Gen-Editierung von primären Rhesusaffen-B-Zellen

Alle tierexperimentellen Verfahren und Experimente wurden gemäß Protokollen durchgeführt, die vom Institutional Animal Care and Use Committee des National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, genehmigt wurden. Eine Zusammenfassung der folgenden Protokolle ist in Abbildung 1 dargestellt. Männliche und weibliche Rhesusaffen (Macaca mulatta) indischer Genetik im Alter von 2 bis 8 Jahren wurden gemäß den Richtlinien des Ausschusses für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren in einer Einrichtung der Biosicherheitsstufe 2 untergebracht und gepflegt. VORSICHT: Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit den universellen Vorsichtsmaßnahmen für durch Blut übertragbare Krankheitserreger, mit sterilen/aseptischen Techniken und geeigneter Ausrüstung der Biosicherheitsstufe 2 in Laminar-Flow-Hauben durchgeführt. 1. rAAV6-Produktion Bereiten Sie die Reagenzien für die rAAV6-Produktion vor.Entwerfen und klonen Sie die homologiegesteuerte Reparaturschablone zwischen den invertierten Terminalwiederholungen (ITRs) von AAV2 im Vektor pAAV unter Verwendung von Standardtechniken. Stellen Sie sicher, dass die Homologiearme auf beiden Seiten mindestens ~ 250 bp betragen, aber nur 60 bp ausreichen können, obwohl längere Homologiearme bevorzugt werden, wenn das Konstruktionsdesign dies zulässt. Wenn Zielsequenzen einer der verwendeten sgRNAs im HDRT vorhanden sind, entfernen Sie sie mit stillen Mutationen, die am effektivsten in dem an den Protospacer angrenzenden Motiv oder der Seed-Region der Zielstelle sind.HINWEIS: Es kann eine Gensynthese in Kombination mit einer Gibson-Assemblierung für eine effiziente Klonierung32 durchgeführt werden. Bereiten Sie einen Maxiprep eines korrekten Klons für die Transfektion vor. Für das sgRNA-Design wird CHOPCHOP33 empfohlen, und eine Liste weiterer Tools finden Sie unter https://zlab.bio/guide-design-resources. Die maximale Verpackungskapazität für AAV einschließlich ITRs beträgt ~4,7 kb. AAV6 ist der am häufigsten verwendete Serotyp zur Bearbeitung hämatopoetischer Zellen, insbesondere B-Zellen9. Andere Serotypen von AAV für die Gen-Editierung von Rhesusaffen-B-Zellen wurden nicht getestet, aber AAV28 und AAV-DJ10,11 wurden in Mausstudien verwendet. Bereiten Sie 293AAV-Nährmedium und Produktionsmedium gemäß Tabelle 1 und Tabelle 2 vor. Sterilfilter durch eine 0,2 μm Polyethersulfon (PES) Membranfiltereinheit. Bei 4 °C lagern. Bereiten Sie 1x Polyethylenimin (PEI) -Lösung (1 mg/ml, 100 ml) vor. In einem 250-ml-Glasbecher ~ 70 ml H2O in einer Mikrowelle für ~ 30 s erhitzen und dann 100 mg PEI hinzufügen. Fügen Sie einen Magnetrührer hinzu und rühren Sie, bis sich das PEI weitgehend aufgelöst hat. Stellen Sie den pH-Wert mit 1 M HCl auf 7 ein, füllen Sie dann mit H2O auf 100 ml auf, warten Sie 10 Minuten, überprüfen Sie den pH-Wert erneut und passen Sie ihn gegebenenfalls an. Sterilfiltrieren Sie die PEI-Lösung durch eine 0,2 μm PES-Membranfiltereinheit, aliquot, und lagern Sie sie bei −20 °C. Nach dem Auftauen kann die Lösung bei 4 °C bis zu 2 Monate gelagert werden. Bereiten Sie 5x Polyethylenglykol (PEG)/NaCl-Lösung vor. Wiegen Sie 400 g PEG 8.000 und 24 g NaCl ab. Geben Sie einen Magnetrührer in ein 2-Liter-Glasbecherglas, fügen