التصوير المقطعي المحوسب الدقيق والتحليل المورفومتري لأدمغة حديثي الولادة في الفئران
Summary
تصف هذه الدراسة خطوات الحصول على صور عالية الدقة لأدمغة الفئران حديثي الولادة من خلال الجمع بين التصوير المقطعي المحوسب الدقيق (micro-CT) وعامل التباين في عينات خارج الجسم الحي . نصف التحليلات المورفومترية الأساسية لتحديد حجم الدماغ وشكله في هذه الصور.
Abstract
الصور العصبية هي أداة قيمة لدراسة مورفولوجيا الدماغ في التجارب باستخدام النماذج الحيوانية. أصبح التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) الطريقة القياسية للأنسجة الرخوة ، على الرغم من أن دقته المكانية المنخفضة تفرض بعض القيود على الصغيرة. هنا ، نصف بروتوكولا للحصول على معلومات ثلاثية الأبعاد عالية الدقة (3D) عن أدمغة وجماجم حديثي الولادة في الفئران باستخدام التصوير المقطعي المحوسب الدقيق (micro-CT). يتضمن البروتوكول تلك الخطوات اللازمة لتشريح العينات ، وصبغ الدماغ ومسحه ضوئيا ، والحصول على قياسات مورفومترية للعضو بأكمله والمناطق ذات الاهتمام (ROIs). يتضمن تحليل الصور تجزئة الهياكل ورقمنة إحداثيات النقاط. باختصار ، يوضح هذا العمل أن الجمع بين التصوير المقطعي المحوسب الدقيق ومحلول Lugol كعامل تباين هو بديل مناسب لتصوير أدمغة الصغيرة في الفترة المحيطة بالولادة. يحتوي سير عمل التصوير هذا على تطبيقات في علم الأحياء التنموي والطب الحيوي والعلوم الأخرى المهتمة بتقييم تأثير العوامل الوراثية والبيئية المتنوعة على نمو الدماغ.
Introduction
يعد التصوير المقطعي المحوسب الدقيق (micro-CT) أداة قيمة لمختلف مجالات البحث. في علم الأحياء ، وهي مناسبة بشكل خاص لأبحاث العظام بسبب امتصاص الأشعة السينية في الأنسجة المعدنية. بسبب هذه الميزة ، تم تناول أسئلة متنوعة تتعلق بتطور العظام1 ، والتمثيل الغذائي2 ، والتطور3،4 ، من بين مواضيع أخرى ، بمساعدة التصوير المقطعي المحوسب الدقيق. في عام 2008 ، أظهر de Crespigny et al.5 أنه يمكن الحصول على صور التصوير المقطعي المحوسب الدقيقة لأدمغة الفئران والأرانب البالغة باستخدام اليود كعامل تباين. فتح هذا العمل تطبيقا جديدا لتقنية التصوير هذه ، حيث سمح اليود بالحصول على صور من الأنسجة الرخوة التي ستكون غير حساسة للأشعة السينية. وبالتالي ، فإن الهدف العام من الجمع بين التصوير المقطعي المحوسب الدقيق وعامل التباين القائم على اليود هو الحصول على صور عالية الدقة ، حيث يمكن تمييز الأنسجة الرخوة وتحديدها على المستوى التشريحي المتوسط أو الكلي.
هذه التقنية لديها إمكانات ملحوظة للدراسات التي تتطلب توصيفا مفصلا للنمط الظاهري خارج الجسم الحي للعينات الصغيرة ، مثل أجنة الفئران ، والتي تستخدم على نطاق واسع في التصاميم التجريبية6. وقد استخدم تباين اليود في تركيبة مع التصوير المقطعي المحوسب الدقيق للحصول على الكميات الحجمية للأعضاء7 والهياكل ثلاثية الأبعاد (3D) 8,9. في السنوات الأخيرة ، تم تطبيق المسح الضوئي بالأشعة المقطعية الدقيقة للعينات الملطخة لوصف السمات الظاهرية للدماغ للقوارض10 ، وتم اقتراح تحسينات مختلفة على التقنية. بالنسبة لأدمغة البالغين ، تم العثور على بروتوكول 48 ساعة من الغمر في اليود ، مع خطوة سابقة من التروية مع هيدروجيل ، لإنتاج صور عالية الجودة11. وسع Gignac et al.12 حدود هذه التقنية من خلال إظهار أن أدمغة الفئران الملطخة باليود يمكن معالجتها لأداء التقنيات النسيجية الروتينية. وبالمثل ، تظهر هذه الإجراءات نتائج واعدة لأدمغة القوارض الجنينية وما قبل الفطام8،13،14،15.
