Mikro-CT-Bildgebung und morphometrische Analyse von Neugeborenengehirnen von Mäusen
Summary
Diese Studie beschreibt die Schritte zur Gewinnung hochauflösender Bilder von neugeborenen Mäusegehirnen durch die Kombination von Mikro-Computertomographie (Mikro-CT) und einem Kontrastmittel in ex vivo-Proben . Wir beschreiben grundlegende morphometrische Analysen, um die Größe und Form des Gehirns in diesen Bildern zu quantifizieren.
Abstract
Neurobilder sind ein wertvolles Werkzeug für die Untersuchung der Gehirnmorphologie in Experimenten mit Tiermodellen. Die Magnetresonanztomographie (MRT) hat sich zur Standardmethode für Weichteile entwickelt, obwohl ihre geringe räumliche Auflösung für Kleintiere einige Grenzen mit sich bringt. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Gewinnung hochauflösender dreidimensionaler (3D) Informationen über Gehirne und Schädel von Mäusen bei Neugeborenen mittels Mikro-Computertomographie (Mikro-CT). Das Protokoll umfasst die Schritte, die erforderlich sind, um die Proben zu sezieren, das Gehirn zu färben und zu scannen und morphometrische Messungen des gesamten Organs und der interessierenden Regionen (ROIs) zu erhalten. Die Bildanalyse umfasst die Segmentierung von Strukturen und die Digitalisierung von Punktkoordinaten. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit, dass die Kombination von Mikro-CT und Lugol-Lösung als Kontrastmittel eine geeignete Alternative für die Darstellung der perinatalen Gehirne von Kleintieren darstellt. Dieser Bildgebungs-Workflow hat Anwendungen in der Entwicklungsbiologie, Biomedizin und anderen Wissenschaften, die daran interessiert sind, die Auswirkungen verschiedener genetischer und umweltbedingter Faktoren auf die Gehirnentwicklung zu bewerten.
Introduction
Die Mikro-Computertomographie (Mikro-CT) ist ein wertvolles Werkzeug für verschiedene Forschungsbereiche. In der Biologie eignet es sich aufgrund der Röntgenabsorption in mineralisiertem Gewebe besonders für die Knochenforschung. Aufgrund dieser Eigenschaft wurden verschiedene Fragestellungen u.a. zur Knochenentwicklung1, zum Stoffwechsel2 und zur Evolution 3,4 mit Hilfe der Mikro-CT angegangen. Im Jahr 2008 zeigten de Crespigny et al.5, dass Mikro-CT-Bilder von erwachsenen Mäuse- und Kaninchengehirnen mit Jod als Kontrastmittel erhalten werden konnten. Diese Arbeit eröffnete eine neue Anwendung für diese bildgebende Technik, da Jod die Aufnahme von Bildern von Weichteilen ermöglichte, die sonst unempfindlich gegenüber Röntgenstrahlen wären. Das allgemeine Ziel der Kombination von Mikro-CT und einem jodbasierten Kontrastmittel ist es daher, hochauflösende Bilder zu erhalten, in denen Weichteile auf meso- oder makroanatomischer Ebene unterschieden und identifiziert werden können.
Diese Technik hat ein bemerkenswertes Potenzial für Studien, die eine detaillierte phänotypische Ex-vivo-Charakterisierung kleiner Proben wie Mausembryonen erfordern, die in experimentellen Designs weit verbreitet sind6. Jodkontrast in Kombination mit Mikro-CT-Bildgebung wurde verwendet, um volumetrische Quantifizierungen von Organen7 und dreidimensionalen (3D) Strukturen 8,9 zu erhalten. In den letzten Jahren wurde das Mikro-CT-Scannen von gefärbten Proben angewendet, um phänotypische Merkmale des Gehirns von Nagetieren zu beschreiben10, und es wurden verschiedene Verbesserungen der Technik vorgeschlagen. Für erwachsene Gehirne wurde festgestellt, dass ein Protokoll von 48 Stunden Eintauchen in Jod mit einem vorherigen Perfusionsschritt mit einem Hydrogel Bilder von hoher Qualität lieferte11. Gignac et al.12 erweiterten die Grenzen dieser Technik, indem sie zeigten, dass mit Jod gefärbte Rattengehirne verarbeitet werden können, um histologische Routinetechniken durchzuführen. In ähnlicher Weise zeigen diese Verfahren vielversprechende Ergebnisse für embryonale und vorentwöhnte Nagetiergehirne 8,13,14,15.