Sie das abgewogene PEG 8.000 und NaCl hinzu und spülen Sie es mit ~ 550 ml deionisiertem Wasser ab. Unter Hitze umrühren und auf 80-90 °C zum Kochen bringen, bis es sich vollständig aufgelöst hat. Stellen Sie den pH-Wert mit 1 M NaOH auf ~7,4 ein, stellen Sie dann das Volumen mit einem Messzylinder auf 1 l ein und füllen Sie es mit dem Magnetrührer in eine 2-l-Glasflasche. Autoklavieren Sie die Flasche, den Magnetrührer und die Lösung in einem Wasserbad für 30 Minuten bei 121 °C. Kühlen Sie die Lösung nach dem Autoklavieren in einem kalten Raum unter Rühren mit dem Magnetrührer ab, um eine Trennung in verschiedene Phasen zu verhindern. Bei Bedarf aliquotieren und bei 4 °C lagern. Bereiten Sie den Formulierungspuffer vor. Mischen Sie 500 ml DPBS mit 50 μl 10% Pluronic F-68. Sterilfilter durch eine 0,2 μm PES-Membranfiltereinheit und Lagerung bei Raumtemperatur (RT). Zellkultur, Transfektion und Transduktion für die rAAV6-ProduktionTauen, kultivieren und frieren Sie 293AAV-Zellen ein, wie vom Hersteller beschrieben, unter Verwendung des oben genannten 293AAV-Kulturmediums und Trypsin-EDTA zur Spaltung. Es wird empfohlen, einige frühe Passagen einzufrieren und die Zellen für die AAV-Produktion zu verwenden, bevor sie Passage 40 erreichen. Für die rAAV6-Produktion werden vier 15-cm-Zellkulturschalen mit 5 x 106 Zellen in jeweils 30 ml ausgesät. Die Zellen sind in der Regel 1-2 Tage nach der Aussaat bereit für die Transfektion, wenn sie 80%-90% Konfluenz erreichen. Tauen Sie ein Maxiprep des pAAV-Plasmids auf, das das HDRT enthält, um es in AAV6 zu verpacken. Resuspendieren Sie 85,6 μg des pAAV-Plasmids in 3 ml reinem DMEM-Medium. 342 μl 1 mg/ml PEI-Lösung werden in 3 ml reinem DMEM-Medium gelöst. Inkubieren Sie beide Lösungen 10 Minuten lang bei RT. Mischen Sie beide 3-ml-Röhrchen in ein Röhrchen mit ~ 6,4 ml Transfektionsmischung und inkubieren Sie sie 20 Minuten lang bei RT. Tauen Sie in der Zwischenzeit den Tetracyclin-fähigen, selbstschalldämpfenden Hilfsvektor RepCap6 aus dem -80 °C-Gefrierschrank in einem 37 °C-Wasserbad auf. Um die 293AAV-Zellen zu transduzieren, wird der Helfervektor bei einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 25 unter Verwendung der mittleren infektiösen Gewebekulturdosis (TCID 50) und unter der Annahme von 1,15 x10 7 Zellen/Schale hinzugefügt; In der Regel werden 2-10 μl pro 15-cm-Schale verwendet. Schaukeln und schwenken Sie das Geschirr vorsichtig, um es zu verteilen. Nach der Inkubation der Transfektionsmischung 1,6 ml davon tropfenweise auf jede der vier 15 cm großen Schalen geben. Über Nacht bei 37 °C und 5 % CO2 inkubieren.HINWEIS: Wenn die interessierenden rAAV6-Vektoren bereits verfügbar sind, können diese Vektoren alternativ verwendet werden, um das zu verpackende virale Genom bereitzustellen, was die Notwendigkeit von Plasmiden mit diesem System negiert und vergleichbare rAAV6-Titer liefert. Für diesen Ansatz werden die 293AAV-Zellen mit dem gewünschten rAAV6 bei einem MOI von 50 (basierend auf rAAV6-Genomkopien [GC]/ml) zusammen mit dem Helfervektor co-transduziert. Am nächsten Tag das Nährmedium vorsichtig absaugen, entsorgen und durch 30 ml vorgewärmtes Produktionsmedium ersetzen. Vor der Ernte weitere 96 Stunden inkubieren. Es wird kein weiterer Medienwechsel empfohlen, um