In vitroモデルとしての新生児蝸牛外植片全体

すべての動物の処置は、スイスのバーゼル市の動物福祉委員会のガイドラインと規制に従って行われました。実験には、出生後のC57BL/6JRマウス、Wistarラット、およびSTAT1欠損マウス(C57BL/6-129/SvEvの混合)7(3-5日齢)と 雌雄のマウスを使用しました。 1. マルチウェルチャンバーのコーティング 完全な培地を準備します。コルチ外植片の器官には、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)、10%ウシ胎児血清(FBS)、25 mM HEPES、および30 U/mLペニシリンを含む培地を調製します。 コルチ外植片および蝸牛外植片の臓器には、DMEM/F12、N2サプリメント1個、抗酸化物質を除いたB271個、およびペニシリン30 U/mLを含む培地を調製します。 層流フード内で5 mgのポリ-D-リジンに10 mLの細胞培養水を加えて、ポリ-D-リジンのストック溶液を調製します。ポリ-D-リジンの最終濃度は0.5 mg/mLです。注:残りの原液を分注し、-20°Cで保存します。原液を滅菌水で1:10に希釈して、ポリ-D-リジンの作業溶液を調製します。 8ウェルチャンバーに150 μL/ウェルのポリ-D-リジンワーキング溶液をコーティングし、室温で30分間インキュベートします。注:4ウェルチャンバーを使用する場合は、300 μL/ウェルのポリ-D-リジンワーキング溶液でコーティングします。 真空またはピペッティングで溶液を吸引します。 200 μLの滅菌水で2回洗浄し、200 μLの完全培地またはDMEMで1回洗浄します。 各ウェルに150μLの完全培地を添加します。注:4ウェルチャンバーを使用する場合は、250 μL/ウェルの完全培地を添加します。 チャンバーを37°C、5%CO2 のインキュベーターに少なくとも30分間置いてから、外植片を配置します。 2.側頭骨の解剖 手術台を70%エタノールで消毒し、ガラス製の微小球滅菌器ですべての器具を滅菌します。 滅菌した60mmシャーレを氷の入ったバケツに置きます。 数ミリリットルの1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を注ぎ、氷上に保管します。注:細菌汚染を避けるために、1x PBSに30 U/mLのペニシリンを使用してください。 滅菌パッドを滅菌トレイに置き、操作ハサミで子犬の動物の首をすばやく切り落とします。汚染が頻繁に発生する場合は、ヘッドを70%エタノールに5秒間浸します。注:このプロトコルは、P3〜P5の年齢のマウスおよびラットでテストされました。蝸牛組織は、高齢のマウスやラットから解剖するのが難しく、培養中の外植片の生存は限られています。 動物の頭を滅菌パッドの上に置きます。下顎骨を取り除きます。皮膚を持ち上げ、頭蓋骨から剥がします。 鉗子を眼窩腔に配置して頭蓋骨を保持します。 矢状縫合糸に沿って頭蓋骨を慎重に切断し、蝸牛を傷つけることなく鋭利なメスの刃で冠状縫合糸領域を切断します。注意: 無理な圧力をかけたり、メスで前後に動かしたりすると、蝸牛の骨、ひいては蝸牛管が損傷する可能性があるため、避けてください。 2つの頭蓋骨の半分から脳を慎重に取り除きます。 頭蓋骨の半分を、ステップ2.3で調製した氷冷PBSを入れた60mmのシャーレに移します。 3.蝸牛の分離 顕微鏡下で側頭骨の蝸牛を局在化させます。鉗子を上半規管に入れます。 インスリン注射器(マウス)または鉗子(ラット)を使用して、蝸牛と側頭骨の間の周囲の組織を緩めます。 側頭骨を慎重に蝸牛から引き離し、蝸牛を側頭骨で前庭に取り付けたままにします。側頭骨を脇に押し出す前に、蝸牛が周囲の組織から自由であることを確認してください。注意: 力を入れすぎると、蝸牛管が損傷します。 蝸牛を固定位置に保持し、もう一方の手で軟骨性蝸牛カプセルを慎重に取り出します。