Larva Zebra Balıklarında Hedef Sinyalizasyon Yanıtlarının İzlenmesi - Z-REX Elektrofilik İlaçların ve Metabolitlerin Hassas Mekanizmalarının Maskesini Çıkarır

Cornell Üniversitesi’nde (Amerika Birleşik Devletleri) zebra balığı yetiştiriciliği ve elleçleme prosedürleri, Ulusal Sağlık Enstitüleri’nin (NIH) yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiş ve Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. İsviçre Federal Teknoloji Enstitüsü Lozan’ın (EPFL, İsviçre) zebra balığı birimindeki zebra balığı yetiştiriciliği ve elleçleme prosedürleri, kanton veterinerlik izni VD-H23 ile Hayvan Refahı Yasası SR 455 ve Hayvan Refahı Yönetmeliği SR 455.1’e göre gerçekleştirilmiştir. NOT: Bu protokolde, Halo-TeV-Keap1’i ifade eden Tg (lyz:TagRFP ) ve Tg(mpeg1:EGFP) balık çizgileri Z-REX’i göstermek için kullanılır. Yöntem, ilgilenilen diğer proteinlere, transgenik muhabir balık hatlarına ve aşağı akış biyolojik tahlillerine genişletilebilir. Bu çalışmada kullanılan tamponlar için Ek Tablo 1’e bakınız. Tüm reaktifler, aletler, ekipmanlar, antikorlar, plazmidler, zebra balığı suşları ve ekipmanları Malzeme Tablosunda listelenmiştir. 1. mRNA hazırlığı mMessage mMachine SP6 in vitro transkripsiyon kitini kullanarak Halo-TeV-Keap1-2xHA ve Halo-2xHA-P2A-Keap1-2xHA mRNA’yı hazırlayın.NOT: Üreticinin talimatlarını izleyin ve her mRNA için 40 μL ölçekli reaksiyonlar gerçekleştirin. mRNA peletini 10 μL nükleaz içermeyen suda yeniden çözün. mRNA kalitesini değerlendirin ve konsantrasyonu mikrohacim spektrofotometresi ve agaroz jel elektroforezi ile ölçün. İyi kalitede bir mRNA,2.0 civarında veya üzerinde bir A260 / A 280 oranına sahip olmalıdır. mRNA’yı nükleaz içermeyen su ile 1-1.5 mg / mL’ye seyreltin. mRNA çözeltisini (tüp başına 1-2 μL) aliquot edin ve aliquotları -80 ° C’de saklayın. 2. Balık embriyolarının üretilmesi Seçenek 1: Vahşi tip (WT) balık embriyolarının üretilmesi.10 ayrı tankta 10 balık geçiş çifti kurun, her tank erkek ve dişi ebeveyn balıklar arasında bir bölücü içerir.NOT: Toplam 10 çapraz çift tipik olarak tahliller için yeterli sayıda embriyo sağlar. Geçiş çiftlerinin sayısı, deney tasarımına / ihtiyacına ve ana balığın doğurganlığına göre ayarlanabilir. Ertesi sabah, enjektörü kurduktan sonra, tankların beşindeki bölücüleri çıkarın. Balıkların çiftleşmesi için 30 dakika bekleyin. Ana balığı başka bir tanka taşıyın, tank suyunu bir süzgeçten geçirerek embriyoları toplayın ve ardından embriyoları süzgeçten 10 cm’lik bir Petri kabına durulayın. Bu embriyolar enjeksiyonların ilk turu için kullanılacaktır.NOT: Belirli bir partideki yumurta kalitesi zayıfsa (örneğin, proteinlerin toplanması nedeniyle yumurtalar opaktır), bunları diğer embriyolarla bir araya getirmeyin. (İsteğe bağlı) Bir sonraki enjeksiyon turu için diğer beş tankta 2.1.2-2.1.3 adımlarında açıklandığı gibi benzer prosedürleri uygulayın.NOT: Embriyolar arasındaki yaş farkını en aza indirmek için sadece bir tur enjeksiyon yapmak en iyisidir. Bununla birlikte, bir partide enjekte edilebilenden daha fazla embriyo gerekiyorsa, embriyoların mRNA enjeksiyonu sırasında 1-4 hücreli bir aşamada kalmasını sağlamak için iki tur