기능적 3D 스페로이드 세포 배양의 반자동 표현형 분석

1. 완충액 및 시약 HepG2/C3A 세포용 세포 성장 배지: 10% 소 태아 혈청(FBS), 비필수 아미노산(1% v/v), L-글루타민(1% v/v) 및 페니실린/스트렙토마이신(0.5% v/v)을 함유한 Dulbecco의 변형 Eagle’s 배지(DMEM, 4.5g/L 포도당)를 준비합니다. 성장 배지를 4°C에서 보관합니다. THLE-3 세포용 세포 성장 배지: 보충제(소 뇌하수체 추출물[BPE], 하이드로코르티손, 인간 표피 성장 인자[hEGF], 에피네프린, 트랜스페린, 인슐린, 레티노산, 트리요오드티로닌, 겐타마이신 설페이트-암포테리신[GA])와 10% FBS, 5ng/mL hEGF 및 70ng/mL 포스포에탄올아민을 함유한 기관지 상피 세포 성장 배지[BEGM]를 준비합니다. 500mM DL-디티오트레이톨(DTT): 10mL를 준비하려면 10mL의 HPLC 등급 물에 0.771g의 DTT를 재현탁시킵니다. -20°C에서 100μL 부분 표본을 보관합니다. 200mM 요오드아세트아미드: 1mL를 제조하려면 50mM 중탄산암모늄 1mL에 요오드아세트아미드 36mg을 재현탁시킵니다. 재현탁 요오드아세트아미드를 보관하지 마십시오. 5% 소듐 도데실 설페이트(SDS): 50mL를 제조하려면 50mM 중탄산 암모늄 50mL에 SDS 2.5g을 재현탁시킵니다. 4 °C에서 보관하십시오. 12% 인산: 100mL를 준비하려면 85.9mL의 HPLC 등급 물에 85% 인산 14.1mL를 희석합니다. 유리병에 담아 실온(RT)에서 보관하십시오. 결합 완충액: 1L를 제조하려면 농축 메탄올 900mL를 10mM 중탄산암모늄 또는 TEAB 100mL에 첨가합니다. 0.1% 트리플루오로아세트산(TFA) 용액: 농축 TFA 1mL를 HPLC 등급 물 999mL에 첨가합니다. 4 °C에서 보관하십시오. 60% 아세토니트릴/0.1% TFA 용액: 600mL의 HPLC 등급 아세토니트릴(60% v/v)을 399mL의 HPLC 등급 물에 추가합니다. 다음으로, 이 용액에 농축된 TFA 1mL를 첨가한 다음 4°C에서 보관합니다. 이동상 A(MPA) – 0.1% 포름산: 농축 포름산 1mL를 HPLC 등급 물 999mL에 넣고 잘 섞습니다. 이동상 B(MPB) – 80% HPLC 등급 아세토니트릴 + 0.1% 포름산: HPLC 등급 물 199mL에 HPLC 등급 아세토니트릴 800mL를 추가합니다. 다음으로, 이 용액에 농축 포름산 1mL를 넣고 섞는다. 2. 스페로이드의 제조 참고: 그림 1A 는 세포주에서 3D 스페로이드를 준비하고 배양하기 위한 초기 단계를 나타냅니다. 냉동 HepG2/C3A 및 THLE-3 세포를 해동하고 조직 배양 플라스크 또는 접시에서 표준 성장 배지를 사용하여 약 80%의 밀도에 도달할 때까지 단층으로 성장시킵니다.알림: 세포가 밀도에 도달하면 현미경을 사용하여 일반적인 세포 형태와 성장 패턴을 확인합니다. 높은 구절 번호의 셀은 사용하지 않는 것이 좋습니다. Hank’s Balanced Salt Solution(HBSS, T75cm2 플라스크 또는 10cm 접시에 5mL 사용)으로 세포를 두 번 세척합니다. HBSS에 희석한 0.05% 트립신-EDTA 5mL를 추가하고(1:2 희석) 5%CO2로 37°C에서 5분 동안 배양합니다. 현미경을 사용하여 세포 분리를 평가하고 3mL의 FBS 또는 성장 배지(10% FBS 포함)를 추가하여 트립신 반응을 중화합니다. 세포 현탁액을 15mL 튜브로 옮깁니다. 실온에서 270 x g 으로 5분 동안 스핀 다운합니다. 상층액을 흡인하고 5mL의 완전한 성장 배지에 세포를 재현탁시킵니다.