على الرغم من أن علم الأعصاب قد طبق إلى حد كبير التقنيات القائمة على المجهر لتقييم الجوانب الهيكلية والوظيفية المختلفة لنمو الدماغ ، إلا أن هذه الدراسات أكثر ملاءمة لتوصيف مجموعات خلايا معينة أو هياكل محدودة مكانيا. على العكس من ذلك ، يسمح التصوير المقطعي المحوسب الدقيق بوصف الهياكل الكاملة واكتساب نماذج 3D التي تحافظ على المعلومات المكانية ذات الصلة ، والتي تكمل التقنيات المجهرية. التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) هو أيضا تقنية قياسية يتم تطبيقها لاستكشاف السمات الهيكلية للحيوانات الصغيرة16،17،18. ومع ذلك ، فإن التصوير المقطعي المحوسب الدقيق ، باستخدام عامل تباين ، له ميزتان رئيسيتان للعينات الثابتة خارج الجسم الحي : الماسحات الضوئية الدقيقة بالأشعة المقطعية أقل تكلفة إلى حد كبير وسهلة التشغيل ، وتسمح بدقة مكانية أعلى من التصوير بالرنين المغناطيسي12.
يهدف هذا العمل إلى وصف الإجراء للحصول على صور عالية الدقة من أدمغة الفئران حديثي الولادة باستخدام التصوير المقطعي المحوسب الدقيق بعد تلطيخها بمحلول Lugol ، وهو عامل تباين قائم على اليود. يتم تقديم بروتوكول شامل ، والذي يبدأ بمراحل أولية مثل جمع العينات وتثبيت الأنسجة ، ويمر عبر التلوين ، والحصول على صور التصوير المقطعي المحوسب الدقيق ، والمعالجة القياسية. تتضمن معالجة الصور تجزئة حجم 3D للرأس الكامل ، وكذلك الدماغ ، واختيار مستويات تشريحية محددة لرقمنة إحداثيات النقاط التي يمكن استخدامها بعد ذلك في التحليلات المورفومترية. على الرغم من أن التركيز هنا هو دماغ الفأر الوليدي ، إلا أنه يمكن تطبيق استراتيجيات مماثلة على الأنسجة الرخوة الأخرى. وبالتالي ، فإن البروتوكول المقدم هنا مرن بما يكفي لتطبيقه ، مع تعديلات طفيفة ، على أنواع أخرى من العينات.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذا العمل ، تم تقديم بروتوكول موجز لمسح أنسجة دماغ الأطفال حديثي الولادة للفئران باستخدام التصوير المقطعي المحوسب الدقيق مع عامل تباين. بالإضافة إلى ذلك ، يتضمن إجراءات بسيطة للحصول على مخرجات كمية ونوعية. واستنادا إلى هذه الأساليب، يمكن إجراء المزيد من التحليلات البديلة أو التكميلية…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونشكر وي ليو على مساعدته التقنية. يتم تمويل هذا العمل من قبل ANPCyT PICT 2017-2497 و PICT 2018-4113.
Materials
| µCT 35 | Scanco Medical AG | Note that Scanco does not offer the µCT 35 anymore. Their smallest scanner is now the µCT 45 | |
| Avizo | Visualization Sciences Group, VSG | ||
| C57BL/6 Mice | Bioterio Facultad de Ciencias Veterinarias Universidad Nacional de La Plata | ||
| Conical tubes | Daigger | CH-CI4610-1856 | |
| Flux cabinet | Esco | AC2-458 | |
| Glass beaker | Glassco | GL-229.202.10 | |
| Glass bottle | Simax | CFB017 | |
| Glass funnel | HDA | VI1108 | |
| HCl | Carlo Erba | 403872 | Manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves) |
| I2 | Cicarelli | 804211 | When preparing I2KI, manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves) |
| KI | Cicarelli | PA131542.1210 | When preparing I2KI, manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves) |
| Magnetic stirring | Arcano | 4925 | |
| NaOH | Cicarelli | 1580110 | Manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves) |
| Orbital shaker | Biomint | BM021 | |
| Paraformaldehyde | Biopack | 2000959400 | Manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves) |
| Paton spatula | Glassco | GL-377.303.01 | |
| PBS | Biopack | 2000988800 | |
| Plastic Pasteur pipette | Daigger | 9153 | |
| R | R Project | The package geomorph for R was used in the protocol (https://cran.r-project.org/web/packages/geomorph/index.html) | |
| Scissors | Belmed | ||
| Sodium azide | Biopack | 2000163500 | |
| Thermometer | Daigger | 7650 |
Referencias
- Altman, A. R., et al. Quantification of skeletal growth, modeling, and remodeling by in vivo micro-computed tomography. Bone. 81, 370-379 (2015).
