Standardisation d’un dosage cytométrique sur billes à base d’anticorps jaunes d’œuf
Summary
Ce protocole décrit une méthodologie pour la préparation de billes de latex pour des tests utilisant des anticorps IgY pour la détection d’antigènes.
Abstract
Les immunoessais sont des tests importants pour la détection de nombreuses cibles moléculaires. Parmi les méthodes actuellement disponibles, le dosage cytométrique sur billes a pris de l’importance au cours des dernières décennies. Chaque microsphère lue par l’équipement représente un événement d’analyse de la capacité d’interaction entre les molécules testées. Des milliers de ces événements sont lus en un seul essai, ce qui garantit une précision et une reproductibilité élevées du test. Cette méthodologie peut également être utilisée dans la validation de nouveaux intrants, tels que les anticorps IgY, pour le diagnostic de maladies. Ces anticorps sont obtenus en immunisant les poulets avec l’antigène d’intérêt, puis en extrayant l’immunoglobuline du jaune des œufs des animaux ; Par conséquent, il s’agit d’une méthode indolore et très productive pour obtenir les anticorps. En plus d’une méthodologie de validation de haute précision de la capacité de reconnaissance d’anticorps de ce test, cet article présente également une méthode d’extraction de ces anticorps, de détermination des meilleures conditions de couplage pour les anticorps et les billes de latex, et de détermination de la sensibilité du test.
Introduction
Parmi les techniques d’immunodosage visant à diagnostiquer les maladies, le dosage cytométrique sur billes s’est imposé comme une approche très sensible et fiable, puisqu’il permet d’analyser des milliers de particules en un seul test1. Cette technique, en plus d’avoir une productivité élevée et de permettre l’utilisation de plus petits volumes d’échantillons, présente également une grande flexibilité, car elle permet la détection de plusieurs molécules, telles que les cytokines, les molécules d’adhésion, les isotypes d’anticorps et les protéines 2,3.
Différentes particules sont utilisées pour le développement de ces dosages, parmi lesquelles des billes de latex, qui constituent un intrant efficace et peu coûteux. Celles-ci peuvent présenter des modifications à leur surface, comme la présence de groupes fonctionnels ou de protéines qui permettent le couplage covalent ou non covalent de certaines molécules 3,4,5.
Ces immunoessais utilisent des composants tels que des antigènes et des anticorps pour détecter les marqueurs de la maladie et nécessitent généralement des anticorps provenant de mammifères tels que les souris, les lapins et les chèvres. Cela crée des problèmes liés à des questions éthiques, car l’immunisation des mammifères nécessite généralement de nombreux animaux pour obtenir un bon rendement, ainsi que l’exécution fréquente de procédures qui conduisent à la souffrance des animaux 6,7. Une alternative à cela est l’utilisation d’anticorps IgY isolés à partir des jaunes d’œufs de poulets immunisés, car des concentrations élevées d’anticorps spécifiques contre les antigènes inoculés peuvent être trouvées dans les jaunes ; La production d’un poulet équivaut à la production de 4,3 lapins au cours d’une année 6,7.
Ainsi, l’objectif de ce protocole est de fournir une méthode d’évaluation des anticorps IgY obtenus à partir de jaunes d’œufs de poule par cytométrie en flux avec des billes de latex. Pour cela, nous proposons une méthode de standardisation d’un immunodosage cytométrique sur billes en format sandwich à l’aide de billes de latex. Comme modèle, nous avons utilisé des anticorps IgY dirigés contre l’antigène de la protéine II riche en histidine de Plasmodium falciparum (IgY-Pf HRP2). Nous décrivons une méthode d’extraction des anticorps, discutons des étapes critiques pour définir la concentration de couplage de ceux-ci aux billes de latex, et présentons une évaluation de la limite de détection de l’antigène. La haute précision de la cytométrie en flux, associée au faible coût des billes de latex, rend cette technique applicable à l’analyse des outils d’immunoessai, tels que les anticorps et les antigènes. Cette méthode peut être utilisée pour la détection de diverses cibles.
Protocol
Representative Results
Discussion
La méthode de précipitation des anticorps IgY par réduction du pH suivie d’une séparation des lipides à l’aide d’acide caprylique est efficace pour isoler les anticorps totaux sans aucune perte de fonctionnalité. La méthode proposée ici est plus simple et moins coûteuse que celle rapportée par Redwan et al.11, qui utilisaient également la précipitation par acidification et l’acide caprylique mais avec un protocole plus complexe et laborieux. Cette méthode présente également …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier la FIOCRUZ (« Programa de excelência em pesquisa básica e aplicada em saúde dos laboratórios do Instituto Leônidas e Maria Deane – ILMD/Fiocruz Amazônia-PROEP-LABS/ILMD FIOCRUZ AMAZÔNIA »), le Programme de troisième cycle en biotechnologie (PPGBIOTEC de l’Universidade Federal do Amazonas – UFAM), la Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível (CAPES) et la Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas (FAPEAM) pour l’octroi des bourses. La figure 2 et la figure 4 ont été créées avec biorender.com.