enjeksiyon yapılması önerilir. Enjeksiyon turlarının sayısı, operatörün enjeksiyon becerisine ve deney tasarımına göre ayarlanabilir. Bununla birlikte, tüm prosedürün (ilk bölücünün çıkarılmasından son embriyonun enjeksiyonuna kadar) 2 saat içinde yapılması önerilir. Embriyolar arasındaki büyük yaş farkı, deney sonuçlarının güvenilirliğini ve tekrarlanabilirliğini bozabilir. Seçenek 2: Heterozigot transgenik nötrofil / makrofaj muhabiri balık embriyolarının üretilmesi.10 ayrı tankta 10 balık geçiş çifti ayarlayın, her tank erkek ve dişi ebeveyn balıklar arasında bir bölücü ile yerleştirilir: WT balığına karşı Tg ( lyz: TagRFP) veya WT balıklarına karşı Tg (mpeg1: eGFP).NOT: Homozigot muhabir balıklar heterozigot balıklara kıyasla daha yüksek floresan sinyali gösterdiğinden, aşağı akış floresan okumalarını etkileyebilecek heterozigot transgenik balıklar arasındaki geçişlerden kaçının. Transgenik muhabir çizgileri ve WT embriyoları görüntüleme sırasında kolayca ayırt edilebilir. WT ve heterozigot embriyoların aynı havuzda karışımının olması sorun değildir. lyz: TagRFP nötrofilleri bildirir ve mpeg: eGFP makrofajları bildirir. Bu protokol diğer muhabir balık hatlarına da uygulanabilir. 2.1.2-2.1.4 adımlarını izleyin. 3. Mikroenjektör kurulumu Hava kaynağını açın, geri basıncı 0.2-0.5 psi’ye ayarlayın ve enjeksiyon basıncını 25-30 psi’ye ayarlayın. Gösterilen spesifik basınç aralığı tipik olarak tavsiye edilir.NOT: Balık ortamının iğneye geri akışını önlemek için sabit bir geri basınca sahip olmak önemlidir. Adım 3.8’de enjeksiyon hacmini kalibre ederken, sadece enjeksiyon süresi değiştirilmelidir. Aşağıdaki adımlarda enjeksiyon basıncını değiştirmeyin; Düşük enjeksiyon basıncı, yüzey ve ara yüzey gerginliği nedeniyle enjeksiyon başarısızlığına neden olabilirken, yüksek enjeksiyon basıncı embriyolara zarar verebilir. Ekipmanı ve enjeksiyon platformunu RNase dekontaminasyon çözeltisi ile temizleyin.NOT: mRNA’yı bozan RNase, operatörden veya ekipmandan gelebilir. Deneyden önce temizliği yapmak ve eldiven giymek gerekir. (İsteğe bağlı) mRNA ve morfolinoyu birlikte enjekte ediyorsanız, ikisini 0.2 mL’lik bir tüpte önceden karıştırın.NOT: Z-REX, 250-1500 ng / μL konsantrasyonda Halo-TeV-Keap1-2xHA mRNA çözeltisini kullanarak iyi çalışır. Zebra balıklarında çeşitli morfolinolar da kullanılmıştır ve optimal konsantrasyonlarbildirilmiştir 7. Yayınlanmamış bir diziye sahip bir morfolino kullanılıyorsa, operatör önce Z-REX’te kullanmadan önce morfolino’nun toksisitesini ve gen yıkma verimliliğini değerlendirmelidir. 1-2 μL mRNA’yı (ve/veya uygulanabilir olduğunda morfolinoyu7) mikro yükleyici pipet ucu olan bir enjeksiyon iğnesine aktarın.NOT: Alevli/Kahverengi mikropipet çektirici ile iğne hazırlanıyorsa, kurulum aşağıdaki gibidir. Isı: 520 adet; çekme mukavemeti: 60 adet; hız: 70 birim; gecikme: 155 birim; basınç: 550 birim; rampa: 530 adet. İğneyi mikroenjeksiyon manipülatörüne takın.NOT: Hava kaynağından gelen geri basınç, mRNA (/ morfolino) çözeltisini iğne ucuna itmelidir. İğne ucunu kırmak için keskin forseps veya tıraş bıçağı kullanın ve enjeksiyon için uygun bir açıklık oluşturun. İğne ucunu bir sahne