die Erträge zu maximieren. Gewinnung und Reinigung des rekombinanten AAV6 aus dem MediumSammeln Sie den gesamten Zellüberstand in einer Filtereinheit mit einer 0,2 μm PES-Membran, die mindestens 50 % größer ist als das Volumen des zu filternden Mediums, ohne die Zellen aus der Schale zu entfernen. Filtern Sie dann den Überstand.HINWEIS: Wenn höhere Ausbeuten an rAAV6 gewünscht werden, können die Zellen geerntet und das rAAV aus dem Zellpellet unter Verwendung kommerzieller Kits oder etablierter Protokolle extrahiert werden34,35. Da AAV6 meist in das Medium36 sezerniert wird, wurde nur Überstand verwendet, wodurch Arbeit, Kosten und Zeit reduziert wurden. 5x PEG/NaCl-Lösung wird mit 25% des gesammelten Volumens in den filtrierten Überstand gegeben; Dies sind typischerweise 30 ml, wenn vier 15-cm-Schalen mit 30 ml verwendet werden. Durch Umdrehen gut mischen und dann über Nacht bei 4 °C inkubieren, um die Viruspartikel auszufällen.HINWEIS: AAV-Partikel sind in dieser Lösung bis zu 2 Tage stabil. Kühlen Sie eine Schaufelzentrifuge mit 250 mL Röhrcheneinsätzen auf 4 °C vor. Bereiten Sie eine 4-ml-Zentrifugalfiltereinheit mit einem Cutoff-Wert von 100 kDa und einen hydrophilen PES-Spritzenfilter von 0,22 μm vor, indem Sie jede Membran mit 2 ml 10% Pluronic F-68 für mindestens 1 h bei RT vorbehandeln. Das AAV-PEG/NaCl-Gemisch wird in ein 250-ml-Röhrchen überführt, bei 2.500 x g 1 h bei 4 °C zentrifugiert und dann der gesamte Überstand vorsichtig durch Absaugen entfernt. Resuspendieren Sie das beige bis weiße Viruspellet durch Vortexen in 4 ml 1 M HEPES, bis es vollständig resuspendiert ist. Bei Bedarf 5 Minuten stehen lassen und erneut wirbeln. Resuspendieren Sie mit einer serologischen 5-ml-Pipette und überführen Sie das Gesamtvolumen in ein 15-ml-Röhrchen. Fügen Sie in einem Abzug der Virussuspension ein gleiches Volumen Chloroform hinzu – typischerweise 4 ml. 2 min kräftig wirbeln und dann bei 1.000 x g 5 min bei RT zentrifugieren. Sammeln Sie die oberste Schicht (AAV-haltiger Überstand) in einem neuen 50-ml-Röhrchen und entsorgen Sie die untere Schicht (Chloroform).ACHTUNG: Chloroformhaltige Lösungen sind gefährliche Abfälle. Befolgen Sie die institutionellen Richtlinien für die Entsorgung. Legen Sie den AAV-haltigen Überstand unter einen Abzug und lassen Sie das restliche Chloroform 30 Minuten lang verdampfen. Waschen Sie in der Zwischenzeit die vorbehandelte Zentrifugalfiltereinheit und den Spritzenfilter. Geben Sie 1,5 ml Formulierungspuffer in die vorbehandelte Zentrifugalfiltereinheit. Zentrifugieren bei 3.500 x g für 10 min bei 15 °C in einem schwingenden Schaufelrotor. Wiederholen Sie diesen Schritt mit 4 ml Formulierungspuffer, um die Membran zu waschen. Spülen Sie den Spritzenfilter zweimal mit 5 ml Formulierungspuffer mit einer 5-ml-Spritze aus. Füllen Sie den ~4 ml AAV-haltigen Überstand aus der Chloroformextraktion in eine 5-ml-Spritze, setzen Sie den gewaschenen Spritzenfilter ein und filtern Sie direkt in die Zentrifugalfiltereinheit. Zentrifugieren Sie bei 3.500 x g für 25 min bei 15 °C und vergewissern Sie sich dann, dass die AAV-Lösung im Filter etwa zwischen 50 und 100 μl liegt. Wenn das Volumen der Lösung >100 μl beträgt, zentrifugieren Sie weiter. Nach dem Entfernen des Filtrats werden 4 ml Formulierungspuffer