鉗子の先端を頂点領域またはターンの間(白い線で見える)に慎重に挿入し、カプセルを少しずつ取り外します。蝸牛管を露出させます。 鉗子を蝸牛の下に慎重に置き、前庭器官と側頭骨から取り外します。 蝸牛を氷冷PBSを含む新しい60mmディッシュに移します。 顕微鏡の倍率を調整して、外植片をよりよく視覚化します。 コルチ外植片の器官については、次の手順に従います。鉗子で臓器を基部に保持します。蝸牛管を鉗子でつかんで、基底フック領域を静かに取り外します。 蝸牛管を引き裂かずに、蝸牛管から巻き戻します。 線条血管筋のあるらせん靭帯を、臓器の根元を持って引き離して慎重に取り除きます。注:組織の分離は、ベース領域の代わりに頂点領域を保持することによっても達成できます。これは、ラットの臓器や高齢のマウスの仔マウス(>P5)を解剖する際に役立ちます。 ライスナー膜を根元に保持し、少しずつ引き剥がして、慎重に取り除きます。注:これは、ライスナー膜がイメージングの取得を妨げないため、オプションのステップです。 蝸牛外植片の場合は、次の手順に従います。インスリン注射器(マウス)または鉗子(ラット)を使用して、骨性らせん状椎弓層かららせん神経節を剥離します。 デタッチメント中にモディオルスを静かにほどきます。注:外植片は、取り扱いを改善するために2つに分けることができます。 鉗子でフック領域をつかみます。 線条血管筋のあるらせん靭帯を引き抜いて慎重に取り外します。 ライスナー膜を根元に保持し、少しずつ引き剥がして、慎重に取り除きます。注:ライスナー膜は通常、ニューロンフィラメントを折りたたんで覆うため、実験に影響を与える可能性があるため、この手順をお勧めします。 4. 蝸牛外植片の培養 外植片をペトリ皿からマルチウェルチャンバーに移します。有毛細胞を上に向けて、実験室のスパチュラを使用して外植片を持ち上げます。サンプルがヘラにくっつかないように、数マイクロリットルの1x PBSを含めます。注意: ひどく損傷した外植片はヘラに付着します。 培地の中でスパチュラを静かに振って、外植片をスパチュラからチャンバーにスライドさせます。8ウェルチャンバースライドのウェルごとに1つの外植片を配置します。注意: 外植片がヘラにくっつく場合は、ヘラを培地に入れ、鉗子を使用して外植片を取り外します。鉗子は常に外植片の内側の境界(有毛細胞から離れた場所)に配置します。 外植片が正しい向きに移され、ウェルの中央に配置されていることを顕微鏡で確認します。注:有毛細胞が下を向いている外植片の向きが間違っていると、幅に沿って上向きにU字型を示す傾向があります。外植片をチャンバーの隅に移動して向きを修正し(より多くの培地が利用可能です)、回転するように指示します。 100 μLのピペットを使用して培地80 μLを除去し、廃棄します。 有毛細胞とらせん神経節ニューロン細胞が見えるかどうかを顕微鏡で確認します。必要に応じて、鉗子を使用して、重なり合った組織をそっと押し広げます。 残りの培地を取り除き、~10秒待ちます。 培地をピペットでつなぎます。外植片の隣に培地を1〜2滴加え、残りの培地を外植片から少し離れた場所に追加して、外植片が剥がれないようにします。注:外植片がチャンバーに付着している場合でも、外植片の隣に1〜2滴ピペッティングして培地を必ず最初に添加する必要があります。このようにして、残りの完全な培地が添加されても、外植片は持ち上げられません。 チャンバーをインキュベーターに戻し、2時間インキュベートして、臓器がチャンバーの底にしっかりと付着できるようにします。 培地を取り除き、100 μLまたは200 μLのピペットを使用して、300 μLの予熱した新鮮な完全培地を慎重に加えます。1 mLのピペットは使用しないでください。注:前処理が必要な場合は、2時間付着させた後、目的物質を含む300 μLの完全培地を加えます。4ウェルチャンバーを使用する場合は、最大500 μL/ウェルを使用してください。 チャンバーをインキュベーターに戻します。 5.