Obwohl die Neurowissenschaften weitgehend mikroskopbasierte Techniken angewendet haben, um verschiedene strukturelle und funktionelle Aspekte der Gehirnentwicklung zu bewerten, eignen sich solche Studien eher zur Charakterisierung spezifischer Zellpopulationen oder räumlich begrenzter Strukturen. Umgekehrt ermöglicht die Mikro-CT-Bildgebung die Beschreibung ganzer Strukturen und die Erfassung von 3D-Modellen, die relevante räumliche Informationen erhalten, was eine Ergänzung zu mikroskopischen Techniken darstellt. Die Magnetresonanztomographie (MRT) ist auch eine Standardtechnik, die zur Untersuchung der strukturellen Merkmale von Kleintieren angewendet wird 16,17,18. Die Mikro-CT mit Kontrastmittel hat jedoch zwei wesentliche Vorteile für ex vivo fixierte Proben: Mikro-CT-Scanner sind weitgehend kostengünstiger und einfach zu bedienen und ermöglichen eine höhere räumliche Auflösung als MRT12.
Diese Arbeit zielt darauf ab, das Verfahren zu beschreiben, um hochauflösende Bilder von neugeborenen Mäusegehirnen mittels Mikro-CT-Scan nach Färbung mit Lugol-Lösung, einem jodbasierten Kontrastmittel, zu erhalten. Es wird ein umfassendes Protokoll vorgestellt, das mit vorbereitenden Phasen wie der Probenentnahme und Fixierung von Geweben beginnt und die Färbung, die Mikro-CT-Bildaufnahme und die Standardverarbeitung durchläuft. Die Bildverarbeitung umfasst die Segmentierung eines 3D-Volumens des gesamten Kopfes sowie des Gehirns und die Auswahl spezifischer anatomischer Ebenen zur Digitalisierung von Punktkoordinaten, die dann für morphometrische Analysen verwendet werden könnten. Obwohl der Fokus hier auf dem neonatalen Mäusegehirn liegt, können ähnliche Strategien auf andere Weichteile angewendet werden. Somit ist das hier vorgestellte Protokoll flexibel genug, um mit subtilen Modifikationen auf andere Arten von Proben angewendet zu werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dieser Arbeit wird ein prägnantes Protokoll zum Scannen von neonatalem Hirngewebe von Mäusen mittels Mikro-CT mit einem Kontrastmittel vorgestellt. Darüber hinaus enthält es einfache Verfahren zur Erzielung quantitativer und qualitativer Ergebnisse. Aufbauend auf diesen Methoden können weitere alternative oder ergänzende Analysen durchgeführt werden.
Wie im Protokoll gezeigt, können Mikro-CT-Bilder auf unterschiedliche Weise analysiert werden. In früheren Studien schätzte unsere G…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Wei Liu für seine technische Unterstützung. Diese Arbeit wird von ANPCyT PICT 2017-2497 und PICT 2018-4113 finanziert.
Materials
| µCT 35 | Scanco Medical AG | Note that Scanco does not offer the µCT 35 anymore. Their smallest scanner is now the µCT 45 | |
| Avizo | Visualization Sciences Group, VSG | ||
| C57BL/6 Mice | Bioterio Facultad de Ciencias Veterinarias Universidad Nacional de La Plata | ||
| Conical tubes | Daigger | CH-CI4610-1856 | |
| Flux cabinet | Esco | AC2-458 | |
| Glass beaker | Glassco | GL-229.202.10 | |
| Glass bottle | Simax | CFB017 | |
| Glass funnel | HDA | VI1108 | |
| HCl | Carlo Erba | 403872 | Manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves) |
| I2 | Cicarelli | 804211 | When preparing I2KI, manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves) |
| KI | Cicarelli | PA131542.1210 | When preparing I2KI, manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves) |
| Magnetic stirring | Arcano | 4925 | |
| NaOH | Cicarelli | 1580110 | Manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves) |
| Orbital shaker | Biomint | BM021 | |
| Paraformaldehyde | Biopack | 2000959400 | Manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves) |
| Paton spatula | Glassco | GL-377.303.01 | |
| PBS | Biopack | 2000988800 | |
| Plastic Pasteur pipette | Daigger | 9153 | |
| R | R Project | The package geomorph for R was used in the protocol (https://cran.r-project.org/web/packages/geomorph/index.html) | |
| Scissors | Belmed | ||
| Sodium azide | Biopack | 2000163500 | |
| Thermometer | Daigger | 7650 |
Referencias
- Altman, A. R., et al. Quantification of skeletal growth, modeling, and remodeling by in vivo micro-computed tomography. Bone. 81, 370-379 (2015).