알림: 세포가 너무 많으면 계산하기 전에 세포 현탁액을 희석하십시오. 세포 수를 계산하고 세포 현탁액을 완전 성장 배지에 희석하여 최대 부피 1.5mL의 1 x 106 을 얻습니다. 마이크로웰을 포함하는 초저 부착 24웰 원형 바닥 플레이트를 평형화합니다.0.5mL의 성장 배지로 웰을 세척합니다. 플레이트를 3,000 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다(이렇게 하면 웰 표면에서 기포가 제거됨). 셀 현탁액(1.4단계에서 준비)을 플레이트와 원심분리기에 120 x g에서 3분 동안 옮깁니다.참고: 세포 현탁액 부피는 세포 수에 따라 달라질 수 있지만 1.5mL로 제한하는 것이 중요합니다. 37 ° C에서 5 % CO2 로 24 시간 동안 플레이트를 배양하여 스페로이드 형성을 시작합니다. 3. 생물반응기로의 스페로이드 배양 (그림 2) 참고: 스페로이드의 구조를 보존하려면 3D 구를 다룰 때 넓은 보어 팁을 사용하십시오. 스페로이드를 바이오리액터로 옮기기 전에 24시간 동안 습도 챔버에 25mL의 멸균수를 채우고 세포 챔버에 9mL의 성장 배지를 채워 바이오리액터의 평형을 맞춥니다(그림 2A). 습도 및 셀 챔버를 채울 때 긴 바늘에 연결된 10mL 주사기를 사용해야 합니다. 3D 인큐베이터(그림 2D,F)에서 5%CO2로 37°C에서 24시간 동안 회전(15rpm)하면서 바이오리액터를 배양합니다.2. 1mL 너비의 보어 팁을 사용하여 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 초저 부착 플레이트에서 스페로이드를 분리하고 스페로이드를 조직 배양 접시로 옮깁니다. 0.5mL의 미리 예열된 성장 배지로 초저 부착 플레이트를 세척하여 남은 스페로이드를 포집하고 3.3단계에서 동일한 접시로 옮깁니다. 광학 현미경(4배 배율)을 사용하여 스페로이드의 크기, 조밀성 및 진원도를 평가하고 충분히 형성된 스페로이드를 선택합니다.알림: 셀은 컴팩트할 때 충분히 형성되고 취급 중에 분리되지 않습니다. 스페로이드가 단일 단위이고 함께 뭉치지 않는 것도 중요합니다. 100-200 μm 사이의 스페로이드 크기는 생물반응기로 이송될 때 바람직합니다. 스페로이드를 5mL의 신선한 성장 배지로 채워진 평형 바이오리액터로 옮깁니다. 스페로이드를 옮긴 후 바이오리액터를 새로운 성장 배지로 완전히 채우고 배지를 채울 때 바이오리액터에 기포가 추가되지 않도록 하십시오. 바이오리액터를 3D 인큐베이터에 넣고 제어 장치를 사용하여 회전 속도를 조정합니다(그림 2C). HepG2/C3A 스페로이드의 경우 회전 속도를 10-11rpm으로 설정합니다. THLE-3 스페로이드의 경우 11-12rpm으로 설정합니다.알림: 회전 속도는 스페로이드가 생물반응기 중앙에 고르게 분포되어 있고 벽에 닿지 않을 때 올바르게 설정됩니다. 도 2e는 회전하는 바이오리액터를 나타낸다. 10mL의 오래된 배지를 제거하고 10mL의 새 배지로 교체하여 2-3일마다 성장 배지를 교환합니다. 매체를 교환할 때 스페로이드를 제거하지 마십시오(그림 2B).알림: 미디어 교환 루틴(예:ample, 48시간/48시간/72시간) 자세한 기록을 보관합니다. 미디어가 바뀔 때마다 회전 속도를 조정합니다. 스페로이드의 크기와 수가 증가함에 따라 속도를 높입니다. 배양한 지 15일 후, 스페로이드를 두 개의 새로운 생물반응기로 분리합니다.참고: 세포주와 성장 속도에 따라 시간이 달라질 수 있으므로 개별적으로 최적화해야 합니다. 20일이 지나면 스페로이드를 채취할 준비가 됩니다. 4. 스페로이드의 이미지 캡처 및 계수 참고: 스페로이드 계수에 대한 단순화된 파이프라인은 그림 3A에 나와 있습니다. 