in den Becher der Zentrifugalfiltereinheit gegeben und die Lösung durch Pipettieren gleichmäßig gemischt. Zentrifugieren Sie 3.500 x g für 25 min bei 15 °C und bestätigen Sie dann, dass die AAV-Lösung im Filter zwischen 50 und 100 μl liegt. Wenn das Volumen der Lösung >100 μl beträgt, zentrifugieren Sie weiter. Wiederholen Sie diesen Schritt für eine weitere Wäsche. Bestätigen Sie nach der abschließenden Zentrifugation, dass das Volumen der Lösung 50-70 μl beträgt. Wenn nicht, zentrifugieren Sie weiter. Übertragen Sie das Präparat in ein 1,5-ml-Röhrchen. Falls gewünscht, aliquotieren und bei −80 °C lagern. Rekombinante AAV6-Titerbestimmung mittels qPCRHINWEIS: Die qPCR-Primer glühen im ITR-Bereich und sollten daher für alle in pAAV klonierten Konstrukte geeignet sein.Tauen Sie ein Aliquot des zu titerierenden rAAV6 und ein Aliquot des AAV6-Referenzmaterials auf. Das AAV6-Referenzmaterial sollte nahe bei 4 x 1011 GC/ml liegen; Andernfalls passen Sie die Verdünnungen entsprechend an. Führen Sie einen DNase-I-Aufschluss durch, um die verbleibende freie Plasmid-DNA in der rAAV6-Präparation zu entfernen, indem 2,0 μl der Probe oder des AAV6-Referenzmaterials mit 15,6 μl nukleasefreiem H 2 O,2,0μl 10x DNase I-Puffer und 0,4 μl DNase I kombiniert werden. Vorsichtig mischen und 30 Minuten bei 37 °C inkubieren und dann auf Eis geben. Dies ist Verdünnung 1 (siehe Tabelle 3). Bereiten Sie fünffache serielle Verdünnungen aller Proben und des AAV6-Referenzmaterials wie in Tabelle 3 unten mit Wasser vor. Bereiten Sie einen SYBR Green qPCR-Mastermix vor. Mischen Sie pro Vertiefung 4,7 μl nukleasefreies Wasser mit 10 μl SYBR Green-Mastermix, 0,15 μl ITR-Primer vorwärts bei 100 μM und 0,15 μl ITR-Primer umgekehrt bei 100 μM.HINWEIS: Jede Probe wird doppelt gemessen, mit 16 Vertiefungen für den Referenzstandard, 8 Vertiefungen pro Probe und 2 Vertiefungen für eine No-Template-Kontrolle. Bereiten Sie 10 % mehr Mastermix vor, um Pipettierfehler zu berücksichtigen. Laden Sie in einer optischen 96-Well- oder 384-Well-Reaktionsplatte 15 μl/Well des SYBR Green qPCR-Mastermixes. Als nächstes laden Sie 5 μl Proben und AAV6-Referenzmaterial oder nukleasefreies Wasser für die No-Template-Kontrolle. Für den AAV6-Referenzstandard Lastverdünnung 2 bis Verdünnung 9. Für Proben wird die Verdünnung 5 bis 8 belastet. Messen Sie jede Verdünnung in zweifacher Ausfertigung. Vermeiden Sie Blasen. Versiegeln Sie die beladene Platte mit einer optisch transparenten Folie, zentrifugieren Sie sie bei 800 x g für 1 Minute bei RT und laden Sie die Platte mit dem entsprechenden 96-Well- oder 384-Well-Setup in das qPCR-Gerät. Einrichten und Ausführen des qPCR-Geräts mit SYBR-Detektion unter den folgenden Zyklusbedingungen: 98 °C für 3 min, dann 40 Zyklen von 98 °C für 15 s und 58 °C für 30 s, gefolgt von einer Schmelzkurve. Analysieren Sie die Daten mit der Software des Instruments unter Verwendung der Konzentration des AAV6-Referenzmaterials in Genomkopien pro Millimeter (GC/ml) als Standardkurve (siehe Tabelle 3). Berechnen Sie die Endkonzentration der Probe, indem Sie sie mit dem Verdünnungsfaktor multiplizieren. Stellen Sie sicher, dass die Standardkurve R2 nahe bei 1,0 liegt, die PCR-Effizienz 90 % bis 110 % beträgt, die Basislinie entfernt wurde, die Schmelzkurve einen einzelnen Peak zeigt, sichdie Ct-Werte entsprechend den Verdünnungen ändern und die Duplikate innerhalb von 0,5 Ct liegen; Andernfalls schließen Sie Ausreißer aus. Erwarten Sie Renditen wie in Abbildung 2. 