توحيد مقايسة حبة القياس الخلوي على أساس الأجسام المضادة لصفار البيض
Summary
يصف هذا البروتوكول منهجية لإعداد حبات اللاتكس للمقايسات باستخدام الأجسام المضادة IgY للكشف عن المستضد.
Abstract
المقايسات المناعية هي اختبارات مهمة للكشف عن العديد من الأهداف الجزيئية. من بين الطرق المتاحة حاليا ، اكتسب فحص حبة القياس الخلوي أهمية في العقود الأخيرة. يمثل كل كرة مجهرية يقرأها الجهاز حدثا تحليليا لقدرة التفاعل بين الجزيئات قيد الاختبار. تتم قراءة الآلاف من هذه الأحداث في اختبار واحد ، وبالتالي ضمان دقة عالية في الفحص وقابلية الاستنساخ. يمكن أيضا استخدام هذه المنهجية في التحقق من صحة المدخلات الجديدة ، مثل الأجسام المضادة IgY ، لتشخيص الأمراض. يتم الحصول على هذه الأجسام المضادة من خلال تحصين الدجاج بالمستضد محل الاهتمام ثم استخراج الغلوبولين المناعي من صفار بيض الحيوانات. لذلك ، هذه طريقة غير مؤلمة ومثمرة للغاية للحصول على الأجسام المضادة. بالإضافة إلى منهجية للتحقق عالي الدقة من قدرة التعرف على الأجسام المضادة لهذا الفحص ، تقدم هذه الورقة أيضا طريقة لاستخراج هذه الأجسام المضادة ، وتحديد أفضل ظروف اقتران للأجسام المضادة وخرز اللاتكس ، وتحديد حساسية الاختبار.
Introduction
من بين تقنيات المقايسة المناعية التي تهدف إلى تشخيص الأمراض ، ظهر فحص حبة القياس الخلوي كنهج حساس للغاية وموثوق ، لأنه يسمح بتحليل آلاف الجسيمات في اختبار واحد1. هذه التقنية ، بالإضافة إلى الإنتاجية العالية والسماح باستخدام كميات أصغر من العينات ، تقدم أيضا مرونة كبيرة ، لأنها تسمح باكتشاف العديد من الجزيئات ، مثل السيتوكينات وجزيئات الالتصاق والأنماط المتماثلة للأجسام المضادة والبروتينات 2,3.
يتم استخدام جزيئات مختلفة لتطوير هذه المقايسات ، من بينها حبات اللاتكس ، والتي تعد مدخلات فعالة ومنخفضة التكلفة. يمكن أن تقدم هذه التعديلات على سطحها ، مثل وجود مجموعات وظيفية أو بروتينات تسمح بالاقتران التساهمي أو غير التساهمي لجزيئات معينة3،4،5.
تستخدم هذه المقايسات المناعية مكونات مثل المستضدات والأجسام المضادة لإجراء الكشف عن علامات المرض وعادة ما تتطلب أجساما مضادة من الثدييات مثل الفئران والأرانب والماعز. هذا يخلق مشاكل تتعلق بالقضايا الأخلاقية ، لأن تحصين الثدييات يتطلب عموما العديد من الحيوانات للحصول على عائد جيد ، وكذلك الأداء المتكرر للإجراءات التي تؤدي إلى معاناة الحيوانات 6,7. بديل لذلك هو استخدام الأجسام المضادة IgY المعزولة من صفار البيض من الدجاج المحصن ، حيث يمكن العثور على تركيزات عالية من الأجسام المضادة المحددة ضد المستضدات الملقحة في صفار البيض. إنتاج الدجاج يعادل إنتاج 4.3 أرانب على مدار عام 6,7.
وبالتالي ، فإن الهدف من هذا البروتوكول هو توفير طريقة لتقييم الأجسام المضادة IgY التي تم الحصول عليها من صفار بيض الدجاج باستخدام قياس التدفق الخلوي مع حبات اللاتكس. لهذا ، نقترح طريقة توحيد للمقايسة المناعية للخرزة الخلوية في شكل شطيرة باستخدام حبات اللاتكس. كنموذج ، استخدمنا الأجسام المضادة IgY الموجهة إلى مستضد البروتين الثاني الغني بالمتصورة المنجلية (IgY-Pf HRP2). نصف طريقة لاستخراج الأجسام المضادة ، ونناقش الخطوات الحاسمة لتحديد تركيز اقتران هذه الأجسام بخرز اللاتكس ، ونقدم تقييما لحدود اكتشاف المستضد. الدقة العالية لقياس التدفق الخلوي ، إلى جانب التكلفة المنخفضة لخرز اللاتكس ، تجعل هذه التقنية قابلة للتطبيق لتحليل أدوات المقايسة المناعية ، مثل الأجسام المضادة والمستضدات. يمكن استخدام هذه الطريقة للكشف عن أهداف متنوعة.
Protocol
Representative Results
Discussion
طريقة ترسيب الجسم المضاد IgY عن طريق تقليل الأس الهيدروجيني متبوعا بفصل الدهون باستخدام حمض الكابريليك فعالة في عزل الأجسام المضادة الكلية دون أي خسارة في الوظائف. الطريقة المقترحة هنا أبسط وأرخص من تلك التي أبلغ عنها Redwan et al.11 ، والتي استخدمت أيضا الترسيب عن طريق التحمض وحمض ا…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر FIOCRUZ (“برنامج التفوق في مجال العلوم التطبيقية في جامعة أمازوناس الفيدرالية – UFAM) ، و Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível (CAPES) ، ومؤسسة أمبارو à Pesquisa do Estado do Amazonas (FAPEAM) ، ومؤسسة أمبارو à Pesquisa do Estado do Amazonas (FAPEAM) لتقديم المنح الدراسية. تم إنشاء الشكل 2 والشكل 4 باستخدام biorender.com.