mikrometresinde mineral yağa batırın. Uçtaki hava kabarcıklarını gidermek için iki veya üç enjeksiyon darbesi uygulayın. Enjeksiyon süresini değiştirerek damla boyutunu 2 nL’ye kalibre edin.NOT: Bu en iyi şekilde, bir hemositometre üzerine serilmiş mineral yağa (yumurta sarısı kesesinin viskozitesini taklit eden) enjekte edilerek gerçekleştirilir. Bir mikroskop kullanarak, enjeksiyon sırasında oluşan damlacığın boyutunu tahmin etmek için hemositometrenin kılavuz çizgilerini kullanın ve enjeksiyon süresini buna göre ayarlayın. Fenol kırmızısı boya bazen kullanılsa da, burada tarif edilen mRNA enjeksiyon prosedüründe buna duyulan ihtiyaç gözlenmemiştir. 4. Mikroenjeksiyon Bir enjeksiyon plakasını taze% 10 Hank’in dengeli tuz çözeltisi (HBSS) ortamı ile doldurun ve embriyoları plakanın oluklarında künt forsepslerle hizalayın.NOT: Enjeksiyon plakası HBSS ortamında %2 agaroz ile hazırlanır; Oluklar plastik bir kalıp kullanılarak oluşturulur. İğne ucunu enjeksiyon plakasında% 10 HBSS ortamına batırın. Uçtaki hava kabarcıklarını gidermek için iki veya üç enjeksiyon darbesi uygulayın. Her enjeksiyon için, koryon ve yumurta sarısı kesesine tek bir hareketle nüfuz edin ve bir enjeksiyon darbesi uygulayın. Bu enjekte edilen sıvı, enjeksiyondan hemen sonra yumurta sarısı kesesi içinde küçük bir sferoid olarak görülebilir. Bu küçük küre nispeten hızlı bir şekilde dağılır. Yeterli sayıda enjekte edilen embriyo elde edilene kadar bu adımı diğer embriyolar için tekrarlayın.NOT: Embriyoların hayatta kalma oranı (hem enjekte edilen hem de enjekte edilmeyen) tipik olarak% 50 -% 90 arasında değişmektedir. Her kontrol/deney grubu için gereken embriyo sayısının iki katını enjekte etmeyi hedefleyin. Biyotin aşağı çekme tahlilinde, her durum için 100-140 canlı embriyo gereklidir. qRT-PCR tahlilinde, her durum için beş canlı embriyo önerilir. Canlı balık görüntüleme ve tüm montajlı immünofloresan boyama testi için numune büyüklüğü kullanıcı tarafından tanımlanmıştır; Analizde iyi istatistiksel güç sağlamak için koşul başına en az 20 canlı embriyoya sahip olunması önerilir. Enjekte edilen embriyoları, taze% 10 HBSS ortamı içeren yeni bir 10 cm’lik Petri kabına durulayın.NOT: Embriyolar bir fışkırtma şişesi kullanılarak oluklardan kolayca durulanabilir. Enjekte edilmeyen embriyoları başka bir plakada toplayın.NOT: Enjekte edilmeyen embriyolar, gerektiğinde balığın sağlığı, temel protein ekspresyonu, arka plan floresan seviyeleri vb. İçin kalite kontrolleri olarak hizmet edebilir. Enjeksiyon prosedürü iyi çalıştıysa ve enjekte edilen mRNA / morfolino embriyolar için ölümcül değilse, enjekte edilen ve enjekte edilmeyen embriyolar benzer canlılığa sahip olmalıdır. 5. Z-REX Enjekte edilen embriyoları, deney kurulumuna göre 10 cm’lik tabaklara dağıtın (yani, kontrol / deney gruplarının sayısı). Kırmızı ışık aydınlatmalı karanlık bir odada, ortamı 1 μM Ht-PreHNE (alkin) olsun veya olmasın 30 mL% 10 HBSS ile değiştirin.NOT: Ht-PreHNE (alkin) hafif kararsız bir bileşiktir. Aşağıdaki adımlarda embriyolar karanlıkta tutulmalıdır. Embriyoları karanlıkta 28.5 ° C’de inkübe edin. 30,5 hpf’de, karanlık bir odada, medyayı yeni bir 30 mL% 10 