyfluorescéine-diacétate; DMSO = diméthylsulfoxyde. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 3 : Surveillance du titre CLas (mesuré par les équivalents génome CLas par équivalent génome d’agrumes) au fil du temps à l’aide de la qPCR. (A) Évolution temporelle montrant les changements dans le titre d’ADN CLas comparant les cinq plantes traitées avec 19 mg de streptomycine avec les cinq plantes traitées avec un témoin H2O. Les points représentent la moyenne pour un traitement donné à un moment donné. Les barres d’erreur représentent l’erreur-type de la moyenne. (B) Diagramme à barres montrant le titre moyen CLas des plantes traitées H2O et streptomycine à tous les points temporels. Les barres d’erreur représentent l’intervalle de confiance à 95 %, et les astérisques indiquent des différences significatives (* = p < 0,05) entre les titres moyens de CLas pour les plantes traitées à la streptomycine et à H2O, selon une ANOVA unidirectionnelle. (C) Images représentatives des plants d’agrumes 0 mois et 2 mois après le traitement par infusion directe des plantes avec (C)H2Oou (D) streptomycine. Les plantes traitées à la streptomycine présentent une nouvelle croissance vert clair après 2 mois, ce qui suggère une réduction du titre CLas. Abréviation : CLas = Candidatus Liberibacter asiaticus. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 4 : Surveillance de la mortalité des nymphes psylles chez les plants de cédrat juvéniles infestés par les ACP. Graphiques à barres montrant (A) le nombre initial estimé d’œufs et (B) les nymphes survivantes de D. citri sur trois rinçages d’agrumes 7 jours après le traitement avec un témoin de l’eau et diverses dilutions d’imidaclopride. Les barres d’erreur représentent l’erreur-type de la moyenne, et les astérisques indiquent des différences significatives (* = p < 0,05, ** = p < 0,01) entre un niveau de traitement donné et le contrôle de l’eau selon une ANOVA unidirectionnelle suivie d’une analyse post-hoc de Tukey. Images d’agrumes infestés par la nymphe de D. citri 7 jours après le traitement avec (C) le témoin de l’eau ou (D) 528 μL/L d’imidaclopride à l’aide du dispositif d’infusion directe de la plante. Abréviations : ACP = psylle asiatique des agrumes; D. citri = Diaphorina citri Kuwayama. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Volume par échantillon (μL) Composant 12.5 2x GoTaq qPCR avec BRYT Green Dye Master Mix 5 Modèle d’ADN (20 ng/μL) 0.5 10 μM Primer F et R pour CLas Clas: CTTACCAGCCCTTGACATGTATAGG (avant);TCCCTATAAAGTACCCAACATCTAGGTAAA (Reverse) 0.5 10 μM Primer F et R pour l’entretien ménager des agrumes Déshydrine d’agrumes: TGAGTACGAGCCGAGTGTTG (Avant);AAAACTTCACCGATCCACCAG (revers) 6.5 H2O Tableau 1 : Le mélange qPCR utilisé pour quantifier le titre CLas dans les lignées d’agrumes traitées à la streptomycine. La séquence des amorces 16S Las Long et des amorces de déshydrine d’agrumes pour la quantification de l’ADN CLas et la quantification de l’ADN des agrumes est montrée. Pas Température (°C) Heure 1 Dénaturation initiale 95 2 min 2 Dénaturer 95 15 s 3 Recuit 60 20 s 4 Extension 72 20 s 5 Passez à l’étape 2, répétez 39x 6 Courbe de fusion 60 rampe à 95 à 0,2 °C/s 3 min Tableau 2 : Conditions de réaction pour la qPCR utilisée pour quantifier le titre CLas dans les lignées d’agrumes traitées à la streptomycine. Figure supplémentaire S1 : Images montrant le processus d’assemblage du moule pour générer l’anneau plastisol. (A) Des blocs de plastique encliquetables ont été utilisés pour générer la première couche du moule à anneau plastisol. (B) Solution uniformément mélangée contenant le caoutchouc RTV en silicone, le catalyseur, le colorant alimentaire et le savon. (C) Verser uniformément la première couche du moule à anneau plastisol. (D) Image des motifs de l’anneau plastisol avec l’empreinte centrale du noyau de maintien en haut. (E) Motifs d’anneaux plastisols insérés dans la deuxième couche non durcie du moule. (F) Ruban de masquage et maillet en caoutchouc utilisés pour fixer les motifs lors du durcissement de la deuxième couche. (G) Troisième couche du moule ajoutée jusqu’à ce qu’il affleure le haut des motifs. (H) Enlever les motifs du moule. (I) Moule à anneau plastisol entièrement construit. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier. Figure supplémentaire S2 : Images montrant le processus d’assemblage de l’anneau plastisol associé au dispositif d’infusion directe de la plante. (A) Composants de l’assemblage de l’anneau plastisol, y compris le moule, le noyau central avec un joint torique et le noyau du canal de distribution. (B) Enduire les noyaux d’huile de cuisson antiadhésive pulvérisée pour faciliter l’élimination de l’anneau plastisol après durcissement. (C) Insertion du noyau central et du joint torique dans le moule. (D) Insertion du noyau du canal de livraison perpendiculairement au noyau central. (E) Assemblage correct des composants du noyau de l’anneau plastisol dans la cavité du moule. (F) Plastisol utilisé pour la génération de l’anneau plastisol. (G) Chauffage du plastisol au micro-ondes. H) Agitation du plastisol après chauffage. (I) Vérification de la température du plastisol. (J) Verser le plastisol chauffé dans le noyau assemblé. (K) Permettre le refroidissement du plastisol autour du noyau assemblé. (L) Anneaux de plastisol entièrement assemblés fixés au dispositif d’infusion directe de plantes. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier. Figure supplémentaire S3 : Images montrant le processus d’assemblage du dispositif d’infusion directe de plantes. (A) Percer un trou au centre de la plante d’agrumes pour créer un canal pour la livraison du composé. (B) Vue frontale du trou foré. (C) Trancher à travers l’anneau de plastisol avec une lame de rasoir opposée au canal de distribution composé. (D) Ajuster fermement l’anneau plastisol autour de la tige à l’emplacement du trou précédemment foré. (E) Montage du dispositif d’infusion directe de plantes sur l’anneau plastisol, avec le robinet de distribution composé sur le dispositif inséré dans le canal de l’anneau plastisol. (F) Utiliser du ruban de silicone pour fixer le dispositif d’infusion directe de la plante à l’anneau plastisol et maintenir l’ensemble de l’appareil en place. (G) Remplissage de la chambre du dispositif d’infusion directe de plantes avec le composé d’intérêt. (H) Utiliser une seringue pour extraire l’air du trou foré dans l’usine et commencer l’écoulement du composé. (I) Appliquer un film d’étanchéité à la cire sur l’ouverture de la chambre du dispositif d’infusion directe de la plante et percer un trou pour empêcher le vide. (J) Dispositif d’infusion directe de plante entièrement assemblé sur un plant d’agrumes. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier. Fichier supplémentaire 1 : Le noyau central de l’anneau plastisol. STL pour un arbre de 4 mm. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier. Fichier supplémentaire 2 : Le noyau central de l’anneau plastisol. STL pour un arbre de 6 mm. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier. Fichier supplémentaire 3 : Le noyau central de l’anneau plastisol. STL pour un arbre de 8 mm. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier. Fichier supplémentaire 4 : Le plastisol central central post core . STL pour un arbre de 10 mm. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier. Fichier supplémentaire 5 : Le noyau central de l’anneau plastisol. STL pour un arbre de 12 mm. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier. Fichier supplémentaire 6 : Le noyau central de l’anneau plastisol. STL pour un arbre de 14 mm. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier. Dossier supplémentaire 7 : Le noyau du canal de livraison de l’anneau plastisol. STL pour un arbre de 4 mm. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier. Dossier supplémentaire 8 : Le noyau du canal de livraison de l’anneau plastisol. STL pour un arbre de 6 mm. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier. Dossier supplémentaire 9 : Le noyau du canal de livraison de l’anneau plastisol. STL pour un arbre de 8 mm. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier. Dossier supplémentaire 10 : Le noyau du canal de livraison de l’anneau plastisol. STL pour un arbre de 10 mm. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier. Dossier supplémentaire 11 : Le noyau du canal de livraison de l’anneau plastisol. STL pour un arbre de 12 mm. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier. Dossier supplémentaire 12 : Le noyau du canal de livraison de l’anneau plastisol. STL pour un arbre de 14 mm. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier. Dossier complémentaire 13 : Le dispositif d’infusion directe de plantes. STL. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier. Fichier supplémentaire 14 : Le motif utilisé pour créer le moule de l’anneau plastisol. STL. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Pour que le dispositif DPI soit considéré comme une méthode viable pour l’administration de composés exogènes dans les plantes, il doit contribuer à une absorption robuste et cohérente des composés dans divers types de tissus. L’expérience utilisant CFDA a clairement montré à la fois le mouvement des composés acropétaux et basipétals, ainsi que dans le système vasculaire et les cellules mésophylles de la feuille. De plus, et probablement parce que le trou foré utilisé dans ce dispositif DPI fournit une grande surface pour l’absorption du composé, le CFDA était présent en quantités relativement égales dans toutes les sections de la tige, et pas seulement dans un petit sous-ensemble du système vasculaire adjacent au dispositif, comme on l’a vu dans des études antérieures sur l’absorption de colorant chez des plantes utilisant l’injection de tronc6. De plus, l’administration de protéines fluorescentes vertes et de colorant floral a été testée à l’aide du dispositif DPI, et une distribution de ces composés similaire à celle du CFDA a été observée (données non présentées). Ces données suggèrent que le dispositif peut être utilisé pour délivrer systématiquement une variété de composés dont la taille et la structure moléculaire varient. Cependant, il convient de noter qu’il y avait des différences dans l’absorption des composés en fonction du stade de développement des feuilles, les jeunes feuilles en développement absorbant plus de composés que les feuilles établies plus âgées. Cela peut être dû aux changements dans les propriétés vasculaires présentes dans le tissu de l’évier par rapport au tissu source et devrait être optimisé pour une expérience donnée.

Le dispositif DPI a montré une absorption suffisante de composés pour la visualisation de CFDA, GFP et colorant floral, et il a également pris suffisamment pour montrer les effets antibactériens et insecticides de la streptomycine et de l’imidaclopride, respectivement. Ces deux composés ont entraîné des changements dans la viabilité de l’organisme cible 1 semaine après un seul traitement de 2,0 mL. Ces données suggèrent que le dispositif DPI pourrait être utilisé dans des essais sur des plantes entières pour tester la viabilité d’une grande variété de composés pour la lutte contre les ravageurs microbiens et les insectes. De plus, en raison de son contact direct avec le système vasculaire, ce dispositif peut même être l’occasion de tester des composés qui ne sont pas absorbés efficacement par les racines ou les cellules épidermiques. L’interférence ARN (ARNi) serait particulièrement intéressante, car elle pourrait être utilisée pour moduler l’expression génique au sein de la plante hôte, de l’agent pathogène ou du vecteur pathogène. Des recherches antérieures qui ont introduit l’ARN en épingle à cheveux à travers un trou percé dans le tronc des plants de pomme et de raisin ont montré que les molécules d’ARN étaient limitées au tissu du xylème, ce qui suggère que ces molécules ne peuvent être efficaces que contre les organismes masticateurs et nourrisseurs de sève de xylème22. Étant donné que le dispositif DPI utilise un système d’administration de trous percés similaire, il va de soi que l’ARN en épingle à cheveux livré avec ce dispositif peut également être limité au tissu du xylème. Cependant, la diminution observée du titre des CLas limités par le phloème après le traitement à la streptomycine à partir du dispositif DPI suggère fortement que cet antibiotique était présent dans le phloème. Par conséquent, il est probable que la distribution vasculaire des composés délivrés à l’aide du dispositif DPI dépend de leur taille et de leur chimie, et chaque molécule doit être évaluée sur une base individuelle.

