인간 만능 줄기세포를 인슐린 생산 섬 클러스터로 분화(Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Insulin-producing Islet Clusters)
Summary
줄기세포를 섬세포로 분화하는 것은 기존의 당뇨병 치료 및 질병 모델링에 대한 대안을 제공합니다. 상용 분화 키트와 이전에 검증된 방법을 결합하여 접시에서 인슐린 분비, 줄기 세포 유래 섬을 생성하는 데 도움이 되는 자세한 줄기 세포 배양 프로토콜에 대해 설명합니다.
Abstract
인간 만능줄기세포(hPSC)를 인슐린 분비 베타세포로 분화하면 베타세포 기능 및 당뇨병 치료를 조사할 수 있는 자료가 됩니다. 그러나 인간 베타 세포를 적절하게 모방한 줄기 세포 유래 베타 세포를 얻는 데는 여전히 어려움이 있습니다. 이전 연구를 기반으로 hPSC 유래 섬세포를 생성하여 분화 결과와 일관성이 개선된 프로토콜을 만들었습니다. 여기에 설명된 프로토콜은 1-4단계에서 췌장 전구 키트를 활용한 후 5-7단계에서 2014년에 이전에 발표된 논문에서 수정된 프로토콜(이하 “R-프로토콜”이라고 함)을 사용합니다. 췌장 전구 세포 키트와 400μm 직경의 마이크로웰 플레이트를 사용하여 췌장 전구 세포 클러스터를 생성하는 자세한 절차, 96웰 정적 현탁액 형식의 내분비 분화를 위한 R-프로토콜, hPSC 유래 섬의 체외 특성 분석 및 기능 평가가 포함되어 있습니다. 전체 프로토콜은 초기 hPSC 확장에 1주일이 소요되고 인슐린 생산 hPSC 섬을 얻는 데 ~5주가 소요됩니다. 기본적인 줄기 세포 배양 기술과 생물학적 분석 교육을 받은 직원은 이 프로토콜을 재현할 수 있습니다.
Introduction
췌장 베타 세포는 혈당 수치 상승에 반응하여 인슐린을 분비합니다. 제1형 당뇨병(T1D)1에서 베타세포의 자가면역 파괴로 인해, 또는 제2형 당뇨병(T2D)2에서 베타세포의 기능 장애로 인해, 인슐린 생산이 충분하지 않은 환자는 일반적으로 외인성 인슐린을 투여하여 치료합니다. 생명을 구하는 이 치료법에도 불구하고, 이 치료법은 선의의 베타 세포에서 역동적인 인슐린 분비에 의해 달성되는 혈당의 정교한 조절과 정확하게 일치할 수 없습니다. 따라서 환자는 종종 생명을 위협하는 저혈당 삽화 및 만성 고혈당 여행으로 인한 기타 합병증의 결과로 고통받습니다. 인간 사체 섬의 이식은 T1D 환자의 엄격한 혈당 조절을 성공적으로 회복시키지만, 섬 기증자의 가용성과 이식을 위한 건강한 섬을 정제하는 데 어려움이 있어 제한적이다 3,4. 이 문제는 원칙적으로 hPSC를 대체 출발 물질로 사용하여 해결할 수 있습니다.
de vitro에서 hPSC로부터 인슐린 분비 섬을 생성하는 현재의 전략은 종종 in vivo 5,6에서 배아 췌장 발달 과정을 모방하는 것을 목표로 합니다. 이를 위해서는 책임 있는 신호 전달 경로에 대한 지식과 발달 중인 배아 췌장의 중요한 단계를 모방하기 위해 해당 용해성 인자의 시간 제한 추가가 필요합니다. 췌장 프로그램은 전사 인자 포크헤드 박스 A2(FOXA2)와 성별 결정 영역 Y-박스 17(SOX17)7로 표시된 최종 내배엽에 대한 헌신으로 시작됩니다. 최종 내배엽의 연속적인 분화는 원시적인 장관의 형성을 포함하며, 췌장 및 십이지장 호메오박스 1(PDX1)7,8,9을 발현하는 후방 앞창자로의 패턴화, PDX1 및 NK6 호메오박스 1(NKX6.1)10,11을 함께 발현하는 췌장 전구세포로의 상피 확장을 포함합니다.
내분비 섬 세포에 대한 추가적인 노력은 내분비 마스터 조절인자인 neurogenin-3 (NGN3)12의 일시적인 발현과 주요 전사 인자인 neuronal differentiation 1 (NEUROD1) 및 NK2 homeobox 2 (NKX2.2)13의 안정적인 유도를 동반합니다. 인슐린 생산 베타 세포, 글루카곤 생성 알파 세포, 소마토스타틴 생산 델타 세포 및 췌장 폴리펩티드 생산 PPY 세포와 같은 주요 호르몬 발현 세포는 이후에 프로그래밍됩니다. 이러한 지식과 광범위한 고처리량 약물 스크리닝 연구의 발견을 통해 최근의 발전으로 인슐린 분비 14,15,16,17,18,19가 가능한 베타 세포와 유사한 세포를 가진 hPSC 섬을 생성할 수 있게 되었습니다.