HBSS ile değiştirin.NOT: Ortamı değiştirirken, eski ortamın mümkün olduğunca çoğunu çıkarın. Bu, embriyolardan bağlanmamış / fazla miktarda Ht-PreHNE (alkin) çıkarmak için kritik öneme sahiptir. Embriyoları karanlıkta 28.5 ° C’de 30 dakika boyunca inkübe edin. 5.4-5.5 arasındaki adımları iki kez daha yineleyin. Lambayı önceden ısıtmak için UV lambasını (365 nm, 3 mW/cm2) 5 dakika boyunca açın.NOT: Lamba ön ısıtma adımı, adım 5.8’den önce gerçekleştirilmelidir. Lamba gücü, açıldıktan sonraki ilk birkaç dakika içinde daha düşük/kararsızdır. Lamba gücü düzenli olarak bir UV metre ile ölçülmelidir. 32 hpf’de, embriyoları UV ışığına maruz bırakın.Seçenek 1: Canlı balık görüntüleme, tam montajlı immünofloresan boyama, jel içi floresan analizi (Cy5 azid ile tıklama bağlantısı), RNA-seq veya qRT-PCR gibi aşağı akış okumaları için, embriyoları 3 dakika boyunca UV ışığına maruz bırakın ve plakaları her 30 saniyede bir döndürün. Seçenek 2: Biyotin aşağı çekme testi gibi aşağı akış okumaları için, embriyoları en fazla 5 dakika (ve en az 3 dakika) boyunca UV ışığına maruz bırakın, plakaları her 30 saniyede bir döndürün ve plakaları buz üzerinde 1 dakika soğutun.NOT: Farklı problar kullanılıyorsa, ışığa maruz kalma süresinin, belirli bir fotokaged elektrofil probu ve konuşlandırılan ışık kaynağı için fotouncaging’in t1/2’sine bağlı olarak optimize edilmesi gerekir. t1/2fotouncaging bilinen prosedürler kullanılarak belirlenebilir8. Ht-PreHNE (alkin) için t1/2 < 1 dakika3’tür; Bu nedenle, yukarıda belirtilen süre yeterlidir. 6. Aşağı akış tahlilleri Seçenek 1: Fenotipik tahlil. Transgenik nötrofil/makrofaj muhabirinin canlı görüntülenmesibalık hatları, Tg( lyz:TagRFP ) ve Tg(mpeg1:eGFP ) (Şekil 2)Embriyoları 4 °C’de 10 dakika boyunca inkübasyona tabi tutarak uyuşturun.NOT: Koşul başına en az 20 canlı embriyoya sahip olunması önerilir. Döllenmemiş/ölü embriyoları plakadan çıkarın.NOT: Döllenmemiş/ölü embriyolar bulutlu/saydam değildir ve görsel olarak tanımlanabilir. Yüksek bir ölüm oranı görülürse, enjeksiyon prosedürüne geri dönün veya mRNA veya morfolino konsantrasyonunu azaltmaya çalışın. Embriyoları keskin forsepslerle dekoryonlayın. Koryonu larva balıklarına dokunmadan bir çift forseps ile tutun ve koryonu sökmek için diğer forseps çiftini kullanın. Embriyo kırılgandır. Sadece dekoryon yaparken koryona dokunun.NOT: Özellikle yeni başlayanlarda, dekoryonasyon sırasında bazı embriyolara zarar vermek yaygındır. Bu nedenle, her zaman gereken minimumdan daha fazla embriyoya sahip olun. Embriyoları %2’lik bir agaroz plakasına ( HBSS ortamı ile hazırlanmış) monte edin ve embriyoları stereomikroskopla (parlak alan ve ilgili floresan kanallar) görüntüleyin (Şekil 2A, C, G).NOT: Z-REX [Halo-TeV-Keap1-2xHA mRNA enjeksiyonu ve Ht-PreHNE (alkin) tedavisinin kombinasyonu] sonrasında, nötrofillerin tükenmesi (lyz: TagRFP) 36 hpf’de (Z-REX’den 4 saat sonra) en anlamlı bulunurken, makrofajların azalması (mpeg1: eGFP) 34 hpf’de (Z-REX’den 2 saat sonra) en anlamlı bulunmuştur (Şekil 2E, F). Farklı muhabir çizgileri, mRNA / morfolino veya problar kullanılıyorsa diğer zaman noktaları kullanılabilir. Maruz kalma süresi ve / veya kazancı, tek hücreleri veya istenen spesifik (ultra) yapıları görselleştirmek için optimize edilmelidir. Her balığın nötrofil/makrofaj sayısını ImageJ (NIH) ile sayın (Şekil 2B, D-F, H). Tüm balığın etrafında dönmek için ImageJ’deki Serbest Seçim aracını kullanın ve floresan hücreleri saymak için Find Maxima seçeneğini kullanın. 