In-vitro - und In-vivo-Evaluierung photokontrollierter biologisch aktiver Substanzen - potenzielle Wirkstoffkandidaten für die Krebspharmakologie

Die Tierpflege- und Versuchsverfahren wurden nach den lokalen und internationalen Vorschriften für die Durchführung von Forschungsprojekten mit Versuchstieren durchgeführt (Gesetz der Ukraine “Über den Schutz von Tieren vor Grausamkeit”, Europäische Konvention zum Schutz von Wirbeltieren, die für experimentelle und andere wissenschaftliche Zwecke verwendet werden (Europäische Konvention, Straßburg, 1986), Richtlinie 2010/63/EU zum Schutz von Tieren, die für wissenschaftliche Zwecke verwendet werden). Diese Studie wurde von der Bioethikkommission der Firma Bienta genehmigt. Für diese Experimente wurden C57BL/6NCrl-Mäuse (erwachsene Weibchen mit einem Gewicht von jeweils ca. 20 g) verwendet. Bestimmte Materialien, Reagenzien und Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt. 1. IC50 Evaluierung für LMB002 (“ringgeschlossene” und “ringoffene” Formen) unter Verwendung von 2D- und 3D-LLC-Zellkulturen Herstellung von Puffern und Stammlösungen der VerbindungenHINWEIS: Bereiten Sie Puffer mit Standardverfahren vor. Alternativ können Sie auch handelsübliche Lösungen verwenden.Bereiten Sie 10x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) zu, indem Sie 14,2 g Na 2 HPO 4, 2,4 g KH 2 PO4, 80 g NaCl und2g KCl zu 1 l destilliertem Wasser hinzufügen. Autoklav bereitete 10x PBS her und verdünnte es zu 1x Lösung, indem 100 ml 10x Lösung zu 900 ml destilliertem Wasser hinzugefügt wurden. Anschließend wird die Lösung bei 4 °C gelagert. Bereiten Sie Dulbeccos PBS (DPBS) zu, indem Sie 4,78 g DPBS-Pulver zu 1 l destilliertem Wasser hinzufügen. Rühren Sie die Lösung, bis sich der gesamte Feststoff aufgelöst hat, überprüfen Sie den pH-Wert mit einem pH-Messgerät und stellen Sie ihn durch Zugabe von 1 M NaOH oder 1 M HCl (pH 7,3-7,4) ein. Nach Erreichen des gewünschten pH-Wertes wird das Medium durch einen 0,22 μm Vakuumfilter in einem sterilen Schrank filtriert. Bei 4 °C lagern. 1 M 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethansulfonsäure (HEPES)-Pufferlösung durch Zugabe von 238,3 g HEPES zu 1 l destilliertem Wasser herstellen. Stellen Sie den pH-Wert der Lösung mit 1 M NaOH bis pH 7,5 ein. Filtern Sie durch einen 0,22 μm Vakuumfilter in einem sterilen Schrank. Bei 4 °C lagern. Bereiten Sie 1x Trypsin-EDTA-Lösung (EDTA = Ethylendiamintetraessigsäure) vor, indem Sie 10-fache Lösung verdünnen. Geben Sie dazu 5 ml 10x Trypsin-EDTA in 45 ml 1x PBS-Lösung in ein steriles 50-ml-Röhrchen. Bei 4 °C lagern. Bereiten Sie Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) basic zu, indem Sie 13,4 g DMEM-Pulver mit hohem Glukosegehalt und 3,7 g Na2CO3 auf 1 l destilliertes Wasser in einen Messzylinder mit einem Magnetrührstab auf einer Rührplatte geben. Rühren Sie die Lösung, bis sich der gesamte Feststoff aufgelöst hat, überprüfen Sie den pH-Wert mit einem pH-Messgerät und stellen Sie ihn durch Zugabe von 1 M NaOH oder 1 M HCl (pH 7,3-7,4) ein. Nach Erreichen des gewünschten pH-Wertes wird das Medium durch einen 0,22 μm Vakuumfilter