- Wehrle, E., et al. Spatio-temporal characterization of fracture healing patterns and assessment of biomaterials by time-lapsed in vivo micro-computed tomography. Scientific Reports. 11 (1), 8660 (2021).
- Arístide, L., et al. Brain shape convergence in the adaptive radiation of New World monkeys. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (8), 2158-2163 (2016).
- Paluh, D. J., Stanley, E. L., Blackburn, D. C. Evolution of hyperossification expands skull diversity in frogs. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (15), 8554-8562 (2020).
- de Crespigny, A., et al. 3D micro-CT imaging of the postmortem brain. Journal of Neuroscience Methods. 171 (2), 207-213 (2008).
- Gignac, P. M., et al. Diffusible iodine-based contrast-enhanced computed tomography (diceCT): an emerging tool for rapid, high-resolution, 3-D imaging of metazoan soft tissues. Journal of Anatomy. 228 (6), 889-909 (2016).
- Wong, M. D., Dorr, A. E., Walls, J. R., Lerch, J. P., Henkelman, R. M. A novel 3D mouse embryo atlas based on micro-CT. Development. 139 (17), 3248-3256 (2012).
- Gonzalez, P. N., et al. Chronic protein restriction in mice impacts placental function and maternal body weight before fetal growth. PLoS One. 11 (3), 0152227 (2016).
- Watanabe, A., et al. Are endocasts good proxies for brain size and shape in archosaurs throughout ontogeny. Journal of Anatomy. 234 (3), 291-305 (2019).
- Gignac, P. M., Kley, N. J. The utility of diceCT imaging for high-throughput comparative neuroanatomical studies. Brain, Behavior and Evolution. 91 (3), 180-190 (2018).
- Anderson, R., Maga, A. M. A novel procedure for rapid imaging of adult mouse brains with microCT using iodine-based contrast. PLoS One. 10 (11), e0142974 (2015).
- Gignac, P. M., O’Brien, H. D., Sanchez, J., Vazquez-Sanroman, D. Multiscale imaging of the rat brain using an integrated diceCT and histology workflow. Brain Structure & Function. 226 (7), 2153-2168 (2021).
- Wong, M. D., Spring, S., Henkelman, R. M. Structural stabilization of tissue for embryo phenotyping using micro-CT with iodine staining. PLoS One. 8 (12), e84321 (2013).
- Barbeito-Andrés, J., et al. Congenital Zika syndrome is associated with maternal protein malnutrition. Science Advances. 6 (2), (2020).
- Handschuh, S., Glösmann, M. Mouse embryo phenotyping using X-ray microCT. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 949184 (2022).
- Turnbull, D. H., Mori, S. MRI in mouse developmental biology. NMR in Biomedicine. 20 (3), 265-274 (2007).
- Qiu, L. R., et al. Mouse MRI shows brain areas relatively larger in males emerge before those larger in females. Nature Communications. 9, 2615 (2018).
- Lerch, J. P., Sled, J. G., Henkelman, R. M. MRI phenotyping of genetically altered mice. Methods in Molecular Biology. 711, 349-361 (2011).
- Gonzalez, P. N., Kristensen, E., Morck, D. W., Boyd, S., Hallgrímsson, B. Effects of growth hormone on the ontogenetic allometry of craniofacial bones. Evolution & Development. 15 (2), 133-145 (2016).
- Metscher, B. D. MicroCT for developmental biology: a versatile tool for high-contrast 3D imaging at histological resolutions. Developmental Dynamics. 238 (3), 632-640 (2009).
- Vickerton, P., Jarvis, J., Jeffery, N. Concentration-dependent specimen shrinkage in iodine-enhanced microCT. Journal of Anatomy. 223 (2), 185-193 (2013).
- Dawood, Y., et al. Reducing soft-tissue shrinkage artefacts caused by staining with Lugol’s solution. Scientific Reports. 11, 19781 (2021).
