JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Divulgaciones
Acknowledgements
Materials
Referencias
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Inmunología y contagio

Zika Virüsü İnhibitörlerini Gerçek Zamanlı Olarak Değerlendirmek için Hücre Tabanlı Elektriksel Empedans Platformu

Published: March 24, 2023
doi:
10.3791/65149
, ,
1Department of Microbiology, Immunology and Transplantation, Rega Institute for Medical Research, Laboratory of Virology and Chemotherapy,KU Leuven

Summary

Burada, insan hücrelerinde Zika virüsü enfeksiyonunu ve replikasyonunu gerçek zamanlı olarak incelemek için çok kolay ve basit bir yöntem olarak hücre bazlı elektriksel empedansın (CEI) kullanımını gösteriyoruz. Ayrıca, CEI testi antiviral bileşiklerin değerlendirilmesi için yararlıdır.

Abstract

Hücre bazlı elektriksel empedans (CEI) teknolojisi, elektrotlarla gömülü kültür plakası kuyucukları üzerinde büyüyen veya manipüle edilen yapışkan hücre tek katmanının neden olduğu empedanstaki değişiklikleri ölçer. Teknoloji, Zika virüsü (ZIKV) enfeksiyonunun ve yapışkan hücre replikasyonunun sonuçlarını gerçek zamanlı olarak izlemek için kullanılabilir, çünkü bu virüs oldukça sitopatojenik değildir. Etiketlerin veya invaziv yöntemlerin kullanılmasını gerektirmeyen ve gerçek zamanlı veri sağlama avantajına sahip basit bir tahlildir. ZIKV enfeksiyonunun kinetiği, kullanılan hücre hattına, virüs suşuna ve geleneksel son nokta tahlilleriyle kolayca çalışılamayan enfeksiyonun çokluğuna (MOI) büyük ölçüde bağlıdır. Ayrıca, CEI testi, enfeksiyon seyri boyunca dinamik inhibitör özelliklere sahip olabilen antiviral bileşiklerin değerlendirilmesi ve karakterizasyonu için de kullanılabilir. Bu yöntemler makalesi, CEI testinin pratik olarak yürütülmesi ve genel olarak ZIKV araştırması ve antiviral araştırmalardaki potansiyel uygulamaları hakkında ayrıntılı bir açıklama sunmaktadır.

Introduction

Zika virüsü (ZIKV) salgınları, mikrosefali ve Guillain-Barre sendromu 1,2,3 gibi ciddi hastalık komplikasyonları ile ilişkilidir. Sivrisinek vektör dağılımının yayılması ve kentleşmenin artması gibi çeşitli risk faktörleri nedeniyle gelecekteki salgınlar makul olsa da, bugüne kadar hiçbir aşı veya antiviral ilaç henüz piyasaya sürülmemiştir 3,4. Bu nedenle, geleneksel ZIKV araştırma yöntemleri, bu virüsü ve potansiyel antiviral bileşiklerini incelemek için yeni araçlarla desteklenmelidir. Antiviral araştırmalar genellikle fenotipik testlere dayanır; burada son nokta, virüs kaynaklı bir sitopatik etkinin (CPE) ortaya çıkması veya bir muhabir gen 5,6,7 aracılığıyla belirli bir virüs kaynaklı proteinin üretimi gibi belirli bir parametrenin varlığıdır. Bununla birlikte, bu yöntemlerin uç nokta okumaları vardır, emek yoğundur ve karmaşık analizler gerektirebilir. Bu nedenle, empedans tabanlı yöntemler cazip bir alternatif sunar.

Hücre bazlı elektriksel empedans (CEI), elektrot içeren kuyucuklara tohumlanmış yapışkan bir hücre tabakasının neden olduğu, bir elektrottan diğerine akım akışına karşı direnç olarak tanımlanır. Bu metodolojide kullanılan yerleşik CEI teknolojisi, başlangıçta Giaever ve Keese 8,9 tarafından geliştirilen Elektrik Hücresi-substrat Empedans Algılamasıdır (ECIS). Bu, kanser metastazı, toksikoloji ve yara iyileşmesi gibi geniş bir biyolojik araştırma alanında kullanılır10,11,12. İlkesi, alternatif akım (AC) voltajlarının bir frekans aralığı13 üzerinde sürekli olarak süpürülmesiyle üretilen bir elektrik alanına dayanır. Hücreler bu invaziv olmayan elektrik alanlarına maruz kalır ve önceden belirlenmiş aralıklarla, hücre büyümesinin neden olduğu empedans değişiklikleri veya hücre aderansı veya morfolojisindeki değişiklikler ölçülür14. Ayrıca, değiştirilmiş hücre canlılığı da empedans değişikliklerine yol açarak, teknolojiyi sitopatojenik virüslerle enfeksiyonu izlemek için yararlı bir araç haline getirir15,16,17. Hücre tabakasının morfolojik değişiklikleri nano ölçek aralığında tespit edileceğinden, teknoloji oldukça hassas bir algılama aracı sunar. Bu makalede açıklanan CEI testi, hücre tabakasının zaman içindeki empedans değişikliklerini ölçmek için kolay, invaziv olmayan, gerçek zamanlı, etiketsiz bir yöntemdir.