in einem sterilen Schrank filtriert und bei 4 °C gelagert. Bereiten Sie das DMEM-Komplettmedium vor, indem Sie 100 ml fötales Kälberserum (FBS), 10 ml Penicillin-Streptomycin-Lösung, 10 ml L-Glutaminlösung und 10 ml 1 M HEPES-Puffer zu 900 ml DMEM basic hinzufügen. Bei 4 °C lagern. Bereiten Sie Stammlösungen für die Testmischungen vor.Wiegen Sie für jede Verbindung zwei Chargen von 5,12 mg (z. B. LMB002) in der ringgeschlossenen Fotoform in zwei 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen (eines mit durchsichtigen und das andere mit schwarzen, undurchsichtigen Wänden). Wiegen Sie 2,28 mg Positivkontrolle (z. B. Gramicidin S) in einem extra durchsichtigen Röhrchen. Fügen Sie jeder Probe 100 μl reines DMSO hinzu und wirbeln Sie 30 s lang. Photoisomerisieren Sie die Stammlösung (LMB002) im Klarwandröhrchen von der “ringgeschlossenen” in die “ringoffene” Form, indem Sie die Lösung mit einem 660-nm-Laser (Lichtleistungsdichte 0,6 W/cm2) mit Vortexing bestrahlen, um eine gründliche Durchmischung zu gewährleisten. Fahren Sie fort, bis sich die Farbe sichtbar von dunkelviolett zu hellbraun ändert. Mit Alufolie vor Licht schützen. 2D-Zellkulturexperiment – Aussaat der Zellen (Tag 1)Übertragen Sie 10 ml des DMEM-Komplettmediums aus dem T-75-Kolben mit einer LLC-Zellkultur in ein steriles 15-ml-Röhrchen. Saugen Sie das übrig gebliebene Medium mit einer Vakuumpumpe an. Waschen Sie die Zellkultur mit 5 ml 1x DPBS und saugen Sie die Lösung mit einer Vakuumpumpe ab. Bedecken Sie die Zellen mit 3 ml 1x Trypsin-EDTA-Lösung und inkubieren Sie den Kolben für 2-3 min bei 37 °C in einer 5%igen CO2 -Atmosphäre. Stoppen Sie die Trypsinwirkung, indem Sie 6 ml des DMEM-Mediums (zuvor in ein steriles Röhrchen überführt) in den Zellkulturkolben mit 1x Trypsin-EDTA-Lösung geben und die Suspension mehrmals pipettieren, um die Zellen von den Wänden des Zellkulturkolbens zu waschen. Die Suspension wird in ein 15-ml-Röhrchen überführt und 4 Minuten lang bei 200 × g zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wird der Überstand mit einer Vakuumpumpe angesaugt. Vermeiden Sie es, das Zellpellet am Boden des Röhrchens zu berühren. Resuspendieren Sie die Zellen, indem Sie 2 ml frisches DMEM-Komplettmedium hinzufügen und mehrmals pipettieren. Zählen Sie die Zellen, indem Sie etwa 15 μl der Suspension in ein 0,5-ml-Röhrchen geben, 15 μl 0,4%iges Trypanblau hinzufügen und die erhaltene Mischung in eine Zellzählkammer überführen. Bereiten Sie nach dem Zählen 25 ml der Zellsuspension pro Zeitpunkt vor. Säen Sie 5.000-10.000 (durchschnittlich 8.000) LLC-Zellen/Wells in 200 μl DMEM in die zentralen 60 Wells einer 96-Well-Platte mit durchsichtigem Boden und schwarzen, undurchsichtigen Wänden. Füllen Sie die restlichen 36 Vertiefungen mit reinem DMEM. Legen Sie die Platten über Nacht bei 37 °C und 5 % CO2 in einen Zellkultur-Inkubator. Verwenden Sie darunter Plattendeckel aus Kunststoff, um eine ungleichmäßige Erwärmung der Bodenplatte zu vermeiden. 