2. Vorbereitung von B-Zell-Medien und -Stimuli Auftaumedium vorbereiten: Kombinieren Sie RPMI-1640 mit 20% FCS. Sterilfilter durch eine 0,2 μm PES-Membranfiltereinheit. Bei 4 °C lagern. B-Zellkulturmedium vorbereiten: Kombinieren Sie die Reagenzien in Tabelle 4 und filtern Sie sie dann durch eine 0,2-μm-PES-Membranfiltereinheit. Bei 4 °C lagern. Resuspendieren Sie jedes der B-Zell-Stimulanzien in Tabelle 5 in Stammkonzentrationen in B-Zellkulturmedium, mit Ausnahme von CpG ODN, das in nukleasefreiem Wasser resuspendiert werden sollte. Bei −80 °C lagern. Wenn Sie eine Nicht-B-Zell-negative Depletion durchführen (optionaler Schritt 4), bereiten Sie DPBS (kein Kalzium, kein Magnesium) mit 2% FCS (DPBS 2% FCS) vor. Sterilfilter durch eine 0,2 μm PES-Membranfiltereinheit. Bei 4 °C lagern. 3. Präparation und Kultivierung von Rhesusaffen-B-Zellen ANMERKUNG: Kryokonservierte Rhesusaffen-PBMCs oder Splenozyten werden verwendet, um die Zellkultur30,31 aufzubauen. Auftaumedium und B-Zellkulturmedien in einem 37 °C heißen Wasserbad vorwärmen. Tauen Sie die B-Zell-Stimulanzien aus Tabelle 5 auf Eis auf. Bereiten Sie ein Röhrchen mit vorgewärmtem Auftaumedium in geeigneter Größe vor. Diese sollte idealerweise mehr als das 10-fache des Volumens der aufgetauten Zellen betragen. In einem Wasserbad bei 37 °C werden jeweils ein bis zwei Kryozellen mit PBMCs oder Splenozyten aufgetaut und in das vorbereitete Röhrchen mit vorgewärmtem Medium umgefüllt. Spülen Sie die Kryoröhren, um alle Zellen zu sammeln. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 x g für 10 min bei RT.HINWEIS: Diese Zentrifugationseinstellungen reduzieren die Thrombozytenkontamination bei gleichzeitiger Erhaltung der PBMC-Ausbeute. Es können höhere Geschwindigkeiten wie 350 x g für 5 min verwendet werden. Resuspendieren Sie die Zellen zum Waschen in 10 ml Auftaumedium. Wiederholen Sie Schritt 3.4 und Schritt 3.5 für insgesamt drei Zentrifugationen, um das Gefriermedium zu entfernen. Nach der letzten Zentrifugation resuspendieren Sie die Zellen mit geschätzten ~5 x 106 Zellen/ml in B-Zellkulturmedium.HINWEIS: Das obige Protokoll kultiviert ganze PBMC- oder Splenozytenpräparate mit Kontamination durch andere Zellen. Wenn reinere B-Zellkulturen erforderlich sind, wenn auch mit deutlich reduzierter Gesamt-B-Zellausbeute, fahren Sie mit Schritt 4 fort. Es wurden keine Unterschiede in der Bearbeitungseffizienz zwischen den beiden Methoden beobachtet. Zur Zählung wird ein Aliquot von 10 μl Zellen nach Bedarf mit B-Zellkulturmedium verdünnt. Zählen Sie mit einem Hämozytometer und einer Trypanblau-Färbung, wobei gleiche Volumina resuspendierter Zellen und Trypanblau 0,4% ige Lösung kombiniert werden. Stellen Sie die Zellkonzentration auf 3 x 106 Zellen/ml mit B-Zellkulturmedium entsprechend der Zellzahl ein. Fügen Sie dann die B-Zell-Stimulanzien zu ihren endgültigen Konzentrationen gemäß Tabelle 5 hinzu und mischen Sie. Übertragen Sie die Zellen in eine geeignete Zellkulturschale. Insgesamt werden 0,6 x 10 6-0,7 x 106 Zellen/cm2 empfohlen. Inkubation der Zellen bei 37 °C mit 5% CO 