CEI, ZIKV enfeksiyonunun seyrini veya potansiyel antivirallerini değerlendirmek için kullanılmamış olsa da, tanı aracı olarak kullanımı18’den önce araştırılmıştır. Yakın tarihli bir çalışmada, A549 hücrelerinde birkaç ZIKV inhibitörünün antiviral aktivitesini belirlemek için CEI testinin kullanımı ilk kez doğrulanmıştır19. Bu yöntem makalesi, bu CEI tahlilini daha ayrıntılı olarak açıklamakta ve çeşitli yapışkan hücre hatlarına ve ayrıca çeşitli enfeksiyon çeşitliliklerinde (MOI) çeşitli ZIKV suşlarına genişletmektedir. Bu nedenle, bu yöntemin flavivirüs antiviral araştırmalarında çok yönlü kullanımı gösterilmiştir. Yöntem, önemli enfeksiyon zaman noktalarının tespit edilmesini ve potansiyel antiviral bileşikler tarafından dinamik inhibe edici aktiviteyi sağlayan gerçek zamanlı hücre izlemenin çok önemli yararına sahiptir. Birlikte ele alındığında, CEI teknolojisi, mevcut antiviral metodolojileri tamamlamak için güçlü ve değerli bir araç sunar.

Protocol

Açıklanan tüm adımlar, bir Biyogüvenlik seviye 2 laboratuvarının laminer akış kabininde steril koşullar altında gerçekleştirilir. Kullanılan tüm virüsler, Belçika kurumsal inceleme kurulu (Departement Leefmilieu, Natuur en Energie, protokol SBB 219 2011/0011) ve KU Leuven’deki Biyogüvenlik Komitesi kurallarına göre elde edilmiş ve onaylanmıştır. 1. Hücre kültürü bakımı NOT: Bu protokol bir dizi hücre çizgisi ile gerçekleştirilir, ancak elbette yalnızca hücre tohumlama yoğunluğu optimizasyonu gerektiren herhangi bir yapışkan hücre hattına uyarlanabilir. A549 insan akciğer adenokarsinom hücre hattını, U87 insan malign glioblastoma hücre hattını ve HEL 299 insan embriyonal akciğer fibroblast hücrelerini T75 kültür şişelerinde 37 ° C’de ve% 5 CO2’de nemlendirilmiş bir inkübatörde büyütün. Alt kültür, hücreleri% 80-95 akıcılıkta. Tüm reaktifler, hücreleri kültürlemeden önce oda sıcaklığında (RT) olmalıdır. Şartlandırılmış kültür ortamını hücrelerden çıkarın. Hücre tek katmanını bir kez yıkamak için 5 mL Dulbecco’nun fosfat tamponlu salin (DPBS) kullanın. 1 mL% 0.25 tripsin-etilendiamintetraasetik asit (EDTA) hücre tek katmanı üzerine eşit olarak dağıtın. Daha sonra, hücreler ayrılmaya başlayana kadar 37 ° C’de 3 dakikaya kadar inkübe edin. 9 mL taze tam büyüme ortamı ekleyin (ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın). Hücreleri yeniden askıya almak için yavaşça yukarı ve aşağı pipet yapın. İstenilen hacimdeki hücre süspansiyonunu yeni bir T75 kültür şişesine aktarın ve toplam 15 mL’lik bir hacim elde etmek için uygun miktarda taze büyüme ortamı ekleyin.NOT: Bu protokolde kullanılan in vitro hücre hatları, ideal büyüme koşullarına izin vermek için spesifik hücre hattına bağlı olarak 1: 4 ila 1: 10 seyreltmelerde alt kültüre alınır. Alt kültürler her 3-4 günde bir gerçekleştirilir, bu nedenle istenen hücre süspansiyon hacmi inkübasyon günlerinin sayısına bağlı olarak da değişebilir. 2. CEI plakasının hazırlanması Sayısallaştırılmış elektrotlarla 96 delikli bir plaka alın ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve tüm kuyucukları 100 μL büyüme kültürü ortamı ile doldurun. Kuyular arasındaki boşlukları DPBS ile doldurun.NOT: Bu, 96 delikli plakalarda hücreler kültürlenirken gözlenen buharlaşma nedeniyle kenar etkisini azaltmak için yapılır. Plakayı% 5 CO2’lik bir inkübatörde 37 ° C’de 4 saat boyunca inkübe edin. 3. Hücrelerin tohumlanması Hücreleri, bölüm 1’de açıklandığı gibi kültür şişesinden ayırın ve 50 mL’lik bir tüp içinde taze büyüme ortamında yeniden askıya alın. Seçim yöntemini kullanarak canlı hücrelerin sayısını sayın.NOT: A549 hücreleri söz konusu olduğunda, canlılık genellikle ~% 100’e ulaşır. Hücre sayısını belirlemek için, akridin portakalı / propidyum iyodür boyamasına dayanan otomatik bir hücre analiz sistemi kullanıyoruz (bakınız Malzeme Tablosu). Diğer hücre sayma yöntemleri eşit derecede iyi çalışır. İstenilen hücre yoğunluğunu elde etmek için hücreleri taze büyüme ortamında yeniden askıya alın. Bu çalışmada, optimal A549 hücre yoğunluğu 0.15 × 106 (canlı) hücre / mL’dir. Sayısallaştırılmış elektrotlara sahip 96 delikli plakayı inkübatörden çıkarın ve ortamı çok kanallı bir pipetle çıkarın. 96 delikli plakadaki kuyucuk başına 100 μL hücre süspansiyonunu (bu durumda 15 × 103 hücreye karşılık gelir) dağıtın. Hücreleri CEI cihazına yerleştirmeden önce oda sıcaklığında 15 dakika boyunca dengelenmesine izin verin. 4. CEI testinin kurulması ve çalıştırılması CEI cihaz plakası tutucusunu barındıran inkübatörü 37 °C ve% 5 CO2’ye yerleştirin. 