原代恒河猴B细胞的基因编辑

所有动物程序和实验均按照美国国立卫生研究院国家过敏和传染病研究所机构动物护理和使用委员会批准的协议进行。 图 1 总结了以下协议。2-8岁印度遗传起源的雄性和雌性恒河猴（Macaca mulatta）按照实验动物护理和使用委员会的指导方针在生物安全二级设施中饲养和照顾。 注意：所有实验均按照血源性 病原体的通用预防措施，在层流罩中使用无菌/无菌技术和适当的生物安全2级设备进行。 1. rAAV6生产 准备用于rAAV6生产的试剂。使用标准技术在载体pAAV中AAV2的倒置末端重复序列（ITR）之间设计和克隆同源定向修复模板。确保两侧的同源臂至少为 ~250 bp，但只要 60 bp 就足够了，但如果结构设计允许，则首选更长的同源臂。如果HDRT中存在任何使用的sgRNA的靶序列，则使用沉默突变将其去除，这在靶位点的原间隔相邻基序或种子区域中最有效。注意：可以进行基因合成与Gibson组装相结合以实现高效克隆32 。准备正确克隆的Maxiprep进行转染。对于sgRNA设计，建议使用CHOPCHOP33 ，更多工具的列表可以在 https://zlab.bio/guide-design-resources 中找到。包括 ITR 在内的 AAV 的最大封装容量为 ~4.7 kb。AAV6是编辑造血细胞，特别是B细胞最常用的血清型9。用于恒河猴B细胞基因编辑的AAV的其他血清型尚未经过测试，但AAV28 和AAV-DJ10，11 已用于小鼠研究。 根据表 1 和 表2制备293AAV培养基和生产培养基。通过 0.2 μm 聚醚砜 （PES） 膜过滤装置进行无菌过滤。储存在4°C。 制备 1x 聚乙烯亚胺 （PEI） 溶液（1 毫克/毫升，100 毫升）。 在250mL玻璃烧杯中，在微波炉中加热~70mL的H2O~30秒，然后加入100mgPEI。加入磁力搅拌器，搅拌至PEI大部分溶解。 用 1 M HCl 将 pH 值调节至 7，然后用 H2O 加至 100 mL，等待 10 分钟，再次检查 pH 值，必要时进行调整。 通过0.2μm PES膜过滤单元无菌过滤PEI溶液，等分试样，并储存-20°C。 解冻后，溶液可在4°C下储存长达2个月。 准备5x聚乙二醇（PEG）/NaCl溶液。 称取 400 克 PEG 8，000 和 24 克氯化钠。 将磁力搅拌器加入2L玻璃烧杯中，加入称出的PEG 8，000和NaCl，并用~550mL去离子水冲洗。 加热搅拌，煮沸或80-90°C直至完全溶解。 用1M NaOH将pH调节至~7.4，然后使用测量筒将体积调节至1L，并用磁力搅拌器将其转移到2L玻璃瓶中。 将瓶子，磁力搅拌器和溶液在121°C的水浴中高压灭菌30分钟。 高压灭菌后，在使用磁力搅拌器搅拌的同时，在冷室中冷却溶液，以防止分离成不同的相。必要时等分，并储存在4°C。 准备配方缓冲液。 将 500 mL DPBS 与 50 μL 10% 冥王星 F-68 混合。通过0.2μm PES膜过滤单元无菌过滤，并在室温（RT）下储存。 用于 rAAV6 生产的细胞培养、转染和转导按照制造商的说明，使用上述293AAV培养基和胰蛋白酶-EDTA进行解冻，培养和冷冻293AAV细胞进行分裂。建议冷冻一些早期传代，并在细胞达到第40代之前使用细胞进行AAV生产。 对于 rAAV6 生产，用 5 x 106 个细胞接种四个 15 cm 细胞培养皿，每个培养皿 30 mL。细胞通常在接种后1-2天达到80%-90%汇合时准备转染。 解冻含有HDRT的pAAV质粒Maxiprep，以包装成AAV6。将 85.6 μg pAAV 质粒重悬于 3 mL 纯 DMEM 培养基中。 将 342 μL 的 1 mg/mL PEI 溶液溶解在 3 mL 纯 DMEM 培养基中。将两种溶液在室温下孵育10分钟。 将两个 3 mL 管混合到一管 ~6.4 mL 转染混合物中，并在室温下孵育 20 分钟。 