스페로이드 수 및 면적 측정(섹션 5)을 위해서는 3D 구조의 소형도를 평가하는 것이 중요합니다. 이렇게 하면 색상이 더 향상되는 데 기여하며, 이는 방법이 정확하기 위해 필요합니다. 태블릿에 설치된 3D 앱을 엽니다. 바이오리액터를 선택하고 스냅샷을 찍습니다.참고: 또는 사진을 찍을 수 있습니다. 다음 매개 변수를 고려해야 합니다.생물 반응기 뒤에 검은색 배경을 놓습니다(생물 반응기 상자에 검은색 지지대가 제공됨). 셀 챔버에 빛 반사가 없는지 확인하십시오. 가능한 한 생물 반응기에 가깝게 사진을 찍습니다. 피지(ImageJ)에서 사진 한 장을 엽니다. 분석을 위해 그림을 준비합니다.[타원형 도구]를 선택합니다. 플러그 주위에 원을 그립니다. 키보드에서 삭제 를 클릭하여 원 안의 모든 항목을 검은색으로 만듭니다. 감방 주위에 원을 그립니다. 모든 스페로이드가 원 안에 있는지 확인하십시오. 매크로를 실행하여 스페로이드 계산:Plugins > Macro > Record를 클릭합니다. Supplementary File 1의 매크로 텍스트를 레코더로 복사합니다. 만들기를 누르면 새 창이 열립니다. 실행을 눌러 열린 사진을 분석합니다. 결과(개수, 전체 면적, 평균 크기 및 백분율 면적)가 포함된 새 창이 열립니다. 이미지를 닫고 스페로이드 수가 필요한 각 이미지에 대해 4.4단계와 4.5단계를 반복합니다. 더 쉽고 빠르게 처리하려면 매크로를 저장하고 플러그인(Plugins) > 매크로(Macro) > 실행(Run ) 을 클릭하고 저장된 매크로를 선택하여 실행합니다. 5. 스페로이드 영역의 평면 측정 알림: 스페로이드 영역을 결정하기 위한 단순화된 파이프라인은 그림 3B에 나와 있습니다. 3.5단계에 설명된 대로 이미지를 촬영합니다. 시작하기 전에 스페로이드의 면적을 측정하기 위해 글로벌 스케일을 설정합니다.피지에서 원하는 배율의 눈금 막대가 있는 그림을 엽니다. 선 도구를 선택합니다. 축척 막대 위에 그립니다(선은 축척 막대만큼 길어야 함). 분석을 열고 척도 설정을 >. 알고 있는 거리를 씁니다(선의 길이는 픽셀 단위의 거리에 자동으로 입력됩니다. 글로벌을 선택해야 합니다. OK를 누릅니다. 이제 분석 할 그림에 대한 척도가 설정되었습니다. 평면도 측정을 시작하려면 매크로(보충 파일 2)를 실행합니다.Batch > 매크로> 프로세스를 클릭합니다. 분석할 사진이 들어 있는 폴더를 선택합니다. 이 폴더는 입력이 됩니다. 5.3.1단계에서 생성한 폴더를 [Output]으로 선택합니다. 프로세스를 누릅니다. 품질 검사로 측정된 스페로이드 영역이 원본 이미지와 일치하는지 평가합니다.알림: 매크로는 스페로이드의 일부만 측정할 수 있는 가장자리의 스페로이드를 제외합니다. 6. 스페로이드 수집 참고: 스페로이드는 3D 구조를 보존하기 위해 넓은 보어 팁을 사용하여 수집하는 것이 좋습니다. 수집은 바이오리액터 전면에 있는 플러그를 사용하여 수행할 수 있습니다(그림 2A). 수집 시 스페로이드의 크기는 세포주, 시작 세포 수 및 분할 과정(배양 일수, 바이오리액터당 스페로이드 수 및 분할 비율)에 따라 달라질 수 있습니다. 스페로이드를 수집하려면 긴 바늘에 연결된 주사기를 사용하여 상단 포트를 통해 바이오리액터에서 5mL의 배지를 제거합니다. 스페로이드가 생물 반응기의 하단 중앙(하단 포트 근처)으로 가라앉도록 하십시오. 전면 포트를 열고 1mL 너비의 보어 팁을 사용하여 스페로이드를 수집합니다. 스페로이드를 미세 원심분리기 튜브에 넣습니다. 스페로이드를 500 x g 에서 5분 동안 원심분리하고 배지를 버립니다. 200μL의 HBSS로 스페로이드를 세척하여 FBS를 제거합니다. 500 x g 에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 버립니다. 