포도당 반응성 베타 세포 6,14,18,19를 생성하기 위한 단계적 프로토콜이 보고되었습니다. 이러한 연구를 기반으로 구축된 본 프로토콜은 평면 배양에서 PDX1+/NKX6.1+ 췌장 전구 세포를 생성하기 위한 췌장 전구 세포 키트를 사용한 다음, 균일한 크기의 클러스터로 마이크로웰 플레이트 응집과 정적 3D 현탁 배양에서 R-프로토콜을 사용하여 인슐린 분비 hPSC 섬에 대한 추가 분화를 포함합니다. 유세포 분석, 면역염색 및 기능 평가를 포함한 품질 관리 분석은 분화 세포의 엄격한 특성 분석을 위해 수행됩니다. 이 백서는 유도 분화의 각 단계에 대한 자세한 설명을 제공하고 in vitro 특성화 접근법을 간략하게 설명합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 논문은 체외 배양 후 40일 이내에 포도당 챌린지 시 인슐린을 분비할 수 있는 hPSC 섬을 생성할 수 있는 7단계 하이브리드 프로토콜을 설명합니다. 이러한 여러 단계 중에서, 최종 내배엽의 효율적인 유도는 최종 분화 결과(18,27,28)를 위한 중요한 출발점을 설정하는 것으로 여겨진다. 제조업체의 프로토콜에서는 분화를 …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
STEMCELL Technologies, Michael Smith Health Research BC, Stem Cell Network, JDRF 및 Canadian Institutes of Health Research의 지원에 감사드립니다. Jia Zhao와 Shenghui Liang은 Michael Smith Health Research BC Trainee Award를 수상했습니다. 미첼 J.S. 브람(Mitchell J.S. Braam)은 Mitacs Accelerate Fellowship의 수혜자입니다. Diepiriye G. Iworima는 Alexander Graham Bell Canada Graduate Scholarship과 CFUW 1989 Ecole Polytechnique Commemorative Award를 수상했습니다. Mel1 INS GFP/W 라인과 앨버타 당뇨병 연구소 아일렛 코어(Alberta Diabetes Institute Islet Core)를 공유해 주신 MCRI와 Monash University의 Edouard G. Stanley 박사님께 진심으로 감사드립니다. 또한 브리티시 컬럼비아 대학교(University of British Columbia)의 생명과학 연구소(Life Sciences Institute) 이미징 및 유세포 분석 시설의 지원에도 감사드립니다. 그림 1 은 BioRender.com 로 작성되었습니다.
Materials
| 3,3’,5-Triiodo-L-thyronine (T3) | Sigma | T6397 | Thyroid hormone |
| 4% PFA solution | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | Should be handled in fume hood |
| 96-Well, Ultralow Attachment, flat bottom | Corning Costar (VWR) | CLS3474 | Flat bottom; for static suspension culture in the last three stages |
| Accutase | STEMCELL Technologies | 07920 | Dissociation reagent for Stage 4 cells |
| Aggrewell400 plates | STEMCELL Technologies | 34415 | 400 µm diameter microwell plates |
| Aggrewell800 plates | STEMCELL Technologies | 34815 | 800 µm diameter microwell plates |
| Alexa Fluor 488 Goat anti-Human FOXA2 (goat IgG) | R&D Systems | IC2400G | 1:100 in flow cytometry; used for assaying Stage 1 cells |
| Alexa Fluor 488 Goat IgG Isotype Control | R&D Systems | IC108G | 1:100 in flow cytometry |
| Alexa Fluor 488 Mouse anti-Human SST (mouse IgG2B) | BD Sciences | 566032 | 1:250 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells |
| Alexa Fluor 488 Mouse IgG2B Isotype Control | R&D Systems | IC0041G | 1:500 in flow cytometry |
| Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human C-peptide (mouse IgG1κ) | BD Pharmingen | 565831 | 1:2,000 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells |
| Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human INS (mouse IgG1κ) | BD Sciences | 565689 | 1:2,000 in flow cytometry |
| Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human NKX6.1 (mouse IgG1κ) | BD Sciences | 563338 | 1:33 in flow cytometry; used for assaying Stage 4 cells |
| Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human SOX17 (mouse IgG1κ) | BD Sciences | 562594 | 1:50 in flow cytometry; used for assaying Stage 1 cells |
| Alexa Fluor 647 Mouse IgG1κ Isotype Control | BD Sciences | 557714 | 1:50 in flow cytometry |
| ALK5i II | Cayman Chemicals | 14794 | TGF-beta signaling inhibitor |
| Anti-Adherence Rinsing Solution | STEMCELL Technologies | 7010 | Microwell Rinsing Solution |
| Assay chamber | Cellvis | D35-10-1-N | For static GSIS and confocal imaging purposes |
| Bovine serum albumin (BSA) | Thermo Fisher Scientific | BP1600-100 | For immunostaining procedure |
| CK19 antibody | DAKO | M0888 | 1:50 in whole mount immunofluorescence |
| D-glucose | Sigma | G8769 | Medium supplement |
| DAPI | Sigma | D9542 | For nuclear counterstaining |
| DMEM/F12, HEPES | Thermo Fisher Scientific | 11330032 | Matrix diluting solution |