同时，在37°C水浴中解冻-80°C冰箱中的启用四环素的自沉默辅助载体RepCap6。为了转导293AAV细胞，使用中位组织培养感染剂量（TCID 50）并以25的感染多重性（MOI）添加辅助载体，并假设1.15 x10 7 个细胞/培养皿;通常，每 15 cm 培养皿使用 2-10 μL。轻轻摇晃并旋转盘子以分发。 转染混合物孵育后，在四个 15 cm 培养皿中逐滴加入 1.6 mL。在37°C和5%CO2 下孵育过夜。注意：或者，如果感兴趣的rAAV6载体已经可用，则这些载体可用于提供要包装的病毒基因组，这消除了该系统对任何质粒的需求，并产生相当的rAAV6滴度。对于这种方法，293AAV细胞与所需的rAAV6共转导，MOI为50（基于rAAV6基因组拷贝[GC]/mL）以及辅助载体。 第二天，小心吸出并丢弃培养基，并用30 mL预热的生产培养基替换。收获前再孵育96小时。不建议进一步更换培养基以最大限度地提高产量。 从培养基中收获和纯化重组AAV6在不从培养皿中移开细胞的情况下，将所有细胞上清液收集到具有0.2μm PES膜的过滤单元中，该膜至少比要过滤的培养基体积大50%。然后，过滤上清液。注意：如果需要更高的rAAV6产量，则可以使用商业试剂盒或已建立的方案34，35收获细胞并从细胞沉淀中提取rAAV。由于AAV6主要分泌到培养基36中，因此仅使用上清液，从而减少了劳动力，成本和时间。 以收集体积的25%向过滤的上清液中加入5x PEG / NaCl溶液;如果使用四个 30 mL 的 15 cm 培养皿，则通常为 30 mL。 通过倒置充分混合，然后在4°C孵育过夜以沉淀病毒颗粒。注意：AAV 颗粒在此溶液中可稳定长达 2 天。 将装有250mL管插件的平移式桶离心机预冷至4°C。 通过在室温下用 2 mL 10% Pluronic F-68 预处理每个膜至少 1 小时，制备具有 100 kDa 截止值的 4 mL 离心过滤单元和 0.22 μm 亲水性 PES 注射器过滤器。 将AAV-PEG / NaCl混合物转移到250mL管中，在4°C下以2，500× g 离心1小时，然后通过抽吸小心地除去整个上清液。 通过在 4 mL 的 1 M HEPES 中涡旋，将米色重悬至白色病毒沉淀，直到完全重悬。如有必要，静置5分钟，然后再次涡旋。使用 5 mL 血清移液器重悬，并将总体积转移到 15 mL 管中。 在通风橱中，向病毒悬浮液中加入等体积的氯仿 – 通常为 4 mL。 剧烈涡旋2分钟，然后在室温下以1，000×g离心5分钟。 将顶层（含AAV的上清液）收集在新的50 mL管中，并丢弃底层（氯仿）。注意：含氯仿的溶液是危险废物。遵循机构准则进行处置。 将含AAV的上清液置于通风橱下，让剩余的氯仿蒸发30分钟。 同时，清洗预处理的离心过滤单元和注射器过滤器。 向预处理的离心过滤装置中加入 1.5 mL 配方缓冲液。在15°C下以3，500× g 离心10分钟，置于水平桶转子中。用 4 mL 配方缓冲液重复此步骤以洗涤膜。 使用 5 mL 注射器用 5 mL 配方缓冲液冲洗注射器过滤器两次。 将来自氯仿提取的~4 mL含AAV的上清液装入5 mL注射器中，连接洗涤后的注射器过滤器，并直接过滤到离心过滤单元中。 在15°C下以3，500× g 离心25分钟，然后确认过滤器中的AAV溶液在50-100μL之间。如果溶液体积为>100μL，请继续离心。 除去滤液后，在离心过滤单元的杯内加入4 mL配方缓冲液，并通过移液将溶液均匀混合。在15°C下以3，500× g 离心25分钟，然后确认过滤器中的AAV溶液在50-100μL之间。如果溶液体积为>100μL，请继续离心。重复此步骤进行另一次洗涤。 最终离心后，确认溶液体积为50-70μL;如果没有，请继续离心。将制剂转移到 1.5 mL 管中。如果需要，等分试样，并储存在-80°C。 