스페로이드 펠릿을 액체 질소로 스냅 얼리고 처리할 때까지 -80°C에서 보관합니다. 7. 스페로이드의 생존력 참고: 스페로이드 생존율은 손상된 세포에 의해 방출되는 아데닐레이트 키나아제(AK)의 활성을 측정하여 측정되었습니다(그림 4A). 확산 구배로 인해 AK 측정은 스페로이드가 직경이 900μm보다 작을 때 효율적입니다12. 스페로이드가 더 커지거나 생존도 측정에 대해 의심이 가는 경우 ATP 분석을 수행할 수 있습니다15. 스페로이드 상층액을 수집하고 20μL를 96웰 백색 벽 플레이트(평평한 바닥 투명)로 옮깁니다. 각 웰에 100μL의 아데닐레이트 키나아제 검출 시약을 추가하고 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 균질화합니다. RT에서 2분 동안 속도 진공에서 원심분리하여 기포를 제거합니다. RT에서 20분 동안 플레이트를 배양합니다. 플레이트를 광도계(플레이트 리더, 발광 모드)에 놓고 프로그램을 시작합니다. 키트 제조업체의 지침에 따라 매개변수를 설정합니다.참고: 생물 발광 생존도 분석에서 직접 광도계 광 출력(일반적으로 RLU)을 사용하여 세포 반응을 계산할 수 있습니다. 아데닐레이트 키나아제는 세포 무결성이 손상된 세포에서만 누출되기 때문에 용해 시약을 사용하여 아데닐레이트 키나아제를 완전히 제어할 수 있습니다. 8. 단백질 추출 참고: 그림 1B 는 스페로이드 처리 및 단백질 추출을 위한 워크플로우를 나타냅니다. 36일째에 스페로이드(섹션 6)를 수집합니다. 세포를 용해하기 위해 5% SDS의 25μL에 스페로이드를 재현탁시킵니다.5% SDS를 첨가한 후 위아래로 피펫팅하여 펠릿을 균질화합니다. 스페로이드를 용해하기 어려운 경우에는 작은 유봉을 사용하십시오. 단백질을 줄이기 위해 1시간 동안 20mM DTT로 샘플을 배양합니다. 위아래로 피펫팅하여 혼합합니다. 40mM 요오도아세트아미드로 30분 동안 단백질을 빛으로부터 보호하여 단백질을 알킬화합니다. 위아래로 피펫팅하여 혼합합니다. 12% 인산 용액(10x)을 최종 농도 1.2%로 샘플에 추가합니다. 샘플을 6 부피의 결합 완충액으로 희석하고 부드럽게 혼합합니다. 샘플을 S-Trap 필터 플레이트에 로드하고 500 x g 에서 30초 동안 스핀 다운합니다.참고: 8.4단계에서 샘플의 총 부피가 컬럼 부피 용량을 초과하는 경우 샘플을 배치로 로드하고 모든 것이 컬럼을 통과할 때까지 8.6단계를 반복합니다. 150μL의 결합 완충액으로 샘플을 두 번 세척합니다. 각 세탁 후 500 x g 에서 30초 동안 회전하고 흐름을 버립니다. 37°C에서 밤새 50mM 중탄산 암모늄에 희석한 1μg의 염기서열분석 등급 트립신으로 샘플을 배양합니다.참고: 최소 20μg의 단백질은 포괄적인 단백질체 분석을 위한 출발 물질로 권장됩니다. 이를 위해 1μg의 트립신은 효율적인 소화를 위한 이상적인 양입니다. 버퍼와 컬럼 베드 사이의 기포를 제거합니다. 펩타이드를 40μL의 50mM 중탄산암모늄으로 용출하고 동일한 수집 튜브에 고입니다. 500 x g 에서 30초 동안 회전합니다. 0.1% TFA의 40μL로 펩타이드를 용리하고 동일한 수집 튜브에 합합니다. 500 x g 에서 30초 동안 회전합니다. 펩타이드를 40μL의 60% 아세토니트릴과 0.1% TFA로 용출하고 동일한 수집 튜브에 합칩니다. 500 x g 에서 30초 동안 회전합니다. 고속 진공에서 고인 용리액을 건조시키고 처리할 때까지 샘플을 -80°C에서 보관합니다. 9. 샘플 정리 참고: 단백질체학 분석을 진행하기 전에 샘플에 존재하는 염을 제거해야 합니다. 