2. Seçenek: Hedef etiketleme değerlendirmesi. Biotin azid tıklama kuplajı ve biyotin pull-down testi (Şekil 3)Embriyoları 4 °C’de inkübasyonla uyuşturun. Bu genellikle 10 dakika sürer.NOT: Yeterli balık lizatı elde etmek için, her durum için 100-140 canlı embriyo gereklidir. Döllenmemiş/ölü embriyoları plakadan çıkarın. Dekoryonasyon ve deyolking yapın. Koryonu bir çift keskin forseps ile tutarak, yumurta sarısı kesesine nüfuz etmek için diğer forseps çiftini kullanarak ve daha sonra yumurta sarısı proteinlerinin dışarı çıkmasına izin vermek için koryonu çıkarırken yumurta sarısı kesesini ayırarak iki manipülasyonu gerçekleştirin.NOT: Bu adımda yumurta sarısı proteinlerinin çıkarılması çok önemlidir. Numunedeki bol miktarda yumurta sarısı proteinleri daha sonraki analizlere müdahale eder. Deyolklanmış embriyoları 1.5 mL’lik bir tüpe aktarın.NOT: Yumurta sarısı çıkarılmış embriyoları ortalamak için plakayı döndürün, bu da toplanmasını kolaylaştırır. Daha hafif koryon kalıntıları bu işlem sırasında kazanır. Embriyolar tüp tabanına yerleştikten sonra, süpernatanı çıkarın ve 1 mL soğutulmuş HEPS tamponlu salin (pH 7.6) ekleyin. Adım 6.2.5’i iki kez daha yineleyin. (İsteğe bağlı) Bir sonraki adıma hemen geçmek istemiyorsanız, arabelleği çıkarın, numuneleri sıvı azotta dondurun ve -80 ° C’de saklayın.NOT: Sarısı çıkarılmış balık peletleri sıvı azotta flaş dondurulabilir ve -80 °C’de saklanabilir. Flaş dondurulmuş numuneler -80 °C’de 2 haftaya kadar saklanabilir. Balık topaklarını lizis tamponunda tekrar askıya alın.NOT: Lizis tamponu (pH 7.6), soya fasulyesinden 50 mM HEPES, 100 mM NaCl, %1 Triton X-100, 0.3 mM TCEP, 2x Roche cOmplete Mini EDTA içermeyen proteaz inhibitörleri ve 0.1 mg/mL tripsin inhibitöründen oluşur. Bir embriyo yaklaşık 2 μg lizat verir. Her 120 embriyo için 100 μL lizis tamponu kullanın. İki Roche cOmplete Mini EDTA içermeyen proteaz inhibitörü ve soya fasulyesinden tripsin inhibitörleri, kullanımdan hemen önce lizis tamponuna eklenmelidir. Tüpe v/v zirkonya boncuk ekleyin. 20 sn boyunca vorteks, sıvı azotta flaş donma ve 37 ° C’lik bir su banyosunda çözülme. Adım 6.2.10’u iki kez daha yineleyin. Çözeltiyi 21.000 x g’de 4 °C’de 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı yeni, önceden soğutulmuş 1,5 mL’lik bir tüpe aktarın. Bradford testi ile protein konsantrasyonunu ölçün. Lizatı 1 mg / mL’ye seyreltin. Her koşul için, 170 μg lizatı 2 mL’lik bir tüpe aktarın. Lizatı adım 6.2.16’dan itibaren 0.2 mg / mL TeV proteaz (S219V) ile karıştırın ve çözeltiyi 30 dakika boyunca 37 ° C’de inkübe edin.NOT: TeV proteaz ile muamele edilmeyen gruplar için, lizatı diğer gruplarda kullanılan TeV proteaz çözeltisine eşit bir lizis tamponu voloumu ile karıştırmanız yeterlidir. Biotin-azide tıklama reaksiyonu için 10x ana karışım hazırlayın: SDS ile , 10 mM CuSO4, 1 