2 für 48 h ±2 h. 4. Optionale negative Depletion von Nicht-B-Zellen HINWEIS: Ausbeute und Reinheit hängen vom Input-Prozentsatz der B-Zellen unter den PBMCs ab, der sich zwischen den einzelnen Rhesusaffen drastisch unterscheiden kann27. Erwarten Sie eine Reinheit von 80 % bis 95 %, einen Wirkungsgrad von 60 % und 1 x 10 6-1,5 x 106 Zellen von 1 x 107 PBMCs. Nach dem letzten Waschen (Schritt 3.6) resuspendieren die Zellen bei 1 x 108 Zellen/ml in DPBS 2% FCS und humanem Fc-Block verdünnt 1:200. Die Zellzahlen basieren auf der Anzahl der aufgetauten Zellen. Inkubieren Sie 15 Minuten lang auf Eis, um die Fc-Rezeptoren zu blockieren, und fügen Sie dann die biotinylierten Antikörper in Tabelle 6 hinzu. Weitere 20 Minuten auf Eis inkubieren. Das Röhrchen mit DPBS 2% FCS auffüllen und bei 200 x g 10 min bei 4 °C schleudern. Resuspendieren Sie die Zellen in DPBS 2% FCS bei 80% des Volumens aus Schritt 4.1 (d. h. 80 μL pro 1 x 107 Zellen). Fügen Sie der Zellsuspension magnetische Streptavidinkügelchen mit 20 % des Volumens aus Schritt 4.1 hinzu (d. h. 20 μl Kügelchen pro 1 x 107 Zellen). Inkubieren Sie die Zellen 15 Minuten lang auf Eis und rühren Sie gelegentlich um. Bereiten Sie in der Zwischenzeit pro 1 x 108 Zellen einen Magnetabscheider mit einer großen magnetischen Verarmungssäule und einem Vorabscheidefilter vor. Spülen Sie den Vorabscheidefilter und die Säule mit 2 ml DPBS 2% FCS durch Schwerkraftströmung und entsorgen Sie den Durchfluss. Installieren Sie ein 15-ml-Auffangröhrchen.HINWEIS: Die Verwendung anderer Säulen wie positiver Selektionssäulen oder anderer magnetischer Perlenreinigungssysteme kann die Reinheit drastisch reduzieren. Füllen Sie die Zellen nach der Inkubation auf 0,5 ml mit DPBS 2% FCS auf, wenn das Volumen <0,5 ml beträgt. Wenn das Volumen ≥0,5 ml beträgt, fahren Sie einfach fort. Laden Sie die Zellsuspension in den Vorabscheidefilter auf der vorbereiteten Säule und sammeln Sie den Durchfluss in das 15-ml-Röhrchen. Die ungebundenen angereicherten B-Zellen werden zweimal durch Zugabe von 1 ml DPBS 2% FCS in den Vorabscheidefilter eluiert. Sammeln Sie die ungebundenen Zellen durch Schwerkraft in derselben Röhre.HINWEIS: Eine zusätzliche Elution kann die Ausbeute geringfügig erhöhen. Die Reinheit und Effizienz kann durch die Durchflusszytometrie der Eingangszellen, angereicherten Zellen und Zellen, die auf der Säule zurückgehalten werden, bewertet werden. Um die auf der Säule verbliebenen Zellen zu erhalten, entfernen Sie die Säule vom Magneten und spülen Sie sie mit dem mitgelieferten Kolben mit 3 ml DPBS 2% FCS ab. Falls gewünscht, bewerten Sie die Reinheit durch Durchflusszytometrie wie in Abbildung 3 unter Verwendung der Reagenzien in Tabelle 7. Zentrifugieren Sie die angereicherten B-Zellen bei 200 x g für 10 min bei 4 °C. Resuspendieren Sie die Zellen bei geschätzten ~ 5 x 106 Zellen/ml in B-Zellkulturmedium und fahren Sie mit Schritt 3.7 fort. 5. Primäre Rhesusaffen-B-Zell-Gen-Editierung Nachdem Sie die Rhesusaffen-B-Zellen für 48 h ± 2 h aktiviert haben, bereiten Sie die Reagenzien für die Elektroporation und Transduktion vor.Vorwärm-DMSO, nukleasefreier Duplex-Puffer, Puffer T und Puffer E (10-μl-Elektroporationskit) oder E2 (100-μl-Elektroporationskit) aus dem Elektroporationskit auf RT. Tauen Sie die rAAV6-HDRT- und B-Zell-Stimulanzien aus Tabelle 5 auf Eis auf. Resuspendieren Sie die CRISPR-Cas9-sgRNAs bei 100 μM im Duplexpuffer. 