염은 전기 분무 중에 이온화되어 펩타이드의 신호를 억제하기 때문에 고성능 액체 크로마토그래피-질량분석법(HPLC-MS) 분석을 방해할 수 있습니다. 이 연구에서 사용된 탈염 설정은 이전에 Joseph-Chowdhury와 동료들에 의해 입증되었습니다16. 시작하기 전에 다음 단계에서 흐름을 수집할 수 있는 깨끗한 96웰 수집 플레이트가 있는지 확인하십시오. C18 수지(100% 아세토니트릴에 50mg/mL)를 자석 교반 플레이트에 혼합합니다. 96웰 필터 플레이트의 웰당 70μL의 C18 수지 현탁액을 추가하고, C18 수지가 피펫 바닥에 고이지 않도록 신속하게 수행합니다. 튀지 않도록 진공 청소기를 부드럽게 켜십시오. 96웰 수집 플레이트에 수집된 플로우 스루를 폐기합니다. 0.1% TFA의 100μL로 수지를 세척합니다. 샘플이 튀거나 섞이는 것을 방지하기 위해 진공 청소기를 부드럽게 켜고 흐름을 버리십시오. 각 샘플을 0.1% TFA의 100μL에 재현탁시킵니다. pH가 2-3 사이인지 확인하고 확인하십시오. 각 샘플을 필터 플레이트의 각 웰에 로드합니다. 샘플이 튀거나 섞이는 것을 방지하기 위해 진공 청소기를 부드럽게 켜고 흐름을 버리십시오. 100μL의 0.1% TFA로 세척합니다. 샘플이 튀거나 섞이는 것을 방지하기 위해 진공 청소기를 부드럽게 켭니다. 흐름을 버리십시오. 96웰 수집 플레이트를 새 96웰 플레이트로 교체하여 염이 제거된 샘플을 수집합니다. 웰당 60μL의 아세토니트릴/0.1% TFA를 추가합니다. C18 수지에서 샘플을 용리하려면 물이 튀지 않도록 진공을 부드럽게 켭니다. 흐름을 모으고 RT의 속도 진공에서 건조합니다. LC-MS/MS로 진행하거나 샘플을 처리할 준비가 될 때까지 플레이트를 -80°C에서 보관합니다. 10. 질량분석법과 결합된 액체 크로마토그래피를 통한 단백질체학 분석 참고: 이 원고의 데이터를 생성하기 위해 300μm ID x 0.5cm C18 트랩 컬럼과 75μm ID x 25cm C18-AQ(3μm) 분석 나노 컬럼이 사내에 충전된 2열 시스템 설정이 있는 nLC-MS/MS 시스템을 사용했습니다. HPLC에서 실행할 이동상을 준비합니다.이동상 A(MPA): HPLC 등급 물에 포함된 0.1% 포름산이동상 B(MPB): HPLC 등급 아세토니트릴의 0.1% 포름산 HPLC 분석법을 다음과 같이 프로그래밍합니다: 4분 동안 34%-120% MPB, 34분 동안 90%-5% MPB, 5분 동안 등용매 90% MPB; 유량: 300nL/분 검출된 펩타이드 신호의 MS/MS 스펙트럼을 생성하기 위해 데이터 독립적 수집(DIA)을 수행하도록 MS 수집 방법을 설정합니다. 샘플을 nLC 자동 시료 주입기에 넣기 전에 10μL의 0.1% TFA에 1μg의 시료를 재현탁시킵니다. 표준 단백질체학 획득을 위해 프로그래밍된 대로 nLC-MS 분석법을 실행합니다.120,000(200m/z에서)의 분해능과 125의 자동 이득 제어(AGC) 목표치로 orbitrap에서 전체 MS 스캔을 300-1100m/z로 설정합니다. AGC 타겟이 400이고 고에너지 충돌 분해(HCD) 에너지가 30인 50m/z의 순차 분리 윈도우를 사용하여 orbitrap에서 MS/MS를 설정합니다. 11. 데이터 분석 nLC-MS/MS 원시 데이터 파일을 사용된 MS 플랫폼과 호환되는 피크 검출 소프트웨어로 가져옵니다. 적절한 데이터베이스(사람, 마우스 등)를 선택합니다. N-말단 아세틸화를 가변 변형으로 설정하고 카르바미도메틸 시스테인을 고정 변형으로 설정합니다. 트립신(trypsin)을 소화 효소로 지정하고 두 개의 절단을 놓치면 됩니다. 스펙트럼 획득에 사용되는 질량 분석기에 따라 질량 허용 오차를 설정합니다. 분석을 스프레드시트로 내보내고 필요에 따라 데이터를 추가로 처리합니다.