2D-Zellkulturexperiment – Zugabe der Verbindungen (Tag 2)Überwachen Sie die Zellen durch Lichtmikroskopie in den Platten, bis die Zellen eine Konfluenz von 70%-80% erreicht haben. Saugen Sie das Medium mit einer Vakuumpumpe in einem sterilen Schrank aus den Vertiefungen ab. Fügen Sie 100 μl des frischen, vorgewärmten DMEM-Mediums hinzu und legen Sie die Platten in einen Zellkultur-Inkubator. Vorbereiten von Reihenverdünnungen der Testverbindungen und der Positivkontrolle in autoklavierten Polypropylen-Klarsichtplatten. Stellen Sie die folgenden Lösungen für individuelle Zeitpunktmessungen her:Anmerkungen: Beginnen Sie mit den Vorräten in DMSO und verdünnen Sie sie mit DMEM, aber überschreiten Sie nicht 1 % v/v DMSO in der endgültigen höchsten Konzentration.Um eine 128 μM Lösung von Gramicidin S zu erhalten, werden 1,3 μl 20 mM Stammlösung zu 198,7 μl DMEM gegeben. Um eine 256 μM Lösung von LMB002 in “ringoffener” Form zu erhalten, werden 1,3 μl 40 mM Lösung zu 198,7 μl DMEM gegeben. Um eine 512-μM-Lösung von LMB002 in “ringgeschlossener” Form zu erhalten, werden 2,6 μl 40-mM-Stammlösung zu 197,4 μl DMEM hinzugefügt. Führen Sie drei weitere Wiederholungen durch, um vier Sätze von jedem Konzentrationspunkt zu erhalten. Bereiten Sie eine Doppelverdünnungsreihe vor, indem Sie 100 μl aus jeder Startvertiefung absaugen, in eine Vertiefung mit 100 μl DMEM überführen und gründlich mischen.Anmerkungen: Die Arbeit mit photoschaltbaren Verbindungen erfordert eine Anpassung der Beleuchtung, um eine rückseitige Photoisomerisierung zu verhindern. Es wird empfohlen, das Licht in sterilen Schränken auszuschalten. Die Endkonzentrationen der Verbindungen werden in Vertiefungen (5-150 μM) erhalten, indem jeweils 100 μl der hergestellten Lösungen in 56 Vertiefungen mit 100 μl zuvor zugesetztem DMEM überführt werden. Geben Sie jedes Mal 100 μl DMEM in vier Vertiefungen, um als Negativkontrolle zu dienen. Abdeckplatten mit Aluminiumfolie oder undurchsichtiger Schutzabdeckung aus Kunststoff, um ein unkontrolliertes Fotoschalten zu verhindern. Legen Sie die Platten für die gewählte Inkubationszeit (10 min, 60 min, 24 h oder 72 h) bei 37 °C in einen Zellkultur-Inkubator (unter Verwendung zusätzlicher Kunststoffplattendeckel). 2D-Zellkulturexperiment – Färbung und Bildgebung (Tage 2-5)Nach der Inkubation mit Verbindungen für unterschiedliche Zeiträume werden 50 μl der Färbelösung pro Vertiefung zu den Platten gegeben, die 10 und 60 Minuten lang mit Verbindungen inkubiert wurden. Die Platten bei 37 °C 20 min inkubieren.Anmerkungen: Bereiten Sie Standardfärbelösungen pro Zeitpunkt vor, indem Sie 8 μl 20 mM Hoechst 33342-Lösung (Endkonzentration 5 μM), 32,5 μl 1 mM Propidiumiodid-Lösung (Endkonzentration 1 μM) und 650 μl unsteriles FBS zu 5.810 μl unsterilem 1x PBS hinzufügen. FBS und PBS werden in einem Wasserbad bei 37 °C vorgewärmt, um einen Temperaturschock zu vermeiden. Führen Sie eine automatisierte Fluoreszenzbildgebung mit einer 20-fach-Objektivlinse durch. Wiederholen Sie das gleiche Färbe- und Bildgebungsverfahren (Schritte 1.4.1 – 1.4.2) für die Platten, die 24 (Tag 3) und 72 (Tag 5) h mit Verbindungen inkubiert wurden.HINWEIS: Typische 2D-Plattenkarten sind in Abbildung 2 dargestellt. 