| Donkey anti-goat Alexa Fluor 555 | Life technologies | A21432 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-goat Alexa Fluor 647 | Life technologies | A21447 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-mouse Alexa Fluor 555 | Life technologies | A31570 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-mouse Alexa Fluor 647 | Life technologies | A31571 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 555 | Life technologies | A31572 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 647 | Life technologies | A31573 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-sheep Alexa Fluor 647 | Life technologies | A21448 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| DPBS | Sigma | D8537 | Without Ca2+ and Mg2+ |
| ELISA, insulin, human | Alpco | 80-INSHU-E01.1 | For human insulin measurement |
| Fatty acid-free BSA | Proliant | 68700 | Medium supplement |
| Fixation and Permeabilization Solution Kit | BD Sciences | 554714 | Fix/Perm and 10x Perm/Wash solutions included |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | STEMCELL Technologies | 7174 | For clump passaging hPSCs during maintenance culture |
| Glucagon antibody | Sigma | G2654 | 1:400 in whole mount immunofluorescence |
| GLUT1 antibody | Thermo Fisher Scientific | PA1-37782 | 1:200 in whole mount immunofluorescence |
| GlutaMAX-I (100x) | Gibco | 35050061 | L-glutamine supplement |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific | G33-4 | For tissue clearing and mounting |
| GSi XX | Sigma Millipore | 565789 | Notch inhibitor |
| Heparin | Sigma | H3149 | Medium supplement |
| ITS-X (100x) | Thermo Fisher Scientific | 51500056 | Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine; medium supplement |
| LDN193189 | STEMCELL Technologies | 72147 | BMP antagonist |
| MAFA antibody | Abcam | ab26405 | 1:200 in whole mount immunofluorescence |
| Matrigel, hESC-qualified | Thermo Fisher Scientific | 08-774-552 | Extracellular matrix for vessel surface coating |
| MCDB131 medium | Life technologies | 10372019 | Base medium |
| mTeSR1 Complete Kit | STEMCELL Technologies | 85850 | stem cell medium and 5x supplement included |
| N-Cys (N-acetyl cysteine) | Sigma | A9165 | Antioxidant |
| NaHCO3 | Sigma | S6297 | Medium supplement |
| NEUROD1 antibody | R&D Systems | AF2746 | 1:20 in whole mount immunofluorescence |
| NKX6.1 antibody | DSHB | F55A12-c | 1:50 in whole mount immunofluorescence |
| Pancreatic polypeptide antibody | R&D Systems | AF6297 | 1:200 in whole mount immunofluorescence |
| PBS | Sigma | D8662 | With Ca2+ and Mg2+ |
| PDX1 antibody | Abcam | ab47267 | 1:200 in whole mount immunofluorescence |
| PE Mouse anti-Human GCG (mouse IgG1κ) | BD Sciences | 565860 | 1:2,000 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells |
| PE Mouse anti-Human NKX6.1 (mouse IgG1k) | BD Sciences | 563023 | 1:250 in flow cytometry |
| PE Mouse anti-Human PDX1 (mouse IgG1k) | BD Sciences | 562161 | 1:200 in flow cytometry; used for assaying Stage 4 cells |
| PE Mouse IgG1κ Isotype Control | BD Sciences | 554680 | 1:2,000 in flow cytometry |
| PE Mouse-Human Chromogranin A (CHGA, mouse IgG1k) | BD Sciences | 564563 | 1:200 in flow cytometry |
| R428 | Cayman Chemicals | 21523 | AXL tyrosine kinase inhibitor |
| Retinoid acid, all-trans | Sigma | R2625 | Light-sensitive |
| RIPA lysis buffer, 10x | Sigma | 20-188 | For hormone extraction |
| SANT-1 | Sigma | S4572 | SHH inhibitor |
| SLC18A1 antibody | Sigma | HPA063797 | 1:200 in whole mount immunofluorescence |
| Somatostatin antibody | Sigma | HPA019472 | 1:100 in whole mount immunofluorescence |
| STEMdiff Pancreatic Progenitor Kit | STEMCELL Technologies | 05120 | Basal media and supplements included |
| Synaptophysin antibody | Novus | NB120-16659 | 1:25 in whole mount immunofluorescence |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | For permeabilization |
| Trolox | Sigma Millipore | 648471 | Vitamin E analog |
| TrypLE Enzyme Express | Life technologies | 12604-021 | cell dissociation enzyme reagent for single cell passaging hPSCs |
| Trypsin1/2/3 antibody | R&D Systems | AF3586 | 1:25 in whole mount immunofluorescence |
| Y-27632 | STEMCELL Technologies | 72304 | ROCK inhibitor |
| Zinc sulfate | Sigma | Z0251 | Medium supplement |
Referencias
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