耳毒性物質の試験 外植片を一晩放置して、培養条件に適応し、回復させます。 さまざまな濃度の耳毒性剤を調製して、約50%の有毛細胞喪失を伴う耳毒性モデルを確立するための適切な濃度を見つけます。ゲンタマイシンには50 μM〜250 μM、シスプラチンには40 μM〜320 μMを使用します。シスプラチン溶液を新鮮に調製し、光から保護します。 培地を取り除き、目的の耳毒性薬物を含む培地300 μLを慎重に加えます。 外植片をゲンタマイシンおよびシスプラチンとともに37°Cで24時間から48時間インキュベートし、有毛細胞の生存率を決定します。注:薬物濃度と曝露時間は、研究の目的に応じて選択されます。外植片の保存は72時間までここにテストされた。長期培養を計画している場合は、血清を使用しないでください。 次のセクションに従って、蝸牛細胞を染色します。 6.固定と免疫蛍光法 実験終了時に培地を廃棄し、直ちに200 μLの予熱した1x PBSで外植片を洗浄します。 外植片を200 μLの4%パラホルムアルデヒド(PFA)で化学ヒュームフード下で15分間固定します。注意:PFAは危険な化学物質です。PFAを初めて使用する前に、製品安全データシート(MSDS)をお読みください。 外植片を200 μLの1x PBSで2回洗浄します。染色手順を延期する必要がある場合に備えて、外植片を1x PBSで4°Cで保存します。 1x PBSと1%-5%Triton-X100からなる透過処理溶液を調製します。 1x PBSを廃棄し、200 μLの透過処理溶液を加え、外植片を15分間インキュベートします。 ブロッキング溶液を調製します。コルチ外植片の臓器には、1x PBS、10%正常ヤギ血清(NGS、ヤギ二次抗体用、または二次抗体と同じ種由来の別の血清)からなるブロッキング溶液を調製します。あるいは、細胞がファロイジンのみで染色されている場合は、1%〜5%のウシ血清アルブミン(BSA)を使用します。 蝸牛外植片の場合、螺旋神経節細胞を染色するためにマウス一次抗体(例:マウス抗TuJ1)を使用する場合は、1x PBS、10% NGS、およびFabフラグメント(Fabフラグメントヤギ抗マウスIgG H+L、希釈率1:200)からなるブロッキング溶液を調製します。 200 μLのブロッキング溶液を加え、外植片を1時間インキュベートします。 ブロッキング溶液を廃棄します。Fabフラグメントとインキュベートした外植片に、200 μLの4% PFAを加え、5分間インキュベートします。 外植片を1x PBSで5分間洗浄します。 1x PBS、5% NGS、および0.1%-0.25% Triton-X100からなる抗体溶液を調製します。 一次抗体を抗体溶液(MYO7A(ab3481を1:500で希釈またはMYO7A 138-1で1:100)で希釈して有毛細胞を標識し、TuJ1(1:400)でらせん神経節ニューロンを標識します。注:有毛細胞がファロイジンのみで標識されている場合は、ファロイジンを1x PBSで1:150に希釈し、室温で40分から1時間インキュベートし、ステップ6.22に進みます。 一次抗体を省略することにより、二次抗体の非特異的結合のためのコントロールを含む。 一次抗体を含む抗体溶液170 μLを対応するウェルに加え、穏やかに振とう(40〜60 rpm)しながら4°Cで一晩インキュベートします。 外植片を1x PBSでそれぞれ5分間4回洗浄します。 二次抗体を抗体溶液(例:ヤギ抗ウサギAlexa Fluor 488またはヤギ抗マウスAlexa Fluor 568 IgG)で希釈し、希釈率を1:500にします。 170μLの抗体溶液と二次抗体を加え、室温で1時間インキュベートします。注意: このステップ以降、外植片を長時間の光にさらされないように保護してください。 外植片を1x PBSで2回、それぞれ5分間洗浄します。 次のステップに進み、外植片の連続した二重標識を行います。目的の2番目の一次抗体(有毛細胞のMYO7Aなど)とともに、4°Cで穏やかに振とう(40〜60rpm)して一晩インキュベートします。