3D-Zellkulturexperiment – Aussaat der Zellen (Tag 1)HINWEIS: Die Schritte für diesen Abschnitt sind identisch mit denen, die für die 2D-Versuchsvorbereitung der Zellkultur, die Inkubation mit den getesteten Verbindungen und die Bildgebung (Schritte 1.1-1.4) beschrieben sind. In diesem Fall werden die Zellen jedoch als kompakte, reife Sphäroide in einer 384-Well-U-Bodenplatte mit extrem geringer Adhäsion und schwarzen, undurchsichtigen Wänden hergestellt. Die Verwendung einer Platte dieser Größe ermöglicht es, zwei Verbindungen in einem Experiment zu vergleichen.Wiederholen Sie die Schritte 1.2.1-1.2.9 aus dem 2D-Experimentprotokoll mit einer LLC-Zellkultur. Nachdem Sie die Zellen gezählt haben, bereiten Sie 25 ml der Zellsuspension vor. Säen Sie 1.000 Zellen pro Well in allen Wells in 50 μl DMEM in einer 384-Well-Platte mit geringer Bindung und U-Boden. 30 s lang bei 40 × g zentrifugieren und mit einem Plattenschüttler bei 250 U/min 1 min schütteln, um die Zellen von den Wänden der Vertiefungen bis zum Boden zu schütteln. Stellen Sie die Platten in einen Inkubator bei 37 °C und 5 % CO2 auf zusätzliche Kunststoffplattendeckel, um eine ungleichmäßige Erwärmung des Plattenbodens für 48 h zu verhindern. 3D-Zellkulturexperiment – Zugabe der Verbindungen (Tag 3)Überwachen Sie die Zellen in den Platten durch Mikroskopie, um sicherzustellen, dass sich kompakte, reife Sphäroide gebildet haben. Bereiten Sie eine serielle Verdünnung der untersuchten Verbindungen in autoklavierten Polypropylen-Klarsichtplatten vor. Fügen Sie in diesem Fall eine zusätzliche Verbindung hinzu. Stellen Sie die folgenden Lösungen für individuelle Zeitpunktmessungen her:Um 175 μM und 350 μM Lösungen von Gramicidin S zu erhalten, werden 1,8 μl 20 mM Stammlösung zu 198,2 μl DMEM und 3,6 μl Stamm zu 196,4 μl DMEM entsprechend hinzugefügt. Um 175 μM und 350 μM Lösungen von LMB002 in “ringoffener” Form zu erhalten, werden 1 μl 40 mM Stammlösung zu 199 μl DMEM und 1,8 μl Stamm zu 198,2 μl DMEM entsprechend hinzugefügt. Um 350 μΜ und 1.750 μM Lösungen von LMB002 in “ringgeschlossener” Form zu erhalten, werden 1,8 μl 40 mM Stammlösung zu 198,2 μl DMEM und 8,8 μl Stamm zu 191,2 μl DMEM entsprechend hinzugefügt. Führen Sie drei weitere Wiederholungen durch, um vier Sätze jedes Konzentrationspunkts zu erhalten. Erzeugen Sie serielle Verdünnungen, indem Sie 20 μl aus jeder Startvertiefung entnehmen, mit 180 μl DMEM in die Vertiefung überführen und gründlich mischen.Anmerkungen: Die Arbeit mit photoschaltbaren Verbindungen erfordert eine Anpassung der Beleuchtung, um eine rückseitige Photoisomerisierung zu verhindern. Es wird empfohlen, das Licht in sterilen Schränken auszuschalten. Die Endkonzentrationen der Verbindungen in Vertiefungen werden durch jeweiliges Überführen von 20 μl der hergestellten Lösungen in 128 Vertiefungen mit 50 μl DMEM erreicht. Fügen Sie jedes Mal 20 μl DMEM in drei Vertiefungen hinzu, um als Kontrolle zu dienen. Decken Sie die Platten mit Aluminiumfolie oder Kunststoffschutzabdeckung ab, um Fotoumschaltungen oder Verdunstungen zu verhindern. Legen Sie die Platten für die gewählte Inkubationszeit in einen Zellkultur-Inkubator auf Plastikplattendeckel. 