מודל הישנות גליובלסטומה לאחר כריתה לחקירות הידרוג'ל טיפוליות

כל הניסויים בבעלי חיים אושרו ופוקחו על ידי ועדת הביקורת המוסדית וועדת האתיקה של בעלי חיים באוניברסיטה הרפואית נאנג’ינג (IACUC-1904004). נקבות עכברי C57BL/6J, בגילאי 6-8 שבועות, שימשו במחקר הנוכחי. בעלי החיים התקבלו ממקור מסחרי (ראו טבלת חומרים). 1. הכנת בעלי חיים לשקול את העכברים, ולהרדים אותם עם הזרקה intraperitoneal של 50 מ”ג / ק”ג נתרן pentobarbital (ראה טבלה של חומרים). מתן meloxicam (5mg / kg; i.p.) עבור שיכוך כאבים perioperative . אחסן את העכברים בכלוב תחת מחזור אור/חושך של 12 שעות/12 שעות, טמפרטורת סביבה של 24 מעלות צלזיוס ולחות יחסית של 50%.הערה: במחקר הנוכחי, המשקל ההתחלתי של העכברים היה כ-22 גרם. הסר את השיער על ראשו של עכבר באמצעות מכונת גילוח של חיות מעבדה, וקיבע את הראש והגפיים על המנגנון הסטריאוטקסי (ראה טבלת חומרים).הערה: יש לעקר את כל הציוד לפני השימוש. לחטא את ראש העכבר עם לפחות שלושה סיבובים לסירוגין של chlorhexidine או povidone-יוד לשפשף ואחריו אלכוהול, ולכסות את העכבר עם drape כירורגי סטרילי. יש למרוח משחה אופתלמית על שתי העיניים למניעת התייבשות. חותכים את הקרקפת של העכבר כ 1 ס”מ לאורך קו האמצע בחלק העליון של המצח הימני עם מספריים אופתלמיים.הערה: יש לאשר את המישור הכירורגי של ההרדמה על ידי היעדר רפלקס דוושה לפני ביצוע החתך. כוונן את המנגנון הסטריאוטקסי כדי להבטיח שתפר עצם ההרינג ונקודת הפונטנל הקדמית ממוקמים באותה רמה. 2. בניית מודל GBM אורתוטופי תוך גולגולתי סמן את הנקודה 1 מ”מ לצד הקדמי של הפונטנל הקדמי, 1.8 מ”מ לצד ימין של הפונטנל הקדמי, ו-3 מ”מ למטה מהפונטנל הקדמי באמצעות צמר גפן טבול בסגול גנטיאן2 (ראה טבלת חומרים). קדח את הנקודה באמצעות מקדח גולגולתי קטן בקוטר 1 מ”מ (ראה טבלת חומרים) ליצירת גודל נקבוביות בקוטר של כ-1 מ”מ ובעומק של 1 מ”מ. הסר את נוזל המוח השדרה המופרש עם צמר גפן סטרילי. לשאוף 5 μL של תרחיף תאי הגידול (GL261-Luci, 5 × 10 5 תאים מרחפים5 μL של PBS) עם מזרק.הערה: GL261-Luci התקבל ממקור מסחרי (ראה טבלת חומרים). יישרו את קצה המחט של המיקרומזרק במאונך עם חור הקידוח של הגולגולת, הכניסו עד שקצה המחט ייכנס למישור הגולגולת למשך 3 מ”מ, והחזירו את המחט ב-0.5 מ”מ7. פתח את המיקרומזרק, והזריק במהירות של 1 μL / min. שמור על המחט במשך 10 דקות לאחר ההזרקה. משכו את המיקרומזרק באיטיות, ולחצו על נקודת ההזרקה בעזרת כדור צמר גפן יבש סטרילי. תפרו את הקרקפת בתפר כירורגי שאינו נספג (10-0, ראו טבלת חומרים), וחיטאו שוב את החתך. לפקח על בריאותו של בעל החיים, ולשמור אותו בתנאים חמים. החזירו את העכבר לכלוב הדיור לאחר שהעכבר מתעורר. דמיינו את העכבר עם מערכת הדמיה ביולומינסנטית in vivo (ראו טבלת חומרים) כדי לזהות את הגידול המושתל ביום העשירי לאחר נשיאת הגידול.