mM Cu(TBTA), 1 mM biyotin-azid ve 20 mM TCEP.NOT: Adım 6.2.19’dan hemen önce karışıma TCEP ekleyin. Adım 6.2.17’den itibaren (TeV proteazla sindirilmiş) lizata 8,5 μL t-BuOH ve 17 μL 10x tıklama reaksiyonu ana karışımı ekleyin. Vorteks, santrifüj ve çözeltiyi 37 ° C’de 15 dakika boyunca inkübe edin. Çözeltiye 1 mM TCEP daha ekleyin ve ardından vorteks, santrifüj yapın ve çözeltiyi 37 ° C’de 15 dakika daha inkübe edin. 6.2.19-6.2.20 adımları için kuluçka süresi toplamda 30 dakikadır.NOT: Cu(I) üretmek için indirgeyici bir reaktif olan TCEP’in bu eki, tıklama reaksiyonu verimliliğini artırır. Her tüpe 600 μL -20 °C etanol ekleyin, çözeltiyi vorteksleyin ve gece boyunca -80 ° C’de inkübe edin.NOT: Numuneler -80 °C’de 1 hafta saklanabilir; Değilse, hemen bir sonraki adıma geçin. Çözeltiyi 21.000 x g’de 4 °C’de 1 saat boyunca santrifüj edin.NOT: Santrifüj işleminden sonra tüpün dibinde istenen fraksiyon olan bir pelet oluşmalıdır. Süpernatanı çıkarın, 1 mL -20 °C etanol, vorteks ekleyin ve çözeltiyi 10 dakika boyunca 4 ° C’de 21.000 x g’de santrifüj edin. Adım 6.2.23’ü yineleyin. Süpernatanı çıkarın, 1 mL -20 °C aseton, vorteks ekleyin ve çözeltiyi 10 dakika boyunca 4 ° C’de 21.000 x g’de santrifüj edin. Supernatan’ı çıkarın. Aşırı kalıntı asetonun buharlaşmasına izin verin, ancak tamamen kuruluğa değil. Peletin 100 μL resüspansiyon tamponunda (% 8 w / v lityum dodesil sülfat [LDS], 50 mM HEPES salininde 1 mM EDTA, pH 7.6), 15 s vorteks içinde tekrar askıya alın ve pelet çözülene kadar sonikleştirin. Çözeltiyi oda sıcaklığında (RT) 21.000 x g’de 5 dakika boyunca santrifüj edin. Süpernatantı yeni bir 2 mL tüpe aktarın ve 1.5 mL 50 mM HEPES salin, pH 7.6 ekleyin.NOT: Bu adımdaki son LDS konsantrasyonu% 0.5’tir. Daha yüksek LDS konsantrasyonları, aşağı çekme verimliliğini zayıflatabilir. Bu nedenle, LDS konsantrasyonunun arttırılması, spesifik olmayan bağlanmanın azaltılmasına yardımcı olsa da, aşağı çekmenin verimliliğini de azaltabilir. Buna göre, bu adımda LDS konsantrasyonunun değiştirilmemesi önerilir. “Giriş” örneğini toplayın (Şekil 3): 30 μL 1 mg/mL lizatı yeni bir 1,5 mL tüpe aktarın ve %6 β-Merkaptoetanol (BME) içeren 10 μL 4x Laemmli numune tamponu ekleyin. Flaş çözeltiyi dondurur ve -80 ° C’de saklar. 100 μL yatak hacimli streptavidin yüksek kapasiteli reçineyi yeni bir 2 mL tüpe aktarın. 50 mM HEPES salinine (pH 7.6) 1 mL% 0.5 LDS ekleyin, RT’de 1.500 x g’de 2 dakika boyunca santrifüj yapın ve süpernatanı çıkarın. Yıkamayı, 50 mM HEPES salin (pH 7.6) içinde 1 mL% 0.5 LDS ile tekrarlayın. Çözeltiyi adım 6.2.29’dan adım 6.2.31’den önceden yıkanmış streptavidin yüksek kapasiteli reçine içeren tüpe aktarın ve çözeltiyi RT’de uçtan uca bir karıştırıcı üzerinde 4-6 saat boyunca inkübe edin. Karışımı RT’de 1.500 x g’de 2 dakika boyunca santrifüj edin, 30 μL süpernatan alın ve “akış” numunesi için% 6 BME içeren 10 μL 4x Laemmli numune tamponu ile karıştırın. Ardından, kalan süpernatanı çıkarın.NOT: “Flowthrough” numuneleri, streptavidin aşağı çekme verimliliğini kontrol etmek için batı lekeleme ile analiz edilebilir. Bağlanmamış proteinleri yıkamak için süpernatantın mümkün olduğunca çoğunu çıkarmak