3D-Zellkulturexperiment – Färbung und Bildgebung (Tage 3-6)Bereiten Sie die Färbelösung pro Zeitpunkt vor, indem Sie 13 μl 1 mM Calcein AM-Lösung (Endkonzentration 1 μM), 22 μl 20 mM Hoechst 33342-Lösung (Endkonzentration 33 μM), 40 μl 1 mM PI-Lösung (Endkonzentration 3 μM), 300 μl unsteriles FBS zu 2.625 μl unsterilem 1x PBS hinzufügen. FBS und PBS werden in einem Wasserbad bei 37 °C vorgewärmt, um einen Temperaturschock zu vermeiden. Nach unterschiedlicher Inkubation mit den Verbindungen werden 20 μl der Färbelösung pro Vertiefung in die Vertiefungen gegeben, die 10 Minuten lang mit Verbindungen inkubiert wurden. Bei 37 °C 2 h inkubieren. Führen Sie konfokale Fluoreszenzbildgebung mit einem 20-fach-Objektiv durch. Wiederholen Sie das gleiche Färbe- und Bildgebungsverfahren für Vertiefungen, die 24 (Tag 4) und 72 (Tag 6) h mit Verbindungen inkubiert wurden.HINWEIS: In diesem Experiment wird Calcein AM als dritte Komponente der mehrfarbigen Färbelösung verwendet. Bilder aus 2D- und 3D-Experimenten werden mit der automatisierten Bildanalysesoftware des Geräts analysiert. Zellen, die gleichzeitig mit Hoechst- und Propidiumiodid-Farbstoffen gefärbt wurden, gelten als nekrotisch tot, und ihr Anteil in Abhängigkeit von der Konzentration wird zur Berechnung des IC50-Wertes verwendet. Abbildung 2: Beispiel typischer Plattenkarten für die 2D-Kulturexperimente. Farbcodes für die Mischungen und die Kontrolle sind angegeben. Die Konzentrationen der getesteten Verbindungen (Zahlen in den Vertiefungen) werden in μM angegeben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. 2. Bestimmung der Photoschalteffizienz in einem Gewebesurrogat Montieren Sie den optischen Zug für die Probenbestrahlung wie in Abbildung 3 gezeigt (bestehend aus einem optischen Kabel von der Laserlichtquelle, einer Linse mit variabler Brennweite, einer Spritze mit einer undurchsichtigen Abdeckung und einem flachen abgeschnittenen Ende).Durch Ändern der Brennweite und der Blende des Objektivs erhalten Sie einen flachen Lichtstrahl mit einem Durchmesser, der 1-1,5 mm größer ist als der Innendurchmesser der verwendeten Spritze, aber immer noch so weit wie möglich innerhalb der Blende liegt. Verwenden Sie eine 5-ml-Spritze mit abgeschnittenem Ende und einem Innendurchmesser von 12,4 mm, die mit einer undurchsichtigen Kunststoffabdeckung abgedeckt ist. Stellen Sie bei einer Laserleistung von 200 mW die Leistungsdichte am Ausgang des optischen Systems auf ~103 mW/cm2 ein, gemessen mit einem Photometer.HINWEIS: Alle nachfolgenden Arbeiten müssen in einem abgedunkelten Raum mit möglichst geringer Arbeitsplatzbeleuchtung durchgeführt werden. Bereiten Sie 3 ml LMB002 (“ringgeschlossene” Form) Stammlösung in PBS mit einer Konzentration von 1 mg/ml vor. Bereiten Sie eine Modellgewebeprobe vor, die mit der inaktiven Fotoform von LMB002 in einem Kunststoffbehälter beladen ist. In einem typischen Durchlauf werden 5 g frisches Schweinehackfleisch mechanisch mit 277 μl LMB002-Stammlösung und 260 μl PBS gemischt, um die Endkonzentration von 50 mg/kg in der Probe und das Verhältnis Gewebe/PBS von ~9/1 (v/v) zu erreichen. Füllen Sie