96 delikli plakayı cihaza yerleştirin. Cihazın yazılımını açın ve Veri Topla bölmesinde Kurulum’a tıklayarak yeni bir deneme oluşturun. Dizüstü bilgisayarın ECIS cihazına bağlanmasını bekleyin ve kuyucukların empedanslarını kontrol ederek plakayı yapılandırın. Tüm kuyucukların yeşil renkle gösterildiği gibi doğru yapılandırılıp yapılandırılmadığını kontrol edin. Değilse, tüm kuyucuklar yeşil olana kadar adım 4.2’yi tekrarlayın. Kuyu Yapılandırması bölmesinde, kullanılan kültür yazılımına göre dizi türünü seçin. Çoklu Frekans/Zaman modu’nu seçin.NOT: Bu modda, cihaz empedans değişikliklerini bir frekans aralığında ölçer. Başlat’ı tıklatarak ölçümü başlatın.NOT: Gerçek zamanlı empedans, yazılımın arayüzünde izlenebilir. Gösterilmek istenen frekansı seçin. Bu örnekte 16 kHz seçilmiştir. 5. Bileşik hazırlama ve inkübasyon NOT: Bir antiviral bileşiğin bir örneği olarak, labyrinthopeptin A1 kullanılır ( Bkz. Malzeme Tablosu). Bu protokol potansiyel antiviral aktiviteye sahip tüm bileşiklere genellenebildiğinden, buna ‘bileşik’ diyoruz. RT’de dengelenmek için fetal sığır serumu (FBS) (‘tahlil tamponu’ olarak adlandırılır) eklenmeden tam hücre kültürü ortamına izin verin. Bileşikleri buz üzerinde tutun. Her bileşiğin 5 mL polipropilen tüplerde tahlil ortamında 10x konsantre seyreltilmesini hazırlayın. İstenilen 10x konsantrasyonlarını elde etmek için bileşikleri 5 mL polipropilen tüplerde tahlil ortamında seri olarak seyreltin. Veri Toplama Ayarları bölmesinde Duraklat’ı tıklatarak CEI aygıtını duraklatın. Geçerli zaman noktasının tamamlanmasını bekleyin ve 96 delikli plakayı çıkarın. Işık mikroskobu altında hücrelerin yapışkanlığını ve tek katmanlı oluşumunu doğrulayın. Çok kanallı bir pipet ile her bir kuyucuktan 20 μL çıkarın. İstenilen kuyucuklara 20 μL bileşik çözelti veya araç ekleyin. Doğru pipetleme için özel koşullara sahip bir düzen hazırlayın. Plakayı %5 CO2 ile 37 °C’de 15 dakika inkübe edin.NOT: Bu inkübasyon adımı için CEI cihazı yerine normal bir hücre inkübatörü kullanılır. Hücre kontrol (CC) kuyuları, araçla tedavi edilen kuyulardır. 6. Virüs hazırlığı ve enfeksiyonu Bir şişe virüs stoğunu çözün. Bu örnekte, ZIKV MR766 ve ZIKV PRVABC59 kullanılmıştır. İstenilen MOI’de virüs seyreltmeleri veya 15 mL’lik bir polipropilen tüp içinde tahlil ortamında seyreltmeler hazırlayın.Not: Bu temsili örnekte, MOI 0.5, 0.1, 0.05, 0.01, 0.005, 0.001, 0.005 ve 0.00005 kullanılır. 96 kuyucuk plakasının atanmış kuyucuklarına 100 μL virüs seyreltmesi ekleyin. CC kuyularına tahlil ortamı ekleyin. Kullanılan virüs kaplarını dekontamine edin. Plakayı tekrar CEI cihazına yerleştirin ve Denemeye Devam Et’i tıklatarak art arda 6 gün boyunca ölçümlere devam edin.NOT: Virüs kontrol (VC) kuyuları araç ile tedavi edilen enfekte hücrelerdir, oysa CC kuyularında virüs seyreltmesi yerine tahlil ortamı eklenir. Bileşiklerin sitotoksisitesi değerlendirilirse, virüs seyreltmesi yerine 100 μL tahlil tamponu ekleyin. 7. Veri analizi Son’u tıklayarak denemeyi sonlandırın ve görüntülenen penceredeki belirli deneme koşullarıyla ilgili bilgiler gibi isteğe bağlı özet yorumlar ekleyin. Veri toplama tamamlandığında Tamam’ı tıklatın. Denemenin sonunda CC ve VC arasındaki en büyük empedans farkının ölçüldüğü Grafik bölmesinde istediğiniz frekansı seçin.En iyi frekansı belirlemek için, enfekte olmamış ve enfekte olmuş hücrelerle bir pilot deney çalıştırın ve enfekte olmuş hücrelerin empedansının temel seviyesine düştüğü zaman noktasında, enfekte olmamış ve enfekte olmuş hücreler arasında gözlemlenen en büyük empedans farkına yol açan frekansı seçin. ZIKV ile enfekte olmuş A549 hücreleri durumunda, bu 16 kHz’dir. Tüm verileri elektronik tablo biçiminde dışa aktarmak için, Kuyu Yapılandırması bölmesinde tüm kuyucukların seçili olduğundan emin olun ve Dosya | Verileri dışa aktarma | Grafik verileri. Deneyin sonunda ölçülen ortalama VC empedans değerini tüm veri noktalarından çıkararak ve bunu enfeksiyondan önce ölçülen son zaman noktasının ortalama CC empedans değerine bölerek verileri normalleştirin. CEI profil grafiklerini elde etmek için normalleştirilmiş verileri zaman fonksiyonunda çizin. inhibitör konsantrasyonları (IC50) gibi parametreleri belirlemek için her koşulun eğrisi (AUCn) altındaki normalleştirilmiş alanı hesaplayın. Örneğin, çeşitli virüs suşlarının bulaşıcılığını karşılaştırmak için CIT50 gibi diğer yararlı parametreleri hesaplayın.