通过qPCR测定重组AAV6滴度注意：qPCR引物在ITR区域退火，因此应适用于克隆到pAAV中的所有构建体。解冻待滴定的rAAV6等分试样和AAV6参考物质的等分试样。AAV6 参考物质应接近 4 x 1011 GC/mL;否则，请相应地调整稀释度。 将 2.0 μL 样品或 AAV6 参考物质与 15.6 μL 无核酸酶 H 2 O、2.0μL 10x DNase I 缓冲液和 0.4 μL DNA 酶 I 混合，进行 DNase I 酶解，以去除 rAAV6 制备中任何剩余的游离质粒 DNA。 轻轻混合并在37°C下孵育30分钟，然后转移到冰上。这是稀释度1（见 表3）。 用水制备所有样品和AAV6参考物质的五倍系列稀释液，如下 表3 所示。 准备SYBR绿色qPCR预混液。每孔将 4.7 μL 无核酸酶水与 10 μL SYBR Green 预混液、0.15 μL ITR 引物在 100 μM 下向前混合，在 100 μM 下反向混合 0.15 μL ITR 引物。注意：每个样品一式两份，参考标准品16孔，每个样品8孔，无模板对照2孔。多准备10%的预混液以解决移液错误。 在光学 96 孔或 384 孔反应板中，上样 15 μL/孔的 SYBR Green qPCR 预混液。 接下来，上样 5 μL 样品和 AAV6 参考物质或无核酸酶水用于无模板对照。对于AAV6参考标准，加载稀释液2至稀释液9。对于样品，上样稀释液5至稀释液8。一式两份测量每种稀释液。避免气泡。 用光学透明膜密封加载的板，在室温下以800× g 离心1分钟，然后用适当的96孔或384孔设置将板加载到qPCR仪器中。 使用SYBR检测设置并运行qPCR仪器，具有以下循环条件：98°C3分钟，然后40个98°C循环15秒和58°C30秒，然后是熔解曲线。 使用仪器软件分析数据，使用AAV6参考物质的基因组拷贝/毫米浓度（GC / mL）作为标准曲线（见 表3）。通过乘以稀释因子来计算样品的最终浓度。 确保标准曲线R2接近1.0，PCR效率为90%-110%，基线已去除，熔解曲线显示单个峰，C t值随稀释液变化，重复次数在0.5 Ct以内;否则，请排除异常值。预期收益率如图 2 所示。 2. 制备B细胞培养基和刺激物 准备解冻培养基：将RPMI-1640与20%食品接触物质混合。通过 0.2 μm PES 膜过滤单元进行无菌过滤。储存在4°C。 制备B细胞培养基：合并 表4中的试剂，然后通过0.2μm PES膜过滤单元进行无菌过滤。储存在4°C。 将 表5 中的每种B细胞兴奋剂以原液浓度重悬于B细胞培养基中，但CpG ODN除外，CpG ODN应重悬于无核酸酶水中。储存在-80°C。 如果进行非B细胞负耗竭（可选步骤4），则用2S（DPBS 2S）制备DPBS（无钙，无镁）。通过 0.2 μm PES 膜过滤单元进行无菌过滤。储存在4°C。 3. 恒河猴B细胞的制备与培养 注意：冷冻保存的恒河猴PBMC或脾细胞用于建立细胞培养物30，31。 在37°C水浴中预热解冻培养基和B细胞培养基。将 表5 中的B细胞兴奋剂在冰上解冻。 准备一个适当大小的管子，其中包含预热的解冻介质。理想情况下，这应该是解冻细胞体积的10倍以上。 在37°C水浴中一次解冻一到两个PBMC或脾细胞的冷冻管，并用预热的培养基倒入制备的管中。冲洗冷冻管以收集所有细胞。 在室温下以200× g 离心细胞10分钟。注意：这些离心设置可减少血小板污染，同时保持PBMC产量。可以使用更高的速度，例如 350 x g 5 分钟。 将细胞重悬于10 mL解冻培养基中进行洗涤。 重复步骤3.4和步骤3.5，共三次离心以除去冷冻介质。最后一次离心后，将细胞以估计的~5 x 106 个细胞/ mL重悬于B细胞培养基中。注意：上述方案培养整个PBMC或脾细胞制剂，并受到其他细胞的污染。如果需要更纯的B细胞培养物，尽管总B细胞产量显着降低，请继续步骤4。两种方法之间的编辑效率没有差异。 