激光消融和活体显微镜研究肠道重塑

该方案结合了显微激光消融和纵向活体显微镜检查，以跟踪从早期损伤反应到长期组织重塑的肠道再生。该技术的建立严格遵守伦理考虑，以诱导和成像显微镜激光消融，并且精确遵循将保持动物的健康。在手术过程中，重要的是要确保肠道的完整性得到很好的保存。这可以通过使用无菌湿棉签轻轻处理组织来实现，这可以防止组织出血或干燥。激光诱导的微观损伤的程度也应通过对激光消融后该区域的不同肠层进行成像来仔细评估。如果研究人员希望调整本协议中描述的实验步骤的频率，则应在实验前咨询研究所的动物伦理委员会，以确定对福利的影响。

重复的活体显微镜允许随着时间的推移监测同一只小鼠的组织恢复。肠道的反复手术暴露很容易使整个肠道的光学通道成为可能。组织固有特征（如脉管系统）可作为标志，在每次成像会话中识别相同的肠道区域。因此，可以在数周内对同一组织区域进行成像，这使得人们能够量化同一小鼠同一肠道区域的长期组织再生。手术和成像方法相结合提供的时空控制带来了在同一只小鼠体内稳态和再生条件下对同一器官进行成像的优势，这与以前的全器官损伤模型形成鲜明对比，其中对照和再生样品来自不同的小鼠¹¹，¹²，¹⁸，^19，20.因此，我们的实验设置最大限度地减少了实验所需的动物数量，并减少了动物内的变化。

方案故障排除应从回顾小鼠和肠道处理技术开始，并控制显微镜设备和设置。该协议中有许多关键步骤需要特别注意。首先，为了确保动物健康和持续的高质量数据，所有工作都需要使用无菌技术在清洁无菌的环境中进行，并且在手术和每次成像过程中应保持小鼠温度。在成像过程中，用无菌的预热盐水保持组织水分至关重要，可以防止组织纤维化。

为了确保实验以可重复的方式进行，重要的是在使用前对准激光器以实现最佳采集，并在每次会话开始时测量多光子激光器的功率输出。物镜类型、放大倍率、停留时间、激光功率和波长等参数会影响显微激光烧蚀的程度，应考虑这些参数。在这项研究中，激光烧蚀和成像都是通过Fluotar VISIR 25x/0.95 WATER物镜在960nm波长下以1.2 W（镜头外）的激光功率进行的。改变波长或光学扫描特性会影响微观损伤的程度。较低的波长（例如840nm）转化为更高能量的光子，并且通常在较高的激光输出中，并且可能增强微观损伤。更高的缩放导致每个区域的能量更多，因此消融隐窝的时间更少，反之亦然。像素停留时间也可以增加或减少，以改变烧蚀速度和损伤程度。当成像组织不稳定时（例如，由于蠕动运动），需要快速进行消融。为此，应通过增加变焦和/或激光输出等方式优化消融速度。

在多次成像会话中发现相同的肠道区域是另一个需要正确执行以确保实验成功的关键步骤。为此，肠道需要在所有时间点以完全相同的方式定位。我们建议始终使用盲肠作为参考点，以找到小肠和大肠中的相同区域。用棉签轻轻拉伸感兴趣的组织，确保感兴趣的区域在目标工作距离的范围内，并最大限度地增加可追溯的区域数量。此外，我们建议始终消融和成像每只小鼠的多个微观位置，以考虑在以后的成像会话中可能无法定位的区域。如果找不到区域，即使肠道的位置是正确的，它也可以帮助重新定位鼠标并改变暴露区域的方向。随着时间的推移跟踪隐窝对于几个相邻隐窝的较大肠野被消融的实验来说可能很麻烦。这种破坏性的损伤可以引起上皮单层以外的组织重塑，最终可能导致用于随着时间的推移跟踪该区域的组织标志物的修改。选择距受损场地足够距离的地标，并捕获比受损区域高出数百微米的更大视野，可以增加长期实验成功的机会。除了肠道在显微镜载物台上的不正确定位外，胃肠道的蠕动运动可能会干扰成像。这个问题可以通过两种方式得到改善。如果运动频率不是太高，则可以在同一区域重复该过程，并增加曝光时间。或者，可以使用更多的麻醉来减少蠕动。我们建议将较高剂量的异氟醚限制在短期调整内。总之，成像过程应尽可能短，最好在3小时以下，以确保快速恢复。

与其他损伤模型相比，联合激光消融和纵向活体显微镜方法具有几个优点。以前的（化学）损伤模型缺乏局部限制破坏性侮辱⁶，¹¹，¹²，^19，20的能力。激光烧蚀通过将损伤限制在确定的感兴趣区域来克服这一缺点。这使研究人员能够控制受伤的位置以及损伤程度。损伤严重程度可以调节为消融隐窝或整个微观肠野，以告知隐窝尺度的再生反应。除了空间控制之外，激光烧蚀还可以精确地确定损伤的发生时间，从而超越以前的药物、化学和感染模型⁹、10^、11、¹²、^19、20 的精度。我们的协议扩展了以前的研究，这些研究使用激光诱导热消融作为诱导肠道局部损伤的方法^21，23。以前的激光诱导损伤模型对小肠²¹或远端结肠²³的管腔表面的局部区域进行成像。手术和激光消融方法相结合，可以高分辨率地可视化肠上皮（特别是隐窝），并在小肠、盲肠和近端结肠的任何位置进行组织恢复的激光消融和后续成像。它捕获相同肠道区域随时间的恢复，允许根据实验设置可视化肠道的不同层（粘膜、粘膜下层、肌肉和血清）。我们的技术主要用于数周/数月的长期重复成像。为了研究隐窝的短期恢复动态（例如，损伤后连续几天），这里描述的激光消融方法可以与活体成像窗口²⁷，^28，40相结合。

该协议可用于来自不同科学领域的多种研究应用，涵盖再生、免疫学和癌症研究。肠道再生的纵向成像揭示了保持上皮完整性和屏障功能的细胞动力学，使宿主能够防御肠腔中的病原体，以及致癌突变清除和扩散的基础。每个科学问题都会对激光诱导的损伤程度和成像持续时间提出独特的要求。荧光报告小鼠和注射的染料可以通过允许任何感兴趣的细胞和结构的可视化来大幅扩展和完善可以获取的数据。例如，Lgr5-CreERt2：Rosa26-Confetti小鼠可用于可视化干细胞后代，而Rosa26-mTmG报告基因则告知组织结构。总之，这些最新的技术进步使活体肠道实验成为促进我们对肠道生物学和疾病的理解的有利可图的工具。