die Spritze mit der vorbereiteten Probe, stellen Sie sicher, dass sich keine Luftblasen im Inneren befinden, und bilden Sie eine ebene Oberfläche am Belichtungsende (Schnitt).Anmerkungen: Der Zylinder der Probe in der Spritze muss ~40 mm entlang der Achse einnehmen. Bestrahlen Sie die Probe im optischen Zug wie in Abbildung 3 gezeigt für 9 min 44 s, was einer Belichtung von ~60 J/cm2 entspricht. Bereiten Sie nach der Belichtung 4 mm dicke Scheiben der Probe vor, indem Sie sie mit dem Kolben von der Spritze drücken und mit einem Skalpell schneiden. Wiegen und legen Sie die Scheiben in separate Reagenzgläser und markieren Sie sie mit dem mittleren Abstand (mm) von der bestrahlten Oberfläche. Bereiten Sie zwei Kontrollproben (optimale Menge, 0,5-0,7 g) in Reagenzgläsern vor: in der einen Hackfleischmischung mit 10 Volumenprozent PBS (54 μl) und in der anderen die in Schritt 2.4 gewonnene Modellgewebeprobe, die 10 Minuten lang mit 500 mW Laserlicht bestrahlt wird, um sicherzustellen, dass alle “ringgeschlossenen” LMB002-Moleküle in die “ringoffene” Form umgewandelt werden. Acetonitril-Wasser-Gemisch (70 %/30 % v/v, ergänzt mit 0,01 % Trifluoressigsäure (TFA), 1,4 ml/g) zu jeder Scheibe und den Kontrollproben. Mischen Sie den Inhalt gründlich mit einem Glasstab. Bei Raumtemperatur mindestens 10 min inkubieren und die Mischungen 20 min bei 5220 x g zentrifugieren oder zweimal bei 20 x g 30 min zentrifugieren, um das unlösliche Material zu entfernen und den Überstand aufzufangen. Sammeln Sie die Überstände vorsichtig (~0,7 ml) und zentrifugieren Sie sie erneut bei 16.000 x g für 30 min. Sammeln Sie die Überstände (jeweils ~0,5 ml) und analysieren Sie sie mittels Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (RP HPLC) mit einer analytischen C18-Säule, einem linearen A:B-Gradienten von 3,46 % B/min, einer Flussrate von 2,0 ml/min und 100 μl injiziertem Volumen. Zeichnen Sie die UV-detektierten Chromatogramme bei 570 nm (Detektion der “ringgeschlossenen” Form) und 270 nm (Detektion der “ringoffenen” Form) auf. Verwenden Sie die unbestrahlten (Schritt 2.4) und bestrahlten Kontrollproben (Schritt 2.8), um die spezifischen Retentionszeiten beider Photoformen (Eluent A: wässrig 0,1 % TFA; Laufmittel B: 90 % Acetonitril-Wasser, 0,1 % TFA) zu bestimmen und die Methode zu kalibrieren. Bestimmung der tatsächlichen Mengen an LMB002-Photoformen in den analysierten Proben unter Verwendung der Kalibrierkurven, die durch die Entnahme und Analyse der Chromatogramme von LMB002-Lösungen bekannter Konzentrationen erhalten wurden. Für die Kalibrierung werden die “ringgeschlossenen” Lösungen LMB002 hergestellt, indem die Stammlösung (Schritt 2.3) mit einem Acetonitril-Wasser-Gemisch (70 %/30 % v/v, ergänzt mit 0,01 % TFA) verdünnt wird, um 0,36, 0,9 und 3,6 μg pro 100 μl (das injizierte Volumen) zu erhalten. Der Eluentengradient und die Flussrate sind die gleichen wie in Schritt 2.12. Wiederholen Sie das Experiment (Schritte 2.4-2.12) dreimal und tragen Sie den normalisierten Prozentsatz jeder Fotoform auf dem Diagramm (Prozentsatz) im Vergleich zur Entfernung (von der bestrahlten