- Wehrle, E., et al. Spatio-temporal characterization of fracture healing patterns and assessment of biomaterials by time-lapsed in vivo micro-computed tomography. Scientific Reports. 11 (1), 8660 (2021).
- Arístide, L., et al. Brain shape convergence in the adaptive radiation of New World monkeys. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (8), 2158-2163 (2016).
- Paluh, D. J., Stanley, E. L., Blackburn, D. C. Evolution of hyperossification expands skull diversity in frogs. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (15), 8554-8562 (2020).
- de Crespigny, A., et al. 3D micro-CT imaging of the postmortem brain. Journal of Neuroscience Methods. 171 (2), 207-213 (2008).
- Gignac, P. M., et al. Diffusible iodine-based contrast-enhanced computed tomography (diceCT): an emerging tool for rapid, high-resolution, 3-D imaging of metazoan soft tissues. Journal of Anatomy. 228 (6), 889-909 (2016).
- Wong, M. D., Dorr, A. E., Walls, J. R., Lerch, J. P., Henkelman, R. M. A novel 3D mouse embryo atlas based on micro-CT. Development. 139 (17), 3248-3256 (2012).
- Gonzalez, P. N., et al. Chronic protein restriction in mice impacts placental function and maternal body weight before fetal growth. PLoS One. 11 (3), 0152227 (2016).
- Watanabe, A., et al. Are endocasts good proxies for brain size and shape in archosaurs throughout ontogeny. Journal of Anatomy. 234 (3), 291-305 (2019).
- Gignac, P. M., Kley, N. J. The utility of diceCT imaging for high-throughput comparative neuroanatomical studies. Brain, Behavior and Evolution. 91 (3), 180-190 (2018).
- Anderson, R., Maga, A. M. A novel procedure for rapid imaging of adult mouse brains with microCT using iodine-based contrast. PLoS One. 10 (11), e0142974 (2015).
- Gignac, P. M., O’Brien, H. D., Sanchez, J., Vazquez-Sanroman, D. Multiscale imaging of the rat brain using an integrated diceCT and histology workflow. Brain Structure & Function. 226 (7), 2153-2168 (2021).
- Wong, M. D., Spring, S., Henkelman, R. M. Structural stabilization of tissue for embryo phenotyping using micro-CT with iodine staining. PLoS One. 8 (12), e84321 (2013).
- Barbeito-Andrés, J., et al. Congenital Zika syndrome is associated with maternal protein malnutrition. Science Advances. 6 (2), (2020).
- Handschuh, S., Glösmann, M. Mouse embryo phenotyping using X-ray microCT. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 949184 (2022).
- Turnbull, D. H., Mori, S. MRI in mouse developmental biology. NMR in Biomedicine. 20 (3), 265-274 (2007).
- Qiu, L. R., et al. Mouse MRI shows brain areas relatively larger in males emerge before those larger in females. Nature Communications. 9, 2615 (2018).
- Lerch, J. P., Sled, J. G., Henkelman, R. M. MRI phenotyping of genetically altered mice. Methods in Molecular Biology. 711, 349-361 (2011).
- Gonzalez, P. N., Kristensen, E., Morck, D. W., Boyd, S., Hallgrímsson, B. Effects of growth hormone on the ontogenetic allometry of craniofacial bones. Evolution & Development. 15 (2), 133-145 (2016).
- Metscher, B. D. MicroCT for developmental biology: a versatile tool for high-contrast 3D imaging at histological resolutions. Developmental Dynamics. 238 (3), 632-640 (2009).
- Vickerton, P., Jarvis, J., Jeffery, N. Concentration-dependent specimen shrinkage in iodine-enhanced microCT. Journal of Anatomy. 223 (2), 185-193 (2013).
- Dawood, Y., et al. Reducing soft-tissue shrinkage artefacts caused by staining with Lugol’s solution. Scientific Reports. 11, 19781 (2021).