根据需要用 B 细胞培养基稀释 10 μL 细胞的等分试样进行计数。使用血细胞计数器和台盼蓝染色计数，将等体积的重悬细胞和台盼蓝0.4%溶液混合。 根据细胞计数，用B细胞培养基将细胞浓度调节至3 x 106 个细胞/ mL。然后，根据 表5将B细胞兴奋剂加入至其最终浓度，并混合。 将细胞转移到适当的细胞培养皿中。总体而言，建议使用 0.6 x 10 6-0.7 x 106 细胞/cm2。将细胞在37°C与5%CO2孵育48小时±2小时。 4. 非B细胞的可选负耗竭 注意：产量和纯度取决于PBMC中B细胞的输入百分比，在单个恒河猴27之间可能有很大差异。预计 80%-95% 纯度、60% 效率和 1 x 10 6-1.5 x 106 来自 1 x 107 PBMC 的 6 个电池。 最后一次洗涤（步骤3.6）后，将细胞重悬于DPBS 2S中的1 x 108 细胞/ mL和人Fc块1：200稀释。细胞计数基于解冻细胞的数量。 在冰上孵育15分钟以阻断Fc受体，然后加入 表6中的生物素化抗体。在冰上再孵育20分钟。 用DPBS 2S加满试管，并在4°C下以200× g 旋转10分钟。 将细胞重悬于DPBS 2S中，为步骤4.1体积的80%（即，每1 x 107 个细胞80μL）。 将磁性链霉亲和素珠以步骤4.1体积的20%添加到细胞悬液中（即，每1 x 107 个细胞20μL磁珠）。 将细胞在冰上孵育15分钟，并偶尔搅拌。 同时，每1 x 108 个细胞，制备具有大型磁力耗尽柱和预分离过滤器的磁选机。通过重力流用 2 mL DPBS 2% FCS 冲洗预分离过滤器和色谱柱，并丢弃流通物。安装 15 mL 收集管。注意：使用其他色谱柱（如正向选择柱或其他磁珠纯化系统）可能会大大降低纯度。 孵育后，如果体积为 <0.5 mL，则用 DPBS 2% FCS 将细胞加满至 0.5 mL。如果体积为 ≥0.5 mL，只需继续即可。 将细胞悬液装入制备柱上的预分离过滤器中，并将流出物收集到15 mL管中。 通过将 1 mL DPBS 2% FCS 加入预分离过滤器中，洗脱未结合的富集 B 细胞两次。通过重力流将未结合的细胞收集到同一管中。注意：额外的洗脱可能会略微提高产量。纯度和效率可以通过输入细胞、富集细胞和保留在色谱柱上的细胞的流式细胞术来评估。要获得保留在色谱柱上的细胞，请从磁体上取下色谱柱，并使用提供的柱塞用3 mL DPBS 2% FCS冲洗。如果需要，使用表7中的试剂通过流式细胞术评估纯度，如图3所示。 将富集的B细胞在4°C下以200× g 离心10分钟。 将细胞以估计的~5 x 106 个细胞/ mL重悬于B细胞培养基中，并继续步骤3.7。 5. 原代恒河猴B细胞基因编辑 激活恒河猴B细胞48小时±2小时后，准备用于电穿孔和转导的试剂。将DMSO、无核酸酶双链缓冲液、缓冲液T和缓冲液E（10 μL电穿孔试剂盒）或E2（100 μL电穿孔试剂盒）从电穿孔试剂盒预热至室温。 在冰上解冻 表5 中的rAAV6 HDRT和B细胞兴奋剂。 将 CRISPR-Cas9 sgRNA 重悬于 100 μM 的双链缓冲液中。在室温下复溶10分钟，并通过涡旋和轻弹混合。将重组的sgRNA放在冰上直到使用。储存在-80°C。注意：CRISPR-Cas9 sgRNA可以使用各种在线工具进行设计（见1.1.1），并且其切割效率可能会有很大差异。建议使用 TIDE37 或 ICE38 等测定方法对切割效率进行实证测试。 每 10 μL 电穿孔，用表 5 中的所有兴奋剂制备 550 μL B 细胞培养基，并加入 1% DMSO。将体积放大 10 倍，用于 100 μL 电穿孔。可选地，可以在没有抗生素 – 抗真菌剂的情况下制备10%的该培养基，这略微增加了转染后的细胞活力。 每 10 μL 电穿孔，准备一个 48 孔细胞培养板的孔，其中含有 50 μL 含有兴奋剂且不含抗生素 – 抗真菌剂的 B 细胞培养基（如果使用）。