含纳米片生物活性剂的配制与表征

新生的盘状高密度脂蛋白（HDL）是人体循环系统中更丰富的球形高密度脂蛋白的天然祖先。这些新生颗粒，也称为pre-ß HDL，具有独特而独特的结构特性¹。事实上，新生的HDL不是作为球状粒子存在的，而是圆盘状的。对天然和重组盘状高密度脂蛋白的广泛结构表征研究表明，它们由磷脂双层组成，其周长由两亲性可交换载脂蛋白（apo）限制，例如apoA-I。在人脂蛋白代谢中，循环的新生高密度脂蛋白从外周细胞中积累脂质，并在依赖于关键蛋白质介质的过程中成熟为球形高密度脂蛋白，包括ATP结合盒转运蛋白A1和卵磷脂：胆固醇酰基转移酶²。这个过程代表了反向胆固醇转运途径的关键组成部分，被认为可以预防心脏病。有了这些知识和重建盘状HDL的能力，研究人员将这些颗粒用作治疗动脉粥样硬化的治疗^{干预措施3。}从本质上讲，将重组高密度脂蛋白（rHDL）输注到患者中会促进胆固醇从斑块沉积物中排出，并将其返回到肝脏以转化为胆汁酸并从体内排泄。一些生物技术/制药公司正在推行这种治疗策略⁴。

与此同时，在实验室中产生这些粒子的能力引发了一系列研究活动，导致了新的应用和新技术。一个突出的应用涉及使用rHDL颗粒作为微型膜，在天然环境中容纳跨膜蛋白⁵。迄今为止，已有数百种蛋白质成功掺入盘状rHDL，研究表明，这些蛋白质作为受体、酶、转运蛋白等保留了天然构象和生物活性。这些被称为“纳米盘”的颗粒也被证明适合结构表征，通常以高分辨率6。这种跨膜蛋白研究方法被认为优于洗涤剂胶束或脂质体的研究，因此正在迅速发展。重要的是要认识到，已经报道了两种能够形成rHDL的不同方法。“胆酸盐透析”方法¹³在与在rHDL双层⁵中掺入跨膜蛋白相关的应用中很常用。基本上，该配制方法涉及在含有洗涤剂胆酸钠（或脱氧胆酸钠;胶束分子量[MW]为4，200Da）的缓冲液中混合形成磷脂的双层，支架蛋白和目标跨膜蛋白。去垢剂可有效溶解不同的反应组分，使样品能够针对缺乏去垢剂的缓冲液进行透析。在透析步骤中，当洗涤剂从样品中取出时，会自发形成rHDL。当这种方法用于捕获感兴趣的跨膜蛋白时，产物颗粒被称为纳米盘⁵。然而，尝试使用这种方法掺入小分子疏水生物活性剂（MW <1，000 Da）在很大程度上是不成功的。与跨膜蛋白不同，小分子生物活性剂能够与洗涤剂一起从透析袋中逸出，大大降低了它们在rHDL中的掺入效率。通过从配方混合物¹⁴中省略洗涤剂解决了这个问题。相反，组分依次加入到水性缓冲液中，从双层形成脂质开始，形成含有rHDL的稳定生物活性剂，称为纳米盘。其他人则使用rHDL掺入和运输体内成像剂⁷。最近，由载脂蛋白支架和阴离子甘油磷脂心磷脂组成的专用rHDL已被用于配体结合研究。这些颗粒为研究心磷脂与各种水溶性配体（包括钙、细胞色素c和抗癌剂阿霉素⁸）的相互作用提供了一个平台。

本研究的重点是配制具有稳定掺入疏水性生物活性剂（即纳米盘）的rHDL。这些试剂整合到盘状rHDL颗粒的脂质环境中的能力有效地赋予它们水溶性。因此，纳米盘具有 体内 治疗应用的潜力。在配制纳米盘时，需要特定的孵育/反应条件才能成功地将离散疏水性生物活性剂掺入产品颗粒中，本报告的目的是提供详细的实用信息，可用作为特定应用创建新型纳米盘颗粒的基础模板。因此，在本手稿的上下文中，术语nanodisc和nanodisk是不可互换的。纳米盘是指配制为含有嵌入其脂质双层⁵中的跨膜蛋白的rHDL，而术语纳米盘是指配制为掺入低分子量（<1，000 Da）疏水性生物活性剂（例如两性霉素B¹⁴）的rHDL。

有多种方法可用于获取合适的支架蛋白。可以从制造商处购买支架蛋白[例如apoA-I（SRP4693）或apoE4（A3234）]，但是，成本可能是一个限制因素。首选方法是在大肠杆菌中表达重组支架蛋白。针对人类apoA-I⁹，apoE4¹⁰以及昆虫血淋巴蛋白apolipophorin-III¹¹的协议已发布。为了本文描述的实验的目的，使用重组人apoE4的N端（NT）结构域（氨基酸1-183）。合成编码人apoE4-NT的核苷酸序列并将其插入到与载体编码的pelB前导序列直接相邻的pET-22b（+）表达载体中。该构建体导致pelB领导序列-apoE4-NT融合蛋白的表达。蛋白质合成后，细菌pelB领导序列将新合成的蛋白质引导到周质空间，其中前导肽酶切割pelB序列。所得的apoE4-NT蛋白没有序列标签或尾巴，随后逃逸细菌并积聚在培养基¹¹，¹²中^，简化了下游加工。