esastır. İlk olarak, bir P-1000 pipet kullanarak süpernatantın çoğunu çıkarın ve ardından jel yükleme ucu olan bir P-20 pipet kullanarak kalan süpernatantı çıkarın. Reçineye 50 mM HEPES salin (pH 7.6) içinde 1 mL% 0.5 LDS ekleyin ve karışımı RT’de uçtan uca rotasyonla 30 dakika boyunca inkübe edin. Karışımı RT’de 1.500 x g’de 2 dakika boyunca santrifüj edin ve süpernatanı çıkarın.NOT: Tipik olarak, spesifik olmayan bağlayıcı proteinlerin çoğunu çıkarmak için% 0.5 LDS yeterlidir. Daha sonraki analizlerde spesifik olmayan bağlanma sinyalleri hala görülüyorsa, yıkama tamponundaki LDS konsantrasyonu arttırılabilir. Adım 6.2.34-6.2.35’i iki kez daha yineleyin. Reçineye %6 BME içeren 40 μL 2x Laemmli numune tamponu ekleyin. Karışımı 98 ° C’de 5 dakika boyunca inkübe ederek bağlı proteinleri boşaltın. Karışımı RT’de 21.000 x g’de 5 dakika boyunca santrifüj edin ve süpernatantı yeni bir 1,5 mL tüpe aktarın. Bu “elute” örneğidir.NOT: Adım 6.2.38’den itibaren reçine içeren çözeltinin doğrudan jele yüklenmesi SDS-PAGE analizini etkileyebilir. 10 şeritli% 10 poliakrilamid jelin her bir kuyucuğuna 20 μL yükleyin ve jel elektroforezi çalıştırın.NOT: Boya cephesi çözme jeline ulaşana kadar jeli daha düşük bir voltajda (120 V) çalıştırın ve voltajı 170 V olarak değiştirin. Anti-HA, anti-Halo veya temizlik proteinlerini tespit eden diğer antikorlarla batı lekelemesi yapın (Şekil 3). Seçenek 3: Transkriptomik analiz. RNA-seq ve qRT-PCR (Şekil 4)NOT: Bu tahlil için birbirinden 15 dakika arayla atılan embriyoların kullanılması şiddetle tavsiye edilir. Embriyoların yaş farkı tahlil sonuçlarını önemli ölçüde etkilemektedir.Embriyoları Z-REX’ten 2 saat sonra 10 dakika boyunca 4 ° C’de inkübe ederek anestezi altına alın. Keskin forseps ile dekoryonasyon yapın (adım 6.1.3). (İsteğe bağlı) Farklı segmentler ayrı ayrı analiz edilecekse, forseps ile segmentasyon yapın (örneğin, kafayı kuyruktan ayırın). RNA’yı bütün bir embriyodan çıkarıyorsanız, üç ila beş embriyoyu 1.5 mL’lik bir tüpe aktarın. RNA’yı kafadan veya kuyruktan çıkarıyorsanız, 10-12 disseke segmenti 1.5 mL’lik bir tüpe aktarın.NOT: Deneyin üç ila beş biyolojik replika ile yapılması önerilir. Tüpe 1 mL TRIzol reaktifi ve cam boncuklar ekleyin.NOT: Cam boncukların RNA ekstraksiyonu için zirkonya boncuklarından daha iyi çalıştığı bulunmuştur. Karışımı 30 s boyunca vorteks.NOT: Bir sonraki adıma hemen geçilmezse, çözelti -80 ° C’de 1-3 hafta boyunca saklanabilir. RNA’yı üreticinin talimatlarına göre çıkarın. RNA kalitesini ve konsantrasyonunu mikrohacim spektrofotometresi ve agaroz jel elektroforezi ile değerlendirin.NOT: İyi kalitede RNA,2.0 civarında veya üzerinde bir A260 / A 280 oranına sahip olmalıdır. RNA’yı dizileme için gönderin veya 1 μg RNA’yı amplifikasyon dereceli DNaz I ile tedavi edin ve üst simge III ters transkriptaz ve oligo-(dT)20 kullanarak ters transkripsiyon yapın. Bu adımı üreticinin talimatlarına göre gerçekleştirin. qRT-PCR gerçekleştirin ve verileri ΔΔCT yöntemi9 ile analiz edin (Şekil 4B-D). Seçenek 4: POI ekspresyonu ve kolokalizasyon analizi. Tam montajlı immünofloresan boyama testi (Şekil 5)NOT: Formaldehit ile sabitlenmiş embriyolar