对于 100 μL 电穿孔，将 500 μL 移液到 6 孔板的孔中。 将rAAV6 HDRT添加到孔中的培养基中，最高可达孔中体积的20%。根据每次转染的细胞数（10 μL 电穿孔：5 x 105 个细胞;100 μL 电穿孔：5 x 10 6 个细胞）和 rAAV6 制备中的 GC，瞄准 1 x 105-1 x 10 6 的 MOI。建议使用5 x 1013 GC/mL至5 x 1014 GC/mL的高rAAV6储备浓度，以在低体积下实现高MOI。注意：较低的 MOI 可能会导致编辑效率降低，5 x 105 的 MOI 通常接近我们看到的最大编辑效率。尚未观察到不同MOI对B细胞活力的影响。建议包括不含rAAV6 HDRT、不进行RNP转染和不进行两者的对照。 通过将准备好的培养皿和剩余培养基转移到37°C的培养箱中，用5%CO2预热。 每 10 μL 电穿孔制备 1.15 μL 核糖核蛋白 （RNP）：在双链缓冲液中将 0.4 μL 61 μM Cas9 与 0.75 μL 100 μM sgRNA 混合。由于移液错误，请额外准备（建议单次电穿孔多准备30%），并避免在加载电穿孔吸头时产生气泡。100 μL 吸头的刻度 10 倍。 在与细胞混合之前，将RNP在室温下孵育至少15分钟。孵育后，如果要同时靶向多个位点，则可以组合多个RNP。同时使用多达三个位点时，没有观察到效率的显着差异。 同时，准备细胞进行电穿孔。始终将细胞保持在室温下，以避免温度冲击。培养48小时±2小时后将细胞收获到适当的容器中。用DPBS冲洗培养皿以收集最大数量的细胞。 在室温下以200× g 离心细胞10分钟。 弃去上清液，并以~2 x 106 个细胞/ mL将细胞重悬于DPBS中。 将 10 μL 台盼蓝 0.4% 溶液与 10 μL 细胞悬液混合，并使用血细胞计数器计数。注意：此时，由于收获和洗涤过程中的损失，预计约60%的细胞在48小时±2小时前放入培养中。 同时，在室温下以200× g 离心细胞10分钟。 弃去上清液，确保尽量减少任何剩余的DPBS。根据上述细胞计数，将细胞重悬于预热（RT）缓冲液T中，浓度为5.55 x 107 个细胞/mL。 通过打开机器并将其设置为1，350 V、15 ms和1脉冲来设置转染系统。将移液器站放在层流罩内 对于每组 10 次电穿孔，准备含有 3 mL 缓冲液 E（用于 10 μL 转染）或 E2（用于 100 μL 转染）的转染管。将试管插入移液器站。 每 10 μL 电穿孔，将 1.15 μL RNP 与 9 μL 细胞混合。确保有足够的体积（+30%），以避免将空气吸入电穿孔尖端。在电穿孔前在室温下孵育1-2分钟。 将 10 μL 或 100 μL RNP 和细胞混合物吸入电穿孔移液器上适当大小的电穿孔吸头中，将装载的移液器插入移液器站，然后开始电穿孔。确保吸头完全没有气泡，以防止电弧。在电穿孔过程中观察以验证没有发生电弧。 立即将电穿孔细胞喷射到48孔（10 μL转染）或6孔板（100 μL转染）内的制备的预热小体积培养基中，有或没有rAAV6。对剩余的样本重复步骤5.15-5.17。将对照样品不转染添加到培养孔中。 将细胞在37°C下用5%CO2 孵育4小时±2小时，然后加入含有兴奋剂，DMSO和抗生素/抗真菌剂的制备的预热B细胞培养基：450μL转染10μL转染或4.5mL转染100μL转染。 继续在37°C下用5%CO2 孵育12-24小时。然后，如果需要延长培养，将培养基更换为含有兴奋剂和不含DMSO的抗生素/抗真菌剂的B细胞培养基。基因组DNA的分析可以在24小时后进行。使用同源臂外的引物和插入片段内的引物进行数字微滴PCR可用于量化编辑效率39。进行PCR以扩增插入位点和Sanger测序以验证正确的编辑。 为了分析蛋白质水平，在电穿孔后将细胞培养40-48小时以允许蛋白质表达变化，并使用 表7中的试剂通过流式细胞术进行分析。