Een protocol voor het evalueren en kwantificeren van retinale gepigmenteerde epitheelpathologieën in muismodellen van leeftijdsgebonden maculaire degeneratie

Leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD) is een veel voorkomende blinderende ziekte die populaties ouder dan 55 jaar treft¹. Veel onderzoekers geloven dat disfunctie binnen het retinale gepigmenteerde epitheel (RPE) een vroege en cruciale pathobiologische gebeurtenis is bij AMD². De RPE is een monolaag van gepolariseerde cellen belast met het handhaven van de homeostase van naburige fotoreceptoren en choroïdale bloedvaten³. Er bestaan verschillende modellen om ziektegerelateerde mechanismen binnen de RPE te onderzoeken, waaronder celkweekmodellen^4,5 es muizen 6,7,8. Een recent rapport heeft gestandaardiseerde protocollen en kwaliteitscontrolecriteria voor RPE-celcultuurmodellen⁴ beschreven, maar geen enkel rapport heeft geprobeerd de fenotypering van de RPE in muismodellen te standaardiseren. In feite missen veel publicaties over muismodellen van AMD een volledige beschrijving van de RPE of kwantificering van de RPE-pathologieën daarin. Het algemene doel van dit protocol is om standaard RPE-fenotyperingsmethoden te presenteren met onbevooroordeelde kwantitatieve beoordelingen voor wetenschappers die AMD-muismodellen gebruiken.

Eerdere publicaties hebben de aanwezigheid van verschillende RPE-pathologieën bij muizen opgemerkt door middel van drie beeldvormingstechnieken. Met lichtmicroscopie kunnen onderzoekers bijvoorbeeld de grove morfologie van het muizennetvlies bekijken (figuur 1A) en RPE-pathologieën detecteren, zoals RPE-verdunning, vacuolisatie en migratie. RPE-verdunning in een AMD-muismodel wordt geïllustreerd door een afwijking in de RPE-hoogte van hun respectieve bedieningselementen (figuur 1B). RPE-vacuolisatie kan worden onderverdeeld in twee afzonderlijke categorieën: microvacuolisatie (figuur 1C) en macrovacuolisatie (figuur 1D). RPE-microvacuolisatie wordt samengevat door de aanwezigheid van vacuolen in de RPE die de totale hoogte niet beïnvloeden, terwijl macrovacuolisatie wordt aangegeven door de aanwezigheid van vacuolen die uitsteken in de buitenste segmenten van de fotoreceptoren. RPE-migratie onderscheidt zich door het focale aggregaat van pigment boven de RPE-monolaag in een retinale doorsnede (figuur 1E). Opgemerkt moet worden dat migrerende RPE-cellen in AMD-donorogen immunoreactiviteit vertonen voor immuuncelmarkers, zoals cluster van differentiatie 68 (CD68)9, en immuuncellen kunnen vertegenwoordigen die RPE-puin overspoelen of RPE die transdifferentiatie ondergaat ⁹. Een andere beeldvormingstechniek genaamd transmissie-elektronenmicroscopie kan onderzoekers in staat stellen om de ultrastructuur van de RPE en zijn keldermembraan te visualiseren (figuur 2A). Deze techniek kan de overheersende sub-RPE-afzetting bij muizen identificeren, bekend als de basale laminaire afzetting (BLamD) (figuur 2B)¹⁰. Ten slotte kan confocale microscopie de structuur van RPE-cellen onthullen door middel van beeldvorming van RPE-flatmounts (figuur 3A). Deze methode kan RPE-dysmorfie blootleggen, de afwijking van de RPE van de klassieke honingraatvorm (figuur 3B). Het kan ook RPE-multinucleatie detecteren, de aanwezigheid van drie of meer kernen in een RPE-cel (figuur 3C). Voor een samenvatting van de soorten RPE-pathologieën die aanwezig zijn in de huidige AMD-muismodellen, verwijzen we onderzoekers naar deze beoordelingen uit de literatuur ^6,7.

Onderzoekers die AMD bestuderen, moeten zich bewust zijn van de voor- en nadelen van het gebruik van muizen om RPE-pathologieën te onderzoeken voorafgaand aan het fenotyperingsprotocol. Muizen zijn voordelig vanwege hun relatief korte levensduur en kosteneffectiviteit, evenals hun genetische en farmacologische manipuleerbaarheid. Muizen vertonen ook RPE-degeneratieve veranderingen, waaronder RPE-migratie, dysmorfie en multinucleatie, die worden waargenomen in AMD-donorogen 11,12,13,14,15,16,17; dit suggereert dat vergelijkbare mechanismen ten grondslag kunnen liggen aan de ontwikkeling van deze RPE-pathologieën bij muizen en mensen. Er zijn echter belangrijke verschillen die de vertaalbaarheid van muisstudies naar menselijke LMD beperken. Ten eerste hebben muizen geen macula, een anatomisch verschillend gebied van het menselijk netvlies dat nodig is voor de gezichtsscherpte die bij voorkeur wordt beïnvloed bij AMD. Ten tweede worden sommige RPE-pathologieën bij muizen, zoals RPE-verdunning en vacuolisatie, meestal niet gezien in AMD-donorogen¹⁸. Ten derde ontwikkelen muizen geen drusen, een kenmerk van AMD-pathologie¹⁹. Drusen zijn lipide- en eiwithoudende afzettingen met zeer weinig keldermembraaneiwitten die zich vormen tussen de RPE basale lamina en de binnenste collageenlaag van het membraan van Bruch (BrM)¹⁹. Drusen verschillen van BLamD, de veel voorkomende sub-RPE-afzetting bij muizen, zowel in hun samenstelling als in anatomische locatie. BLamD’s zijn leeftijds- en stressafhankelijke extracellulaire matrixverrijkte afwijkingen die zich vormen tussen de RPE basale lamina van BrM en de basale infoldings van de RPE²⁰. Interessant is dat BLamD’s een vergelijkbare eiwitsamenstelling en uiterlijk hebben bij zowel muizen als mensen ^6,10,21. Recent werk suggereert dat BLamDs kan werken in de pathobiologie van AMD door de progressie van AMD naar zijn latere stadia te beïnvloeden^18,22; deze afzettingen kunnen dus zieke RPE in het netvlies van de muis vertegenwoordigen. Kennis van deze voordelen en beperkingen is van cruciaal belang voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het vertalen van resultaten van muisstudies naar AMD.

In dit protocol bespreken we de methoden om ogen voor te bereiden op licht, transmissie-elektron en confocale microscopie om RPE-pathologieën te visualiseren. We beschrijven ook hoe we RPE-pathologieën op een onbevooroordeelde manier kunnen kwantificeren voor statistische tests. Als proof of concept gebruiken we het RPE-fenotyperingsprotocol om de structurele RPE-pathologieën te onderzoeken die worden waargenomen in transmembraaneiwit 135- (Tmem135) overexpressiemuizen en verouderde wild-type (WT) C57BL / 6J-muizen. Samenvattend willen we de fenotyperingsmethodologie beschrijven om de RPE in AMD-muismodellen te karakteriseren, omdat er momenteel geen standaardprotocollen beschikbaar zijn. Onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het onderzoeken en kwantificeren van pathologieën van de fotoreceptoren of het vaatvlies, die ook worden beïnvloed in AMD-muismodellen, vinden dit protocol mogelijk niet nuttig voor hun studies.