Representative Results

Bu makalede, CEI testinin ZIKV araştırmalarında kullanımı ayrıntılı olarak anlatılmaktadır. Bu tahlilin iş akışı Şekil 1’de gösterilmiştir. İstenilen bir hücre tipinde ZIKV enfeksiyonunun gerçek zamanlı izlenmesinin yanı sıra bir antiviral bileşik tarafından enfeksiyon inhibisyonunun değerlendirilmesinin rahatlığını gösteriyoruz. Antiviral bir örnek olarak, iyi tanımlanmış peptid labyrinthopeptin A1 (Laby A1) kullanıyoruz; Buna “bileşik” diyoruz, çünkü spesifik özellikleri bu yöntem makalesinin kapsamı dışındadır ve başka bir yerde tartışılmaktadır20,21. Not olarak, yöntemin tekrarlanabilirliği sonuçlar bölümünde tartışılmamıştır, çünkü metodoloji kullanılarak elde edilen bireysel empedans profillerine odaklanmak istiyoruz. Ancak, bu daha önce19 olarak tanımlanmıştır. İlk deney setinde, CEI enfeksiyon testleri yaparken hücre yoğunluğu optimizasyonunun önemini gösteriyoruz (Şekil 2). Çok fazla hücre tohumlandığında, hücre tek katmanı tamamen büyümüş olacak ve CEI elektrotlarına daha fazla yayılamayacaktır. Bu, CC ve VC arasında daha küçük bir farka ve dolayısıyla daha düşük bir çözünürlüğe yol açarak antiviral aktivitenin tespit penceresini azaltır. Bu, Şekil 2E’de iyi bir şekilde örneklendirilmiştir. U87 hücreleri gibi bazı daha büyük hücre tipleri için, hücrelerin çok yoğun bir şekilde tohumlanması, burada gösterildiği gibi, plakayı manipüle ederken hücre tek katmanının tamamen ayrılmasına bile yol açabilir (Şekil 2F). Bu aynı zamanda mikroskobik olarak da gözlenir. Şekil 2 ayrıca tahlilin hücre duyarlılığı çalışmaları yapmak için çok yararlı olduğunu göstermektedir. Şekil 2A,B’den enfeksiyon kinetiğinin hücre tipine büyük ölçüde bağımlı olduğu açıktır. Şekil 2C, U87 hücrelerinin sadece yüksek MOI’lerde ZIKV enfeksiyonuna duyarlı olduğunu göstermektedir. İkinci deney setinde, CEI enfeksiyon testinin çok yönlü kullanımı, farklı MOI’lerde ve iyi tanımlanmış bir antiviral bileşiğin varlığında çeşitli ZIKV suşları kullanılarak vurgulanmıştır (Şekil 3). Bu deneyler, flavivirüs araştırmalarında yaygın olarak kullanılan bir model olan A549 hücreleri ile gerçekleştirilir22,23. Bu hücre hattı, CEI tahlillerinde uygunluğunu gösteren diğer çalışmalarda da kullanılmıştır24. İlk olarak, Afrika soyu MR766’nın temsili bir ZIKV suşu tarafından enfeksiyon kinetiği, Asya soyu PRVABC59’unkilerle karşılaştırılmıştır. Şekil 3A, her iki suşun da karşılaştırılabilir CEI paternlerine sahip olduğunu ve PRVABC59’un biraz daha yavaş CPE indükleyici özelliklere sahip olduğunu göstermektedir. Bu durum CIT50 değerleri ile de yansıtılmaktadır (Şekil 3B). Bu ilginç parametre ilk olarak Fang ve ark.16 tarafından tanıtılmıştır ve CEI ölçümlerinin kinetiğini dikkate almaktadır. Hücre kontrolüne kıyasla empedansı% 50 oranında azaltmak için gereken süre olarak tanımlanır. Daha sonra, hücreler, çeşitli bileşik konsantrasyonlarının varlığında veya yokluğunda, ZIKV MR766 veya PRVABC59’un üç farklı MOI’si ile enfekte edildi ve empedans profilleri izlendi. Şekil 3C-H’den gözlemlenebileceği gibi, bazı bileşik konsantrasyonları ZIKV enfeksiyonunun