Bien qu’il existe un certain nombre d’appareils DPI disponibles dans le commerce disponibles sur le marché, l’appareil décrit ici peut être fabriqué en interne et est modifiable. De cette façon, des améliorations et des changements de taille peuvent être apportés en fonction de l’espèce végétale et du plan expérimental utilisé, et cela ne dépend pas de produits commerciaux. De plus, le dispositif est fixé de manière semi-permanente à la plante, ce qui signifie que plusieurs traitements d’un composé donné peuvent être effectués simultanément sans avoir à blesser à nouveau la plante avec plusieurs injections de composés. Sur une note de prudence, l’appareil peut fuir s’il n’est pas installé correctement. En conséquence, le composé est perdu dans l’environnement au lieu d’être livré à l’usine. Par conséquent, il faut prendre soin d’inspecter l’appareil pour tout signe de fuite pendant l’installation et les premiers jours suivants. Bien que le forage d’un trou dans l’arbre soit potentiellement nocif, cette méthode a été choisie pour assurer une absorption robuste et constante du composé. De plus, aucun effet néfaste sur la santé des végétaux n’a été observé à partir de la fixation du dispositif DPI dans ces expériences. Cependant, des plantes supplémentaires devraient être incluses dans la conception expérimentale pour remplacer celles qui peuvent perdre de la vigueur au cours d’une expérience donnée. Enfin, comme ce dispositif utilise un flux passif pour introduire des composés, il peut être difficile de prédire le taux d’absorption entre différentes espèces végétales ou stades de développement de la même espèce. Cela peut compliquer les expériences si la vitesse d’absorption des composés est un facteur limitant. Pour de meilleurs résultats, les expériences doivent être planifiées de manière à ce que la plante dispose de suffisamment de temps pour absorber complètement les 2,5 mL de composé, ce qui peut prendre jusqu’à 1 semaine. En conclusion, ce dispositif DPI est un outil efficace pour l’évaluation rapide de l’activité in planta des composés antimicrobiens ou insecticides contre CLas et son vecteur, D. citri, fournissant ainsi plus d’informations sur l’efficacité systémique et l’influence sur la performance des plantes que le test de feuilles détachées23 présenté précédemment. Sans aucun doute, la variété des applications de ce système va bien au-delà des utilisations spécifiques décrites dans cette étude.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les auteurs tiennent à remercier Mant Acon pour les plantes utilisées dans cette étude. Le financement a été fourni par le projet CRIS 8062-22410-007-000-D du département de l’Agriculture des États-Unis (USDA) et la subvention NIFA de l’USDA 2020-70029-33176.

Materials

0.5 cm Diameter Steel Balls Ballistic Products Inc. #SHT #T
10 mL Luer-Lok Syringe Becton Dickinson 382903029952
20 G 1 Syringe Needle Becton Dickinson 305175
2 mL Screw Cap Tubes USA Scientific 1420-9710
3/32nd Inch Black Oxide Drill Bit Sears 964077
3D Printer Markforged F-PR-2027
3D Printing Software Markforged F-SW-FDVX
3D Printing Software Markforged S-FW-OEVX
5(6)-CFDA (5-(and-6)-Carboxyfluorescein Diacetate) Invitrogen C195
5/64th Inch Black Oxide Drill Bit Sears 964502
96 Well qPCR Machine Roche 5815916001
Centrifuge Eppendorf 22621408
Fluorescent Microscope Olympus SP-BX43-BI
Fluorescent Microscope Filter Chroma 69401-ET
Gloss Clear Spray Paint Rustoleum 249117
Grey Lego Baseplate Lego 11024
Handheld Cordless Drill Makita 6349D
Homogenizer Fisher Scientific 15-340-163
Imidacloprid 2F Quali-Pro 83080133
Liquid Plastisol Medium Hardness Fusion X Fishing Lures XSOL-505
Red Silicone 70 Shore A O-Ring Grainger Varies by Size
Non-Stick Cooking Spray PAM 64144030217
NucleoSpin Plant II Macherey-Nagel 740770.5
Parafilm Bemis HS234526A
Poly Viyl Acetate Based Glue Elmers E301
qPCR Master Mix Promega A6001
qPCR Primers Integrated DNA Technologies Varies by DNA sequence
Reverse Transcriptase Promega A5003
Single Edge Razor Blade Garvey 40475
Translucent Silicone RTV Rubber Aero Marine Products AM 115T
Transparent Silicone Tape Maxwell KE30S
Truncated Oncocin 112 Genscript Varies by peptide sequence
White 1 x 6 Lego Piece Lego 300901
White Nylon Markforged F-MF-0003
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Referencias

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Rhodes, B. H., Stange, R. R., Zagorski, P., Hentz, M. G., Niedz, R. P., Shatters, R. G., Pitino, M. Direct Infusion Device for Molecule Delivery in Plants. J. Vis. Exp. (196), e65194, doi:10.3791/65194 (2023).
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