Gewebeoberfläche) auf. Berechnen Sie die Statistik (d. h. die Standardabweichung an jedem Konzentrationspunkt). Abbildung 3: Versuchsaufbau zur Bestimmung der Effizienz der Photokonversion im Modellgewebe. (A) Schaltplan und (B) Foto; 1, optisches Kabel von der Laserlichtquelle; 2, Objektiv mit variabler Brennweite; und 3 eine Fleischhackfleisch-LMB002-phosphatgepufferte Kochsalzmischung, die in 4 eine Spritze mit einem undurchsichtigen Deckel und einem geschnittenen Vorderteil (siehe (B) ohne Deckel) gegeben ist). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. 3. Bestimmung der Wirksamkeit von Krebsmedikamenten in vivo HINWEIS: Der Zeitplan für das Experiment und die Endpunkte sind in Abbildung 4 dargestellt. Die Tierpflegestandards in der Nachbehandlungszeit sollten den 3R-Regeln entsprechen – die Unterbringung sollte eine angemessene Käfigdichte und Ressourcenverfügbarkeit beinhalten. Halten Sie sich, wann immer möglich, an nicht-aversive Methoden zur Handhabung von Tieren, wie z. B. Tunneln oder Schröpfen. Abbildung 4: Zeitplan für das therapeutische In-vivo-Experiment . Benennung der Versuchsgruppen, Therapiedetails, Endpunkte und Zeitpläne für die Post-Mortem-Analyse . Abkürzungen: LLC = Lewis-Lungenkarzinom; IV = intravenös; SC = subkutan. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Vorbereitung der Krebszellen für die subkutane Inokulation (Tag 0).Passage der LLC-Zellen in DMEM (4,5 g/l Glukose) mit 10 % FBS, 100 U/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin bei 37 °C und 5 % CO2. Ernten Sie die Zellen mit einer 0,05%igen Trypsin-EDTA-Lösung, zentrifugieren Sie sie und suspendieren Sie sie in serumfreiem DMEM. Zählen Sie die Zellen und bestimmen Sie ihre Lebensfähigkeit mit einem Hämozytometer und einem Trypanblau-Ausschlusstest. Bereiten Sie die endgültige Zellsuspension mit einer Konzentration von 10 × 106 Zellen/ml in DMEM und Matrigel-Mischung (1:1) vor. Bewahren Sie die Suspension vor der Injektion auf Eis auf. LLC-Zellinokulation (Tag 0)Legen Sie die erwachsene weibliche C57BL/6NCrl-Maus (mit einem Gewicht von ~20 g) in die Induktionskammer des Isofluran-Anästhesiegeräts. Führen Sie eine Sedierung mit 5 % Isofluran durch und warten Sie, bis das Tier vollständig bewusstlos ist. Entfernen Sie das Fell durch Rasieren aus dem Bereich der Zellinokulation. Inokulieren Sie 5 × 105 LLC-Zellen in ~100 μl DMEM: Matrigel (1:1)-Mischung in die rechte Hintergliedmaße.Anmerkungen: Halten Sie sich, wann immer möglich, an die Praxis der Verwendung mit einer Nadel. Verabreichung von Präparaten und PhotobestrahlungHINWEIS: In 5-8 Tagen nach der Inokulation sind die Tiere bereit für die Behandlung, wenn ihre Tumore tastbar sind und ein Volumen von ~50-100 mm3 erreicht haben. Alle nachfolgenden Vorgänge mit LMB002 und Mäusen, die mit dieser Verbindung behandelt wurden, sind bei Halbdunkelheit durchzuführen (eine 4-W-LED-Lampe mindestens 5 m vom Arbeitsplatz entfernt).LMB002 (“ringgeschlossene” Form) wird in steriler physiologischer Kochsalzlösung in einer Konzentration von 1 mg/ml für die Dosis von 5 mg/kg (i.v.) gelöst, um dunkelblaue, homogene Lösungen zu erhalten. Stellen