neden olduğu empedans düşüşünü inhibe eder veya geciktirir. Bu, AUC değerleri hesaplanırken de yansıtılır. CEI tahlil sonuçları ayrıca antiviral aktivitenin MOI’ye ve potens değerlendirmesinin zaman noktasına bağlı olduğunu görsel olarak göstermektedir. AUCn hesaplamaları, Şekil 3I’de gösterildiği gibi IC50 değerlerini belirlemek için kullanılabilir. Son olarak, Şekil 3H, CIT50 değerlerinin bileşik potansiyellerini belirlemek ve karşılaştırmak için de kullanılabileceğini göstermektedir. Aktif olmayan bileşikler veya bileşik konsantrasyonları, VC’ninkilerle karşılaştırılabilir CEI profilleri, AUC ve CIT50 değerleri ile karakterize edilir. Şekil 1: Tahlilin iş akışına şematik genel bakış. CEI testinin zaman çizelgesi ve farklı kullanım ve inkübasyon adımları burada gösterilmiştir. Kısaltmalar: CEI = hücre bazlı elektriksel empedans; ZIKV = Zika virüsü; D = gün. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 2: Farklı yoğunluklarda ZIKV ile enfekte olmuş hücrelerin normalleştirilmiş CEI profilleri. (A,D) A549, (B,E) HEL 299 veya (C,F) U87 hücreleri, 96 delikli bir CEI plakasında kuyu başına (A-C) 15.000-20.000 (“optimal”) veya (D-F) 75.000 (“suboptimal”) hücrede tohumlanmıştır. 24 saatlik empedans izlemesinden sonra, hücreler on kat ZIKV MR766 MOI dilüsyonları ile enfekte edildi. Empedans art arda 5 gün boyunca izlendi. Temsili bir deneyin CEI profilleri (iki teknik kopyanın ortalama ± aralığı) gösterilmiştir. Kısaltmalar: CEI = hücre bazlı elektriksel empedans; MOI = enfeksiyonun çokluğu; ZIKV = Zika virüsü; Norm = normalleştirilmiş. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 3: İki ZIKV suşu ile enfeksiyon ve bir antiviral bileşik tarafından inhibisyon sonrası A549 hücrelerinin normalize CEI profilleri. (A) Yapışkan A549 hücreleri, ZIKV MR766 veya ZIKV PRVABC59’un çeşitli MOI’leri ile enfekte edildi ve empedans sürekli olarak izlendi. Temsili bir deneyin üç teknik kopyasının ortalama ± SD’si gösterilir. (B) CIT50 değerleri, A’nın CEI profiline göre hesaplanmış ve karşılaştırılmıştır. Gerçekleştirilen üç teknik çoğaltmanın ortalama ± SD’si gösterilir. (C-H) Yapışkan A549 hücreleri çeşitli bileşik konsantrasyonları ile muamele edildi ve daha sonra ZIKV MR766 (C-E) veya ZIKV PRVABC59 (F-H) spesifik bir MOI ile enfekte edildi. Empedans sürekli izlendi. Temsili ± deneyin iki teknik kopyasının ortalama aralığı gösterilmiştir. (I) Farklı ZIKV suşları ve seyreltmeleri ile bileşik inhibisyonunu karşılaştırmak için AUC n hesaplandı ve inhibitör yüzdeler, tüm koşulların CC AUC n tarafından çıkarılması ve VC AUCn ile bölünmesiyle belirlendi. (J) C-H’de gösterilen deneyin CIT50 değerleri, farklı ZIKV suşlarını ve MOI’yi karşılaştırmak için hesaplanmıştır. Ortalama ± iki teknik kopya aralığı gösterilmiştir. Kısaltmalar: CEI = hücre bazlı elektriksel empedans; MOI = enfeksiyonun çokluğu; ZIKV = Zika virüsü; Norm = normalleştirilmiş; CIT 50 = empedansın tedavi edilmemiş kontrole göre oranında azaldığı zaman; AUC = eğrinin altındaki alan; CC = hücre kontrolü; VC = virüs kontrolü. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

