小鼠新生儿脑的显微CT成像和形态分析
Summary
本研究描述了通过结合显微计算机断层扫描 （micro-CT） 和造影剂在 离体 样本中获得新生小鼠大脑高分辨率图像的步骤。我们描述了基本的形态测量分析，以量化这些图像中的大脑大小和形状。
Abstract
神经图像是使用动物模型在实验中研究大脑形态的宝贵工具。磁共振成像（MRI）已成为软组织的标准方法，尽管其低空间分辨率对小动物造成了一些限制。在这里，我们描述了一种使用显微计算机断层扫描（micro-CT）获取小鼠新生儿大脑和颅骨的高分辨率三维（3D）信息的方案。该协议包括解剖样本、染色和扫描大脑以及获得整个器官和感兴趣区域 （ROI） 的形态测量值所需的步骤。图像分析包括结构的分割和点坐标的数字化。总之，这项工作表明，将micro-CT和Lugol溶液作为造影剂的组合是小动物围产期大脑成像的合适替代方案。这种成像工作流程在发育生物学、生物医学和其他科学中都有应用，这些科学对评估各种遗传和环境因素对大脑发育的影响感兴趣。
Introduction
显微计算机断层扫描 （micro-CT） 成像是不同研究领域的宝贵工具。在生物学中，由于X射线在矿化组织中的吸收，它特别适用于骨骼研究。由于这一特点，在显微CT的帮助下，已经解决了有关骨骼发育1、代谢2和进化3,4等主题的各种问题。2008 年，de Crespigny 等人 5 表明，使用碘作为造影剂可以获得成年小鼠和兔子大脑的显微 CT 图像。这项工作为这种成像技术开辟了新的应用，因为碘允许从软组织获取图像，否则这些图像对X射线不敏感。因此，将显微CT和碘造影剂相结合的总体目标是获得高分辨率图像，其中可以在中观或宏观解剖学水平上区分和识别软组织。
该技术在需要对小标本（如小鼠胚胎）进行详细的离体表型表征的研究方面具有显着的潜力，这些标本广泛用于实验设计6。碘造影剂与显微 CT 成像相结合已用于获得器官7 和标志性三维 （3D） 结构 8,9 的体积定量。近年来，染色样本的显微CT扫描已被应用于描述啮齿动物的大脑表型特征10，并提出了对该技术的不同改进。对于成人大脑，发现将48小时浸泡在碘中，并用水凝胶灌注的先前步骤，可产生高质量的图像11。Gignac等人12扩大了该技术的局限性，表明可以对用碘染色的大鼠大脑进行处理以执行常规组织学技术。同样，这些程序对胚胎和断奶前啮齿动物的大脑8,13,14,15显示出有希望的结果。
尽管神经科学在很大程度上应用了基于显微镜的技术来评估大脑发育的不同结构和功能方面，但这些研究更适合表征特定的细胞群或空间有限的结构。相反，显微CT成像可以描述整个结构并获取保留相关空间信息的3D模型，这是对显微技术的补充。磁共振成像（MRI）也是一种用于探索小动物结构特征的标准技术16,17,18。然而，使用造影剂的显微 CT 对于离体固定样本有两个主要优点：显微 CT 扫描仪成本低得多且易于操作，并且比 MRI12 具有更高的空间分辨率。
这项工作旨在描述在用碘基造影剂 Lugol 溶液染色后使用显微 CT 扫描从新生小鼠大脑获取高分辨率图像的过程。提出了一个全面的方案，从样本采集和组织固定等初步阶段开始，经过染色、显微 CT 图像采集和标准处理。图像处理包括对整个头部和大脑的 3D 体积进行分割，以及选择特定的解剖平面以数字化点坐标，然后可用于形态测量分析。虽然这里的重点是新生小鼠的大脑，但类似的策略可以应用于其他软组织。因此，这里介绍的方案足够灵活，只需稍作修改即可应用于其他类型的样品。
Protocol
Representative Results
Discussion
在这项工作中，介绍了一种使用显微CT和造影剂扫描小鼠新生儿脑组织的简明方案。此外，它还包括获得定量和定性输出的简单程序。在这些方法的基础上，可以进行进一步的替代或补充分析。
如协议所示，可以通过不同的方式分析显微CT图像。在之前的研究中，我们小组通过数字化点坐标和应用几何形态测量技术来估计小鼠围产期大脑的大小和形状变化 <su…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢刘伟的技术援助。这项工作由 ANPCyT PICT 2017-2497 和 PICT 2018-4113 资助。
Materials
| µCT 35 | Scanco Medical AG | Note that Scanco does not offer the µCT 35 anymore. Their smallest scanner is now the µCT 45 | |
| Avizo | Visualization Sciences Group, VSG | ||
| C57BL/6 Mice | Bioterio Facultad de Ciencias Veterinarias Universidad Nacional de La Plata | ||
| Conical tubes | Daigger | CH-CI4610-1856 | |
| Flux cabinet | Esco | AC2-458 | |
| Glass beaker | Glassco | GL-229.202.10 | |
| Glass bottle | Simax | CFB017 | |
| Glass funnel | HDA | VI1108 | |
| HCl | Carlo Erba | 403872 | Manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves) |
| I2 | Cicarelli | 804211 | When preparing I2KI, manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves) |
| KI | Cicarelli | PA131542.1210 | When preparing I2KI, manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves) |
| Magnetic stirring | Arcano | 4925 | |
| NaOH | Cicarelli | 1580110 | Manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves) |
| Orbital shaker | Biomint | BM021 | |
| Paraformaldehyde | Biopack | 2000959400 | Manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves) |
| Paton spatula | Glassco | GL-377.303.01 | |
| PBS | Biopack | 2000988800 | |
| Plastic Pasteur pipette | Daigger | 9153 | |
| R | R Project | The package geomorph for R was used in the protocol (https://cran.r-project.org/web/packages/geomorph/index.html) | |
| Scissors | Belmed | ||
| Sodium azide | Biopack | 2000163500 | |
| Thermometer | Daigger | 7650 |
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