הערה: לוציפראז שהוטען בתאי GBM, GL261, שימש להדמיה ביולומינסנטית.מרדימים את העכבר עם איזופלורן 1.5% עם קצב זרימת חמצן של 0.6L/min. לאחר אישור עומק ההרדמה באמצעות חוסר רפלקס דוושה, הזריקו לעכבר אשלגן פלואורסצאין תוך צפקי (10 מ”ג/מ”ל, ראו טבלת חומרים), וכעבור 11 שניות, בצעו את ההדמיה הביו-לומינסנטית in vivo . כאשר ערך הפלואורסצנטיות מגיע ~ 5 × 105, ההליך מצליח.הערה: יש להרדים את בעל החיים לפני ההדמיה. יש להרדים באמצעות חרוט אף המסופק עם איזופלורן מאדים. בחר את העכברים עם נשיאת גידול מוצלחת כדי לבנות את מודל הישנות GBM לאחר כריתה. 3. בניית מודל הישנות GBM לאחר כריתה כאשר גודל הגידול בעכברי מודל GBM תוך גולגולתי אורתוטופי הופך ~ 6.5 × 105, בחר את העכברים עבור מודל הישנות לאחר הניתוח. לשקול את עכברי מודל GBM תוך גולגולתי אורתוטופי, ולהרדים את העכברים עם הזרקה intraperitoneal של 50 מ”ג / ק”ג נתרן pentobarbital. מתן meloxicam (5mg / kg; i.p.) עבור שיכוך כאבים perioperative . חזור על התהליך של שלבים 1.2-1.5. הפרידו את רקמת הקרקפת והגולגולת, ובדקו את חור הקידוח המשמש לבניית מודל GBM תוך גולגולתי אורתוטופי. אם החור נרפא, זהה את החור באמצעות מכשיר סטריאוטקטי, ופעל לפי ההליך המוזכר בשלבים 2.1-2.3. הרחב את קוטר החור ל -5 מ”מ עם מקדח גולגולת, והסר את הנוזל השדרתי המופרש עם צמר גפן סטרילי. מקדו את המיקרוסקופ על ראש העכבר, והתאימו את ההגדרות כדי לוודא שחור הקידוח ממוקם במרכז שדה הראייה. חותכים את קרומי המוח עם מספריים, ולהסיר חלק מרקמת הגידול עם מיקרו קורט ואזמל מיקרו מתחת למיקרוסקופ.הערה: לגבי קרומי המוח, כאשר הגולגולת נפתחת, הקרום הדק הקרוב לרקמת המוח הוא קרומי המוח. עצור את הדימום עם גזה סטרילית, ולשטוף את החתך עם מלוחים פיזיולוגיים סטריליים. הזריקו את ההידרוג’ל הזמין מסחרית (10 μL, ראו טבלת חומרים) לתוך חלל הכריתה באמצעות מזרק 1 מ”ל, תפרו את הקרקפת בתפר כירורגי שאינו נספג (10-0), וחיטאו שוב את החתך (איור 1). עקוב אחר בריאותו של בעל החיים, ושמור על חום העכבר. החזירו את העכבר לכלוב הדיור לאחר שהעכבר מתעורר. בצעו הדמיה ביולומינסנטית in vivo כדי לזהות את הגידול המושתל יום אחד לאחר מכן כדי לכמת את גודל הגידול השיורי (איור 2 ואיור 3). שוקלים את העכברים כל יומיים עד לנקודת הקצה הסופית.הערה: במחקר הנוכחי, נקודת הקצה הסופית הייתה היום ה-30, והעכברים הומתו על ידי מנת יתר של נתרן פנטוברביטלי בזריקה תוך-צפקית.