Bu makalede CEI testinin ZIKV antiviral araştırmalarında kullanımı anlatılmaktadır. Tahlil gerçek zamanlı izleme avantajına sahiptir ve bu nedenle ZIKV enfeksiyonunun kinetiğinin ve seçici bileşiklerle antiviral inhibisyonun değerlendirilmesinde kullanılabilir. Bu yöntemle elde edilen veriler, virüs kaynaklı CPE’nin ve potansiyel bir antiviral bileşiğin gücünün objektif ve görsel olarak gözlemlenmesini sağlar.

CEI çok hassas bir yöntem olduğundan, bu hücresel tahlil yapılırken büyük özen gösterilmelidir. Pipetleme varyasyonunu mümkün olduğunca önlemek için hassas pipetleme yapılması çok önemlidir. Ayrıca, hücre sayısı ve kullanılan viral stok gibi deneysel sonuçları etkileyebilecek diğer faktörler, deney tekrarları arasında sabit tutulmalıdır. Bunlar, hücre büyümesinin ve enfeksiyonun kinetiğini, yüksek oranda etkileyen faktörlerdir ve bu nedenle hesaplanan CIT50 değerlerinde ve / veya diğer parametrelerde varyasyona yol açabilir.

CEI testini (potansiyel) antiviral bileşiklerin varlığında gerçekleştirirken, bir virüsün yokluğunda hücrelerin empedansını etkileyip etkilemediklerini belirlemek önemlidir. Teknik o kadar hassastır ki, empedans değişiklikleri bileşiğin sitotoksik konsantrasyonlarının19 çok altında ölçülebilir.

Bu makalede sadece ZIKV verileri gösterilmesine rağmen, tahlil, optimal CEI izleme frekansı tayini gibi sadece minimum optimizasyon çabası ile diğer sitopatojenik (flavi) virüslere kolayca uygulanabilir. CEI testinin adaptasyonları, chikungunya, influenza A ve insan ve at herpes virüsleri25,26,27,28 gibi çeşitli insan ve hayvan virüsleri ile kullanılmıştır. Burada, viral titrelerin nicelleştirilmesi veya antiviral bileşiklerin tanımlanması için basit bir yöntem olarak da kullanılır. Bu çalışmalarda alternatif bir CEI yöntemi olan gerçek zamanlı hücre analizi kullanılmıştır.

CEI teknolojisinin kullanımı, yapışkan hücre tipleri ile sınırlıdır, çünkü tahlilin prensibi, elektrot gömülü kuyucuklara yayılmak için yapışkan hücrelerin özelliklerine dayanır. Fibronektin gibi kuyu yüzeyi kaplamaları, hücre bağlanmasını iyileştirmek için kullanılabilir29. Metodolojinin, ilki maliyetiyle ilgili olan başka dezavantajları da vardır. CEI izleme cihazına ve beraberindeki donanım ve yazılıma yapılan yatırımın yanı sıra, sarf malzemeleri de biraz pahalıdır. Ayrıca, protokol birkaç gün boyunca viral enfeksiyonun izlenmesini gerektirdiğinden, haftada bir 96 kuyucuklu plaka değerlendirilebilir. Yüksek maliyetle birlikte bu, kullanımı düşük ila orta aktarım hızı ayarlarıyla sınırlar.

Bu verim sorunları nedeniyle, teknoloji antiviral tarama ayarları için uygun değildir. Bununla birlikte, ilk deneysel aşamalarda, örneğin, belirli bir hastalıkla ilgili ortamda ZIKV enfeksiyonunun incelenmesi için hücre duyarlılığını değerlendirirken oldukça çekicidir. Teknoloji ayrıca, enfeksiyon kinetiğindeki değişiklikleri, örneğin belirli giriş reseptörlerinin varlığında veya yokluğunda kolayca gözlemlemek için transfekte veya nakavt hücre hatlarında da yararlıdır. Bu, hücresel faktörlerin ZIKV enfeksiyonuna katılımını araştırırken ilginçtir. Ayrıca, daha sonraki klinik öncesi aşamalarda, belirli bir lider aday seçildiğinde, CEI testi, seçilen bir bileşiğin daha derinlemesine karakterizasyonu için kullanılabilir. CEI biyosensörleri, virüslerin tespiti için virüse özgü antikorlar gibi belirli biyotanıma elemanlarının hareketsiz hale getirilmesiyle de değiştirilebilir18. Toplamda, bu, CEI’nin viroloji ortamında çok yönlü kullanımını vurgulamaktadır.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar, makaleyi düzelttikleri için Clément Heymann ve Gorrit Lootsma’ya teşekkür eder. Çalışma, Viroloji ve Kemoterapi Laboratuvarı’nın (Rega Enstitüsü, KU Leuven) iç hibeleriyle desteklenmiştir.

