Verhaltenscharakterisierung eines Angelman-Syndrom-Mausmodells

Das Angelman-Syndrom (AS) ist eine seltene neurologische Entwicklungsstörung. Der häufigste genetische Ursprung von AS ist eine große Deletion der 15q11-q13-Region des mütterlichen Chromosoms, die bei fast 74 % der Patienten gefunden wird¹. Die Deletion dieser Region führt zum Verlust von UBE3A, dem Hauptverursacher von AS, das für eine E3-Ubiquitin-Ligase kodiert. Das väterliche Allel des UBE3A-Gens in Neuronen wird in einem Prozess stillgelegt, der als Prägung bezeichnet wird. Folglich erlaubt die väterliche Prägung des Gens nur die mütterliche Expression im Zentralnervensystem (ZNS)². Daher führt die Deletion des UBE3A-Gens vom mütterlichen Chromosom zur Entwicklung von AS-Symptomen. Beim Menschen manifestiert sich AS im Alter von etwa 6 Monaten, mit einer Entwicklungsverzögerung, die in allen Entwicklungsstadien anhält und bei den betroffenen Personen zu schweren schwächenden Symptomen führt ^3,4. Zu den Kernsymptomen der Störung gehören das Defizit der Fein- und Grobmotorik, einschließlich ruckartiger ataktischer Gang, schwere Sprachstörungen und geistige Behinderung. Etwa 80% der AS-Patienten leiden zudem unter Schlafstörungen und Epilepsie. Bisher gibt es nur symptomatische Medikamente, die epileptische Anfälle reduzieren und die Schlafqualität verbessern¹. Daher wird die Entwicklung robuster Tiermodelle mit reproduzierbaren Verhaltensphänotypen zusammen mit einer verfeinerten Phänotypisierungsanalyse unerlässlich sein, um die pathophysiologischen Mechanismen der Störung aufzuklären und wirksame Medikamente und Behandlungen zu finden.

Die Komplexität der menschlichen Erkrankung, die das ZNS betrifft, erfordert, dass Modellorganismen ein vergleichbares Genom, eine vergleichbare Physiologie und ein vergleichbares Verhalten besitzen. Mäuse sind aufgrund ihres kurzen Fortpflanzungszyklus, ihrer geringen Größe und ihrer relativ einfachen DNA-Modifikation als Modellorganismus beliebt. Im Jahr 1984 schlug Paul Willner drei grundlegende Validierungskriterien für Krankheitsmodelle vor: das Konstrukt, das Gesicht und die prädiktive Validität, die verwendet werden, um den Wert des Modells zu bestimmen⁵. Vereinfacht gesagt, spiegelt die Konstruktvalidität die biologischen Mechanismen wider, die für die Entwicklung der Störung verantwortlich sind, die Gesichtsvalidität rekapituliert ihre Symptome und die prädiktive Validität beschreibt das Ansprechen des Modells auf therapeutische Medikamente.

Um den oben genannten Prinzipien gerecht zu werden, haben wir die häufigste genetische Ätiologie, eine große Deletion des mütterlichen 15q11.2-13q-Locus einschließlich des UBE3A-Gens, gewählt, um AS-Modellmäuse zu erzeugen. Wir verwendeten die CRISPR/Cas9-Technik, um eine 76.225 bp lange Region zu löschen, die sich über das gesamte UBE3A-Gen erstreckt und sowohl die kodierenden als auch die nicht-kodierenden Elemente des Gens umfasst, in Mäusen aus einem C57BL/6N-Hintergrund⁶. Anschließend haben wir die Tiere gezüchtet, um UBE3A^+/− heterozygote Mäuse zu erhalten. Für die Gesichtsvalidierung des Modells verwendeten wir Tiere aus Kreuzungen von UBE3A+/−-Weibchen und Wildtyp-Männchen, um UBE3A⁺/- Nachkommen (Stamm mit der Bezeichnung C57BL/6NCrl-UBE3A/Ph und später als UBE3A ^mGenedel/+ bezeichnet) und Kontrollwurfgeschwister zu gewinnen. Wir testeten ihre Fein- und Grobmotorik, ihre Emotionalität und ihren Affekt, um die Kernsymptome des AS zu rekapitulieren. In einem früheren Artikel haben wir auch die kognitiven Funktionen der Tiere untersucht, da AS-Patienten auch an einer geistigen Behinderung leiden⁶. Wir fanden jedoch keine kognitiven Beeinträchtigungen bei UBE3A^mGenedel/+ Mäusen, was möglicherweise auf das junge Alter der Tiere zum Zeitpunkt des Versuchs zurückzuführen^{ist 7}. Eine spätere Untersuchung der älteren Tiere, die etwa 18 Wochen alt waren, ergab ein Defizit in der Verhaltensflexibilität während des Umkehrlernens im Ortspräferenzparadigma. Die Komplexität der für diese Analyse verwendeten Geräte erfordert jedoch ein separates methodisches Modul, das hier nicht enthalten ist.

Die hier vorgestellten Verhaltenstests gehören dank ihres hohen prädiktiven Wertes und ihrer ausreichenden Konstruktvalidität zu den gängigen Phänotypisierungswerkzeugen in der Genforschung ^8,9,10. Wir nutzten diese Tests, um ein Mausmodell für AS zu validieren, indem wir die Kernsymptome der menschlichen Krankheit auf reproduzierbare, altersunabhängige Weise rekapitulierten. Die Emotionalität des Tieres wurde im erhöhten Plus-Labyrinth und im Freifeldversuch bewertet. Beide Tests basieren auf dem Annäherungs-Vermeidungs-Konflikt, bei dem die Tiere auf der Suche nach Nahrung, Unterschlupf oder Paarungsmöglichkeiten eine neue Umgebung erkunden und gleichzeitig angstlösende Kompartimente meiden¹¹. Zusätzlich wird der Freilandtest verwendet, um die Bewegungsaktivität einer Maus zu testen⁸. Der Schwanzsuspensionstest wird häufig in der Depressionsforschung eingesetzt, um nach neuen Antidepressiva oder depressiven Phänotypen in Maus-Knockout-Modellen zu suchen¹². Dieser Test bewertet die Verzweiflung, die Tiere im Laufe der Zeit in einer unentrinnbaren Situation entwickeln. Motorisches Lernen und detaillierte Gangeigenschaften wurden auf dem Rotarod bzw. im DigiGait bestimmt. Die Ausdauer des Tieres auf dem beschleunigenden Stab charakterisiert seine Gleichgewichts- und Bewegungskoordinationsfähigkeiten, während die detaillierte Analyse der Schrittmuster einer Maus eine sensible Bewertung neuromuskulärer Beeinträchtigungen im Zusammenhang mit vielen neurogenerativen Bewegungsstörungen darstellt^13,14,15. Der Nestlet-Zerkleinerungstest ist Teil der Standardmethodik zur Erkennung impulsiven Verhaltens bei Nagetieren, und da er das natürliche Bauverhalten von Nagetieren nutzt, zeigt er das Wohlbefinden des Tieres an^16,17.

Die Größe der Versuchsgruppen war das Ergebnis eines Kompromisses, um die Anforderungen der 3R-Regel zu erfüllen und die Zuchtleistung der Kolonien effizient zu nutzen. Um jedoch eine statistische Aussagekraft zu erhalten, hatten die Gruppen nicht weniger als 10 Individuen, da eine ausreichende Anzahl von Brutpaaren gebildet wurde. Leider führte die Zuchtleistung nicht immer zu einer ausreichenden Anzahl von Tieren.