Materials
| Anti-Chicken IgY (H+L), highly cross-adsorbed, CF 488A antibody produced in donkey | Sigma-Aldrich | SAB4600031 | |
| Anti-mouse IgG (H+L), F(ab′)2 | Sigma-Aldrich | SAB4600388 | |
| BD FACSCanto II | BD Biosciences | BF-FACSC2 | |
| BD FACSDiva CS&T research beads (CS&T research beads) | BD Biosciences | 655050 | |
| BD FACSDiva software 7.0 | BD Biosciences | 655677 | |
| Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate | Bio-Rad | #5000006 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| Caprilic acid | Sigma-Aldrich | O3907 | |
| Centrifuge 5702 R | Eppendorf | Z606936 | |
| Chloride 37% acid molecular grade | NEON | 02618 NEON | |
| CML latex, 4% w/v | Invitrogen | C37253 | |
| Megafuge 8R | Thermo Scientific | TS-HM8R | |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide Hydrochloride Powder (EDC) | Sigma-Aldrich | E7750-1G | |
| N-Hydroxysuccinimide (NHS) | Sigma-Aldrich | 130672-25G | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | 1003335620 | |
| Sodium hydroxide | Acs Cientifica | P.10.0594.024.00.27 | |
| Sodium hypochlorite | Acs Cientifica | R09211000 | |
| Thermo Mixer Heat/Cool | KASVI | K80-120R |
Referencias
- Salzer, U., Sack, U., Fuchs, I. Flow cytometry in the diagnosis and follow up of human primary immunodeficiencies. Electronic Journal of the International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory. 30 (4), 407 (2019).
- de Figueiredo, A. M., Glória, J. C., Chaves, Y. O., Neves, W. L. L., Mariúba, L. A. M. Diagnostic applications of microsphere-based flow cytometry: A review. Experimental Biology and Medicine. 247 (20), 1852-1861 (2022).
- Morgan, E., et al. Cytometric bead array: A multiplexed assay platform with applications in various areas of biology. Clinical Immunology. 110 (3), 252-266 (2004).
- Graham, H., Chandler, D. J., Dunbar, S. A. The genesis and evolution of bead-based multiplexing. Methods. 158, 2-11 (2019).
- Kellar, K. Multiplexed microsphere-based flow cytometric assays. Experimental Hematology. 30 (11), 1227-1237 (2002).
- Schade, R., et al. Chicken egg yolk antibodies (IgY-technology): A review of progress in production and use in research and human and veterinary medicine. ATLA Alternatives to Laboratory Animals. 33 (2), 129-154 (2005).
- Xu, Y., et al. Application of chicken egg yolk immunoglobulins in the control of terrestrial and aquatic animal diseases: A review. Biotechnology Advances. 29 (6), 860-868 (2011).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
- Sousa, L. P., et al. A novel polyclonal antibody-based sandwich ELISA for detection of Plasmodium vivax developed from two lactate dehydrogenase protein segments. BMC Infectious Diseases. 14 (1), 49 (2014).
- Klimentzou, P., et al. Development and immunochemical evaluation of antibodies Y for the poorly immunogenic polypeptide prothymosin alpha. Peptides. 27 (1), 183-193 (2006).
- Redwan, E. M., Aljadawi, A. A., Uversky, V. N. Simple and efficient protocol for immunoglobulin Y purification from chicken egg yolk. Poultry Science. 100 (3), 100956 (2021).
- Lee, H. Y., Abeyrathne, E. D. N. S., Choi, I., Suh, J. W., Ahn, D. U. K. Sequential separation of immunoglobulin Y and phosvitin from chicken egg yolk without using organic solvents. Poultry Science. 93 (10), 2668-2677 (2014).
- Pauly, D., Chacana, P., Calzado, E., Brembs, B., Schade, R. IgY Technology: Extraction of chicken antibodies from egg yolk by polyethylene glycol (PEG) precipitation. Journal of Visualized Experiments. (51), e3084 (2011).
- Chang, H. M., Lu, T. C., Chen, C. C., Tu, Y. Y., Hwang, J. Y. Isolation of immunoglobulin from egg yolk by anionic polysaccharides. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 48 (4), 995-999 (2000).
- Ko, K. Y., Ahn, D. U. Preparation of immunoglobulin Y from egg yolk using ammonium sulfate precipitation and ion exchange chromatography. Poultry Science. 86 (2), 400-407 (2007).
- Polson, A. Isolation of IgY from the yolks of eggs by a chloroform polyethylene glycol procedure. Immunological Communications. 19 (3), 253-258 (1990).
- Simonova, M. A., et al. xMAP-based analysis of three most prevalent staphylococcal toxins in Staphylococcus aureus cultures. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 406 (25), 6447-6452 (2014).
- Sharma, P., et al. A multiplex assay for detection of staphylococcal and streptococcal exotoxins. PLoS One. 10 (8), e0135986 (2015).
- Merbah, M., et al. Standardization of a cytometric p24-capture bead-assay for the detection of main HIV-subtypes. Journal of Virological Methods. 230, 45-52 (2016).