Materials

A549 cells American Type Culture Collection (ATCC) CCL-185 These cells are cultured in MEM Rega-3 supplemented with 10% FBS, 2 mM L-glutamine, 0.075% sodium bicarbonate.
Acridine Orange/Propidium Iodide Stain Logos Biosystems F23001 Live/dead stain
Cellstar polypropylene tubes, 15 mL Greiner bio-one 1,88,271
Cellstar polypropylene tubes, 50 mL Greiner bio-one 2,27,261
Dulbecco's Modified Essential Medium (DMEM) Gibco, Thermo Fisher Scientific 41965-039 Cell culture medium for U87 and HEL 299 cells
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) Gibco, Thermo Fisher Scientific 14190-094
ECIS cultureware 96W20idf Applied BioPhysics 96W20idf PET Assay plate for CEI device
Electric cell-substrate impedance sensing (ECIS) Z array station Applied BioPhysics CEI device, including 96 well station, external control module and laptop with control, acquisition and display software. The necessary software is installed before shipment. NOTE: this device is currently out of production and has been replaced by the more advanced ECIS Z-Theta device
Falcon polystyrene tubes, 5 mL Corning 352054
Fetal Bovine Serum (FBS) Cytiva SV30160.03 Cell culture medium additive for all used cells
HEL 299 cells ATCC CCL-137 These cells are cultured in DMEM supplemented with 10% FBS and 0.01 M HEPES.
HEPES buffer, 1 M Gibco, Thermo Fisher Scientific 15630-056 Cell culture medium additive for U87 cells
Labyrinthopeptin A1 Kind gift from Prof. Dr. Roderich Süssmuth, Technische Universität Berlin, Germany Antiviral compound used as an example in this protocol. It is dissolved in DMSO.
L-Glutamine, 200 mM Gibco, Thermo Fisher Scientific 25030-024 Cell culture medium additive for A549 cells
Luna cell counting slides Logos Biosystems L12001
Luna-FL dual fluoresence cell counter Logos Biosystems L20001 Cell viability counter
Minimum Essential Medium Rega-3 (MEM Rega-3) Gibco, Thermo Fisher Scientific 19993013 Cell culture medium for A549 cells
Sodium Bicarbonate, 7.5% Gibco, Thermo Fisher Scientific 25080-060 Cell culture medium additive for A549 cells
Tissue culture flask T75 TPP Y9076
Trypsin-EDTA, 0.25% Gibco, Thermo Fisher Scientific 25200-056 Dissociation reagent
U87 cells ATCC HTB-14 These cells are cultured in DMEM supplemented with 10% FBS and 0.01 M HEPES.
 Virkon Rely+On tablets Lanxess 115-0020 Disinfectant sollution
Zika virus (ZIKV) MR766 ATCC VR-84 ZIKV prototype strain, isolated from sentinel Rhesus monkey in Uganda in 1968
ZIKV PRVABC59 ATCC VR-1843 ZIKV strain isolated from patient in Puerto Rico in 2015
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referencias