Materials
| Anti-Chicken IgY (H+L), highly cross-adsorbed, CF 488A antibody produced in donkey | Sigma-Aldrich | SAB4600031 | |
| Anti-mouse IgG (H+L), F(ab′)2 | Sigma-Aldrich | SAB4600388 | |
| BD FACSCanto II | BD Biosciences | BF-FACSC2 | |
| BD FACSDiva CS&T research beads (CS&T research beads) | BD Biosciences | 655050 | |
| BD FACSDiva software 7.0 | BD Biosciences | 655677 | |
| Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate | Bio-Rad | #5000006 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| Caprilic acid | Sigma-Aldrich | O3907 | |
| Centrifuge 5702 R | Eppendorf | Z606936 | |
| Chloride 37% acid molecular grade | NEON | 02618 NEON | |
| CML latex, 4% w/v | Invitrogen | C37253 | |
| Megafuge 8R | Thermo Scientific | TS-HM8R | |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide Hydrochloride Powder (EDC) | Sigma-Aldrich | E7750-1G | |
| N-Hydroxysuccinimide (NHS) | Sigma-Aldrich | 130672-25G | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | 1003335620 | |
| Sodium hydroxide | Acs Cientifica | P.10.0594.024.00.27 | |
| Sodium hypochlorite | Acs Cientifica | R09211000 | |
| Thermo Mixer Heat/Cool | KASVI | K80-120R |
Referencias
- Salzer, U., Sack, U., Fuchs, I. Flow cytometry in the diagnosis and follow up of human primary immunodeficiencies. Electronic Journal of the International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory. 30 (4), 407 (2019).
- de Figueiredo, A. M., Glória, J. C., Chaves, Y. O., Neves, W. L. L., Mariúba, L. A. M. Diagnostic applications of microsphere-based flow cytometry: A review. Experimental Biology and Medicine. 247 (20), 1852-1861 (2022).
- Morgan, E., et al. Cytometric bead array: A multiplexed assay platform with applications in various areas of biology. Clinical Immunology. 110 (3), 252-266 (2004).
- Graham, H., Chandler, D. J., Dunbar, S. A. The genesis and evolution of bead-based multiplexing. Methods. 158, 2-11 (2019).
- Kellar, K. Multiplexed microsphere-based flow cytometric assays. Experimental Hematology. 30 (11), 1227-1237 (2002).
- Schade, R., et al. Chicken egg yolk antibodies (IgY-technology): A review of progress in production and use in research and human and veterinary medicine. ATLA Alternatives to Laboratory Animals. 33 (2), 129-154 (2005).
- Xu, Y., et al. Application of chicken egg yolk immunoglobulins in the control of terrestrial and aquatic animal diseases: A review. Biotechnology Advances. 29 (6), 860-868 (2011).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
- Sousa, L. P., et al. A novel polyclonal antibody-based sandwich ELISA for detection of Plasmodium vivax developed from two lactate dehydrogenase protein segments. BMC Infectious Diseases. 14 (1), 49 (2014).
- Klimentzou, P., et al. Development and immunochemical evaluation of antibodies Y for the poorly immunogenic polypeptide prothymosin alpha. Peptides. 27 (1), 183-193 (2006).
- Redwan, E. M., Aljadawi, A. A., Uversky, V. N. Simple and efficient protocol for immunoglobulin Y purification from chicken egg yolk. Poultry Science. 100 (3), 100956 (2021).
- Lee, H. Y., Abeyrathne, E. D. N. S., Choi, I., Suh, J. W., Ahn, D. U. K. Sequential separation of immunoglobulin Y and phosvitin from chicken egg yolk without using organic solvents. Poultry Science. 93 (10), 2668-2677 (2014).
- Pauly, D., Chacana, P., Calzado, E., Brembs, B., Schade, R. IgY Technology: Extraction of chicken antibodies from egg yolk by polyethylene glycol (PEG) precipitation. Journal of Visualized Experiments. (51), e3084 (2011).
- Chang, H. M., Lu, T. C., Chen, C. C., Tu, Y. Y., Hwang, J. Y. Isolation of immunoglobulin from egg yolk by anionic polysaccharides. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 48 (4), 995-999 (2000).
- Ko, K. Y., Ahn, D. U. Preparation of immunoglobulin Y from egg yolk using ammonium sulfate precipitation and ion exchange chromatography. Poultry Science. 86 (2), 400-407 (2007).
- Polson, A. Isolation of IgY from the yolks of eggs by a chloroform polyethylene glycol procedure. Immunological Communications. 19 (3), 253-258 (1990).
- Simonova, M. A., et al. xMAP-based analysis of three most prevalent staphylococcal toxins in Staphylococcus aureus cultures. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 406 (25), 6447-6452 (2014).
- Sharma, P., et al. A multiplex assay for detection of staphylococcal and streptococcal exotoxins. PLoS One. 10 (8), e0135986 (2015).
- Merbah, M., et al. Standardization of a cytometric p24-capture bead-assay for the detection of main HIV-subtypes. Journal of Virological Methods. 230, 45-52 (2016).