10 Minuten bei RT rekonstituieren und durch Vortexen und Schnippen mischen. Bewahren Sie die rekonstituierten sgRNAs bis zur Verwendung auf Eis auf. Bei −80 °C lagern.HINWEIS: CRISPR-Cas9 sgRNAs können mit verschiedenen Online-Tools (siehe 1.1.1) entworfen werden und können in ihrer Schneideffizienz drastisch variieren. Eine empirische Prüfung der Schneideffizienz wird mit Assays wie TIDE37 oder ICE38 empfohlen. Bereiten Sie pro 10 μl Elektroporation 550 μl B-Zellkulturmedium mit allen Stimulanzien aus Tabelle 5 vor und fügen Sie 1% DMSO hinzu. Skalieren Sie die Volumina um das 10-fache für 100-μl-Elektroporationen. Optional können 10% dieses Mediums ohne Antibiotika-Antimykotikum hergestellt werden, was die Zelllebensfähigkeit nach der Transfektion leicht erhöht. Bereiten Sie pro 10-μl-Elektroporation eine Vertiefung einer 48-Well-Zellkulturplatte mit 50 μl des B-Zellkulturmediums mit Stimulanzien und ohne Antibiotika-Antimykotikum vor, falls verwendet. Für 100-μl-Elektroporationen pipettieren Sie 500 μl in die Vertiefungen einer 6-Well-Platte. Fügen Sie dem Medium in den Vertiefungen rAAV6 HDRT hinzu, bis zu 20 % des Volumens im Vertiefungs. Ziel sind MOIs im Bereich von 1 x 10 5-1 x 10 6 basierend auf der Anzahl der Zellen pro Transfektion (10 μL Elektroporation: 5 x 10 5 Zellen; 100 μL Elektroporation:5 x 106 Zellen) und der GC in der rAAV6-Präparation anzustreben. Hohe rAAV6-Stammkonzentrationen von 5 x 1013 GC/ml bis 5 x 1014 GC/ml werden empfohlen, um hohe MOIs mit geringen Volumina zu erreichen.HINWEIS: Niedrigere MOIs können zu einer verringerten Bearbeitungseffizienz führen, und MOIs von 5 x 105 liegen im Allgemeinen nahe an der maximalen Bearbeitungseffizienz, die wir gesehen haben. Ein Einfluss unterschiedlicher MOIs auf die Lebensfähigkeit von B-Zellen wurde nicht beobachtet. Es wird empfohlen, Kontrollen ohne rAAV6 HDRT, ohne RNP-Transfektion und ohne beides einzuschließen. Das zubereitete Geschirr und das restliche Medium vorwärmen, indem man es in einen Inkubator bei 37 °C mit 5% CO2 überführt. Bereiten Sie pro 10 μl Elektroporation 1,15 μl Ribonukleoprotein (RNP) vor: Mischen Sie 0,4 μl 61 μM Cas9 mit 0,75 μl 100 μM sgRNA in Duplexpuffer. Bereiten Sie sich aufgrund eines Pipettierfehlers und zur Vermeidung von Blasen beim Laden der Elektroporationsspitzen extra vor (30% mehr für eine einzelne Elektroporation wird empfohlen). 10-fach skalieren für 100 μL Spitzen. Inkubieren Sie das RNP mindestens 15 Minuten lang bei RT, bevor Sie es mit den Zellen mischen. Nach der Inkubation können mehrere RNPs kombiniert werden, wenn mehr als ein Locus gleichzeitig anvisiert werden soll. Es wurden keine signifikanten Unterschiede in der Effizienz bei bis zu drei Loci gleichzeitig beobachtet. Bereiten Sie in der Zwischenzeit die Zellen für die Elektroporation vor. Halten Sie die Zellen immer auf RT, um Temperaturschocks zu vermeiden. Ernten Sie die Zellen nach 48 h ± 2 h Kultur in ein geeignetes Gefäß. Spülen Sie das Geschirr mit DPBS aus, um die maximale Anzahl von Zellen zu sammeln. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 x g für 10 min bei RT. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in DPBS bei ~2 x 106 Zellen/ml. Kombinieren Sie 10 μl Trypanblau 0,4% ige Lösung mit 10 μl der Zellsuspension und zählen Sie mit einem Hämozytometer.HINWEIS: Erwarten Sie zu diesem Zeitpunkt aufgrund von Verlusten während der Ernte und des Waschens etwa 60% der Zellen, die 48 Stunden ± 2 Stunden früher in Kultur gebracht wurden. In der Zwischenzeit zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 x g für 10 min bei RT. Entsorgen Sie den Überstand und achten Sie darauf, dass die verbleibenden DPBS minimiert werden. Resuspendieren Sie die Zellen in vorgewärmtem (RT) Puffer T bei 5,55 x 107 Zellen/ml basierend auf der obigen Zellzahl. Richten Sie das Transfektionssystem ein, indem Sie das Gerät einschalten und auf 1.350 V, 15 ms und 1 Impuls einstellen. Platzieren Sie die Pipettenstation in der Laminar-Flow-Haube Bereiten Sie für jeden Satz von 10 Elektroporationen ein Transfektionsröhrchen mit 3 ml Puffer E (für 10 μl-Transfektionen) oder E2 (für 100 μl-Transfektionen) vor. Führen Sie das Röhrchen in die Pipettenstation ein. Kombinieren Sie pro 10 μl Elektroporation 1,15 μl RNP mit 9 μl Zellen. Stellen Sie sicher, dass ein ausreichendes Volumen (+ 30%) vorhanden ist, um zu vermeiden, dass Luft in die Elektroporationsspitze gesaugt wird. Vor der Elektroporation 1-2 Minuten bei RT inkubieren. Saugen Sie 10 μl oder 100 μl RNP und Zellgemisch in die entsprechend große Elektroporationsspitze einer Elektroporationspipette ein, führen Sie die beladene Pipette in die Pipettenstation ein und starten Sie die Elektroporation. Stellen Sie sicher, dass die Spitzen vollständig frei von Luftblasen sind, um Lichtbögen zu vermeiden. Beobachten Sie während der Elektroporation, ob kein Lichtbogen auftritt. Die elektroporierten Zellen werden sofort in das vorbereitete, vorgewärmte, kleine Volumen des Mediums mit oder ohne rAAV6 in der 48-Well- (10-μl-Transfektionen) oder 6-Well-Platte (100-μl-Transfektionen) ausgeworfen. Wiederholen Sie die Schritte 5.15 bis 5.17 mit den verbleibenden Beispielen. Kontrollproben ohne Transfektion in die Kulturvertiefungen geben. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C mit 5 % CO 2 für 4 h ±2 h und fügen Sie dann das vorbereitete, vorgewärmte B-Zellkulturmedium hinzu, das Stimulanzien, DMSO und Antibiotika/Antimykotikum enthält: 450 μl für 10 μl Transfektionen oder 4,5 ml für 100 μl Transfektionen. Die Inkubation bei 37 °C mit 5% CO2 für 12-24 h fortsetzen. Wechseln Sie dann das Medium zu einem B-Zellkulturmedium, das Stimulanzien und Antibiotika/Antimykotikum ohne DMSO enthält, wenn eine längere Kultivierung gewünscht wird. Die Analyse der genomischen DNA kann nach 24 h durchgeführt werden. Digitale Tröpfchen-PCR unter Verwendung eines Primers außerhalb des Homologiearms und eines Primers innerhalb des Inserts kann verwendet werden, um die Bearbeitungseffizienz39 zu quantifizieren. Führen Sie PCRs durch, um die Insertionsstelle zu amplifizieren, und führen Sie eine Sanger-Sequenzierung durch, um die korrekte Bearbeitung zu überprüfen. Für die Analyse des Proteingehalts werden die Zellen nach der Elektroporation 40-48 h lang kultiviert, um Änderungen der Proteinexpression zu ermöglichen, und eine Analyse mittels Durchflusszytometrie unter Verwendung der Reagenzien in Tabelle 7 durchgeführt.