  1. Cao-Lormeau, V. M., et al. Guillain-Barré Syndrome outbreak associated with Zika virus infection in French Polynesia: a case-control study. Lancet. 387 (10027), 1531-1539 (2016).
  2. Mlakar, J., et al. Zika virus associated with microcephaly. The New England. Journal of Medicine. 374 (10), 951-958 (2016).
  3. Pierson, T. C., Diamond, M. S. The emergence of Zika virus and its new clinical syndromes. Nature. 560 (7720), 573-581 (2018).
  4. Pergolizzi, J., et al. The Zika virus: Lurking behind the COVID-19 pandemic. Journal of Clinical Pharmacy and Therapeutics. 46 (2), 267-276 (2021).
  5. Bernatchez, J. A., et al. Development and validation of a phenotypic high-content imaging assay for assessing the antiviral activity of small-molecule inhibitors targeting Zika virus. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 62 (10), e00725 (2018).
  6. Zou, J., Shi, P. Y. Strategies for Zika drug discovery. Current Opinion in Virology. 35, 19-26 (2019).
  7. Mottin, M., et al. Discovery of new Zika protease and polymerase inhibitors through the open science collaboration Project OpenZika. Journal of Chemical Information and Modeling. 62 (24), 6825-6843 (2022).
  8. Giaever, I., Keese, C. R. Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field. Proceedings of the National Academy of Sciences. 81 (12), 3761-3764 (1984).
  9. Giaever, I., Keese, C. R. A morphological biosensor for mammalian cells. Nature. 366 (6455), 591-592 (1993).
  10. Rahim, S., Üren, A. A real-time electrical impedance based technique to measure invasion of endothelial cell monolayer by cancer cells. Journal of Visualized Experiments. (50), e2792 (2011).
  11. Szulcek, R., Bogaard, H. J., van Nieuw Amerongen, G. P. Electric cell-substrate impedance sensing for the quantification of endothelial proliferation, barrier function, and motility. Journal of Visualized Experiments. (85), e51300 (2014).
  12. Li, X., et al. Hsp70 suppresses mitochondrial reactive oxygen species and preserves pulmonary microvascular barrier integrity following exposure to bacterial toxins. Frontiers in Immunology. 9, 1309 (2018).
  13. Wegener, J., Keese, C. R., Giaever, I. Electric cell-substrate impedance sensing (ECIS) as a noninvasive means to monitor the kinetics of cell spreading to artificial surfaces. Experimental Cell Research. 259 (1), 158-166 (2000).
  14. Xu, Y., et al. A review of impedance measurements of whole cells. Biosensors and Bioelectronics. 77, 824-836 (2016).
  15. Pennington, M. R., Van de Walle, G. R. Electric cell-substrate impedance sensing to monitor viral growth and study cellular responses to infection with alphaherpesviruses in real time. mSphere. 2 (2), e00039 (2017).
  16. Fang, Y., Ye, P., Wang, X., Xu, X., Reisen, W. Real-time monitoring of flavivirus induced cytopathogenesis using cell electric impedance technology. Journal of Virological Methods. 173 (2), 251-258 (2011).
  17. McCoy, M. H., Wang, E. Use of electric cell-substrate impedance sensing as a tool for quantifying cytopathic effect in influenza a virus infected MDCK cells in real-time. Journal of Virological Methods. 130 (1-2), 157-161 (2005).
  18. Stukovnik, Z., Bren, U. Recent developments in electrochemical-impedimetric biosensors for virus detection. International Journal of Molecular Sciences. 23 (24), 15922 (2022).
  19. Oeyen, M., Meyen, E., Doijen, J., Schols, D. In-depth characterization of Zika virus inhibitors using cell-based electrical impedance. Microbiology Spectrum. 10 (4), e0049122 (2022).
  20. Prochnow, H., et al. Labyrinthopeptins exert broad-spectrum antiviral activity through lipid-binding-mediated virolysis. Journal of Virology. 94 (2), e01471 (2020).
  21. Oeyen, M., et al. Labyrinthopeptin A1 inhibits dengue and Zika virus infection by interfering with the viral phospholipid membrane. Virology. 562, 74-86 (2021).
  22. Vicenti, I., et al. Comparative analysis of different cell systems for Zika virus (ZIKV) propagation and evaluation of anti-ZIKV compounds in vitro. Virus Research. 244, 64-70 (2018).
  23. Gobillot, T. A., Humes, D., Sharma, A., Kikawa, C., Overbaugh, J. The robust restriction of Zika virus by type-I interferon in A549 cells varies by viral lineage and is not determined by IFITM3. Viruses. 12 (5), 503 (2020).
  24. Verma, N. K., Moore, E., Blau, W., Volkov, Y., Babu, P. R. Cytotoxicity evaluation of nanoclays in human epithelial cell line A549 using high content screening and real-time impedance analysis. Journal of Nanoparticle Research. 14, 1137 (2012).
  25. Thieulent, C. J., et al. Screening and evaluation of antiviral compounds against Equid alpha-herpesviruses using an impedance-based cellular assay. Virology. 526, 105-116 (2019).
  26. Labadie, T., Grassin, Q., Batéjat, C., Manuguerra, J. -. C., Leclercq, I. Monitoring influenza virus survival outside the host using real-time cell analysis. Journal of Visualized Experiments. (168), e61133 (2021).
  27. Piret, J., Goyette, N., Boivin, G. Novel method based on real-time cell analysis for drug susceptibility testing of herpes simplex virus and human cytomegalovirus. Journal of Clinical Microbiology. 54 (8), 2120-2127 (2016).
  28. Zandi, K. A real-time cell analyzing assay for identification of novel antiviral compounds against chikungunya virus. Methods in Molecular Biology. 1426, 255-262 (2016).
  29. Ebrahim, A. S., et al. Functional optimization of electric cell-substrate impedance sensing (ECIS) using human corneal epithelial cells. Scientific Reports. 12 (1), 14126 (2022).

Tags

Cell-based Electrical ImpedanceReal-time Viral InfectionAntiviral CompoundsA549 CellsCEI AssayECIS DeviceVirus InhibitorsCell AdherenceCell Monolayer

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artículo
Oeyen, M., Meyen, E., Schols, D. Cell-Based Electrical Impedance Platform to Evaluate Zika Virus Inhibitors in Real Time. J. Vis. Exp. (193), e65149, doi:10.3791/65149 (2023).
Descargar cita
Reimpresiones y permisos

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image