または、ファロイジン(1:150)と室温で40分から1時間インキュベートし、ステップ6.22に進みます。注:一次抗体が同じ宿主種由来の場合は、逐次標識を行ってください。マルチプレックス免疫蛍光法の末端にファロイジン標識を行います。 外植片を1x PBSでそれぞれ5分間4回洗浄します。 二次抗体を抗体溶液(例:ヤギ抗ウサギAlexa Fluor 488またはヤギ抗マウスAlexa Fluor 568 IgG)で希釈し、希釈率を1:500にします。 二次抗体170μLを添加し、室温で1時間インキュベートします。 外植片を1x PBSで2回、それぞれ5分間洗浄します。 1 mg/mLのDAPIストック溶液を調製し、-20°Cで保存します。 DAPI 原液を 1:10 に希釈して 0.1 mg/mL の作業溶液を調製し、4 °C で保存します。メモ: DAPI を含む実装メディアを使用する場合は、手順 23 をスキップして手順 26 に進みます。 DAPIワーキング溶液を1x PBSで1:100に希釈し、外植片を200 μLのDAPI溶液で5分間インキュベートします。 外植片を1x PBSで2回、それぞれ5分間洗浄します。 1x PBSを可能な限り取り外して、チャンバーの底を乾かします。外植木を乾かさないでください。 2〜5秒待ってから、外植片に直接封入剤を1滴加えます。注:外植片の封入剤は、表面張力により所定の位置に留まります。硬化封入剤を使用できます。 イメージングするまでチャンバーを4°Cで保存してください。 7. 外植片由来の生細胞の免疫蛍光法 単離された外植片は、一晩インキュベーションした後に使用してください。 培地を取り除き、125 μMのシスプラチンを含む培地300 μLを慎重に加えます。 外植片を18時間インキュベートして、生きた外植片中のミトコンドリアスーパーオキシドを測定します。 薬物曝露の最後に培地を廃棄します。 細胞のROS(例:250 nMのmito-hydroethidine)および/またはカスパーゼ-3(例:核酸結合色素に結合した2 μMのDEVDペプチド)を検出するために、300 μLの透過性プローブを添加します。 37°Cで30分間インキュベートします。 外植片を200 μLの温かいハンク平衡塩溶液(HBSS)または適切な緩衝液で2回穏やかに洗浄します。 400 nmの蛍光励起と590 nmの発光検出により、2時間以内に細胞をイメージングします。 実験終了時に培地を廃棄し、直ちに200 μLの予熱した1x PBSで外植片を洗浄します。 外植片を固定し、上記のように蝸牛細胞を染色します。 8. 共焦点イメージングによる可視化 スピニングディスク共焦点ユニットを備えた顕微鏡または点走査型共焦点ユニットを備えた共焦点顕微鏡を使用して外植片を画像化します。 20倍の空気対物レンズ(開口数:0.75)を備えた回転ディスクを使用して細胞をカウントし、画像を取得します。または、40倍の空気対物レンズ(開口数:0.95)または100倍のオイル対物レンズ(開口数:1.45)を備えた点走査型共焦点顕微鏡を使用して画像を取得し、シナプスを視覚化してカウントするか、立体繊毛を画像化します。注意: 各チャンネルのレーザー強度と露光時間を調整して、画像の過飽和と過飽和を回避します。同じ実験のすべての外植片に同じ設定を適用します。 20倍の空気対物レンズ、Zスタック、および自動ステッチングツールを使用して、蝸牛外植片全体の3D画像をキャプチャするように顕微鏡をセットアップします。マウスの外植片には15%のオーバーラップを持つ3 x 3の隣接フィールドを使用し、ラットの外植片には4 x 4の隣接フィールドを使用します。 顕微鏡のソフトウェアまたは無料のオープンソースFIJIソフトウェア8を使用して画像を調整します。注:画像処理技術であるデコンボリューションは、共焦点画像に適用して、コントラストと解像度をシャープにすることができます9-11。