Sie vor der Bestrahlung nach dem Zufallsprinzip vier Gruppen zu je acht Tieren zusammen und entfernen Sie das Fell durch Rasur vom Tumor und den umliegenden Bereichen. Legen Sie eine Maus für Infusionsinjektionen in die Halterung und wärmen Sie den Schwanz des Tieres in einem Wasserbad bei 37 °C vor, um die Schwanzvene sichtbar zu machen.HINWEIS: Ziehen Sie eine präoperative Analgesie in Betracht. Injizieren Sie die Verbindung in einer Dosis von 5 ml/kg in die Schwanzvene. Für die beiden Kontrollgruppen injizieren Sie 100 μl Kochsalzlösung (intravenös) pro Tier (20 g Körpergewicht). Stellen Sie sicher, dass die Tiere in den beiden Versuchsgruppen die getestete Verbindung in der inaktiven Photoform (1 mg/ml in Kochsalzlösung) erhalten.Anmerkungen: Halten Sie sich, wann immer möglich, an die Praxis der Verwendung mit einer Nadel. Dann, 2 h 45 min nach der Injektion des Präparats, setzen Sie die Maus unter Narkose. Sedierung mit 3%-4% Isofluran in Sauerstoff induzieren. Halten Sie die Anästhesie 15 Minuten lang mit 0,5%-1% Isofluran in Sauerstoff aufrecht. Bedecken Sie die Maus mit einer schwarzen Maske, die ein Loch besitzt, das nur den Tumorbereich dem Licht aussetzt. Schalten Sie das Laserdiodenmodul mit einem 650-nm-Laser ein und stellen Sie die Leistung des roten Lasers auf 200 mW und die des blauen/UV-Leitlasers auf 2 mW ein.Anmerkungen: Verwenden Sie eine blaue Schutzbrille, wenn das Lasergerät eingeschaltet ist. Messen Sie den Lichtstrom des roten Lasers (weg von den Mäusen) mit einem Photometer und bestimmen Sie den Abstand zum optischen Kabel, wo der Lichtstrom 100 mW/cm2 beträgt. Befestigen Sie das Kabel auf einem Stativ, um sicherzustellen, dass sich die Lichtquelle im festgelegten Abstand zum Tumor befindet und das Licht den gesamten Tumorbereich abdeckt. Verwenden Sie während dieses Verfahrens blaues/UV-Guide-Laserlicht. Schalten Sie den roten Laser ein, um den Tumorbereich 20 Minuten lang zu bestrahlen. Schalten Sie nach der Bestrahlung den Isofluranfluss aus, bringen Sie das Tier in seinen Käfig zurück und beobachten Sie seinen Zustand in den nächsten 30 Minuten sorgfältig.Anmerkungen: Halten Sie die Mäuse nach der Verabreichung des Präparats 2 Tage lang im Dunkeln. Nur der Licht-Tag-Zyklus muss verändert werden; Alle anderen Wohnverhältnisse sollen unverändert bleiben. Beobachtungen nach der BehandlungBeobachten Sie die Tiere täglich und messen Sie das Gewicht und die Größe ihrer Tumore. Messen Sie das Tumorvolumen und notieren Sie das Fortschreiten der Nekrose.HINWEIS: Die Tierpflegestandards in der Nachbehandlungszeit sollten den 3R-Regeln entsprechen – die Unterbringung sollte eine angemessene Käfigdichte und Ressourcenverfügbarkeit beinhalten. Verwenden Sie die im vorherigen Schritt gesammelten Daten, um die Sterblichkeit zu bewerten. Bestimmen Sie die Überlebensrate mit dem Standardverfahren.HINWEIS: Tiere sollten geschlachtet und als tot gezählt werden, wenn schwere klinische Symptome auftreten (Körpergewichtsverlust von mehr als 15 %, Tumorgeschwüre heilen nicht innerhalb von 7 Tagen und Lautäußerung) oder sobald das Tumorvolumen 2.500 mm erreicht3.