kırılgandır. Güçlü sallamalardan kaçının ve dikkatli kullanın.6.1.1-6.1.3 adımlarını izleyerek embriyoları dekoryonlayın. Embriyoları 1.5 mL’lik bir tüpe aktarın.NOT: Her tüpün eşit sayıda embriyosu olmalı ve 40’tan fazla embriyo olmamalıdır. Embriyolar tüpün dibine yerleştikten sonra, süpernatanı çıkarın ve 1 mL fosfat tamponlu salin (PBS) (pH 7.6) ekleyin. Adım 6.4.3’ü bir kez daha yineleyin. Süpernatanı çıkarın, PBS’ye (pH 7.6) 1 mL% 4 formaldehit ekleyin ve tüpü gece boyunca 4 ° C’de hafif sallanma ile inkübe edin.NOT: Formaldehit çözeltisi içindeki numuneler 1 hafta boyunca 4 °C’de saklanabilir. Süpernatanı çıkarın, 1 mL -20 °C metanol ekleyin ve tüpü en az 18 saat boyunca -20 ° C’de yan tarafında inkübe edin.NOT: Numuneler -20 °C’de 1 ay veya daha uzun süre saklanabilir. Süpernatanı çıkarın ve PBS tamponuna 1 mL PDT tamponu ekleyin (PBS tamponuna %0,3 v/v Triton X-100, %0,1 v/v Tween-20 ve %1 v/v dimetil sülfoksit [DMSO]). Adım 6.4.7’yi tekrarlayın ve tüpü RT’de 30 dakika boyunca hafifçe sallayarak inkübe edin. Süpernatanı çıkarın, 1 mL bloke edici tampon ekleyin (% 10 v / v ısı ile inaktive edilmiş fetal sığır serumu [FBS], % 2 w / v sığır serum albümini [BSA] ve% 0.1 v / v Tween-20 PBS tamponu) ekleyin ve tüpü RT’de 1 saat boyunca hafif sallanma ile inkübe edin. Süpernatanı çıkarın ve 200 μL birincil antikor çözeltisi ekleyin (bloke edici tamponda seyreltilmiş). Süpernatanı çıkarın, 500 μL birincil antikor çözeltisi ekleyin (bloke edici tamponda seyreltilmiş) ve tüpü gece boyunca 4 ° C’de hafif sallanma ile inkübe edin.NOT: Yeni bir primer antikor kullanılıyorsa, negatif kontroller olarak hizmet etmek için primer antikor boyaması olmayan bazı örnekleri dahil etmeye değer. Bununla birlikte, ideal olarak, morfolino-nakavt veya mühendislik gen nakavt embriyoları veya hedef proteinin ekspresyonunun uyarıldığı embriyolar, antikoru doğrulamak için daha güvenilir araçlardır. Süpernatanı çıkarın, 1 mL PDT tamponu ekleyin ve tüpü RT’de 30 dakika boyunca hafifçe sallayarak inkübe edin. Adım 6.4.12’yi yineleyin. Süpernatanı çıkarın, 1 mL bloke edici tampon ekleyin ve tüpü RT’de 1 saat boyunca hafifçe sallayarak inkübe edin.NOT: İkincil antikor üzerinde konjuge edilen floroforun fotobeyazlamasını önlemek için numuneler bu adımdan sonra ışıktan korunmalıdır. Süpernatanı çıkarın ve 200 μL ikincil antikor çözeltisi ekleyin (bloke edici tamponda seyreltilmiş). Süpernatanı çıkarın, 500 μL ikincil antikor çözeltisi ekleyin (bloke edici tamponda seyreltilmiş) ve tüpü RT’de 1.5 saat boyunca hafifçe sallayarak inkübe edin. Süpernatanı çıkarın, 1 mL PDT tamponu ekleyin ve tüpü RT’de 30 dakika boyunca hafifçe sallayarak inkübe edin. Adım 6.4.17’yi yineleyin. Embriyoları %2’lik bir agaroz plakasına (PBS, pH 7.6 ile yapılmış) monte edin ve embriyoları stereomikroskopla (parlak alan ve ilgili floresan kanallar) görüntüleyin (Şekil 5A, B, D, F).NOT: Leica M165 FC floresan stereomikroskop kullanıyorsanız, iyi çözünürlükte görüntüler elde etmek için 25x büyütme kullanın. ImageJ (NIH) ile floresan sinyal yoğunluğunu ölçün/analiz edin. İlgilenilen bölgedeki sinyali ölçmek için ImageJ’deki Serbest Seçim aracını kullanın.