यहां, हम एक आसान-से-लागू, मानकीकृत, माइक्रोफिजियोलॉजिकल सिस्टम का वर्णन करते हैं जो विवो संरचना में मानव अस्थि मज्जा की जटिलता को दर्शाता है, सामान्य और पैथोलॉजिकल घटनाओं की एक विस्तृत श्रृंखला का बारीक अध्ययन करने के लिए एक प्रासंगिक मॉडल प्रदान करता है।
मेडुलरी आला एक जटिल पारिस्थितिकी तंत्र है जो निवासी कोशिकाओं के लिए होमियोस्टैसिस को बनाए रखने के लिए आवश्यक है। दरअसल, अस्थि मज्जा, जिसमें एक जटिल बाह्य मैट्रिक्स और विभिन्न सेल प्रकार शामिल हैं, जैसे कि मेसेनकाइमल स्टेम सेल, ओस्टियोब्लास्ट और एंडोथेलियल कोशिकाएं, प्रत्यक्ष सेल-सेल इंटरैक्शन के साथ-साथ साइटोकिन उत्पादन के माध्यम से हेमटोपोइएटिक स्टेम सेल विनियमन में गहराई से शामिल है। विवो संरचना में इसकी बारीकी से नकल करने और मानव अस्थि मज्जा की प्रतिक्रियाओं को प्रतिबिंबित करने वाले प्रयोगों का संचालन करने के लिए, बायोमैटेरियल्स के आधार पर कई 3 डी मॉडल बनाए गए हैं, जो मुख्य रूप से प्राथमिक स्ट्रोमल कोशिकाओं पर निर्भर हैं। यहां, एक प्रोटोकॉल को न्यूनतम और मानकीकृत प्रणाली प्राप्त करने के लिए वर्णित किया गया है जो स्थापित करना आसान है और अस्थि मज्जा जैसी संरचना की विशेषताएं प्रदान करता है, जो एंडोथेलियल कोशिकाओं सहित विभिन्न सेल आबादी को जोड़ता है, और विवो अस्थि मज्जा ऊतक में विविधता को दर्शाता है। यह 3 डी अस्थि मज्जा जैसी संरचना कैल्शियम फॉस्फेट-आधारित कणों और मानव सेल लाइनों का उपयोग करके इकट्ठी होती है, अस्थि मज्जा माइक्रोएन्वायरमेंट का प्रतिनिधि- सिस्टम के भीतर विभिन्न प्राथमिक सेल आबादी को जोड़कर या प्रतिस्थापित करके जैविक प्रक्रियाओं की एक विस्तृत विविधता की निगरानी की अनुमति देता है। अंतिम 3 डी संरचनाओं को या तो निर्धारण, पैराफिन-एम्बेडिंग, और सिस्टम के भीतर सेल स्थानीयकरण के लिए हिस्टोलॉजिकल / इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधला करने के बाद छवि विश्लेषण के लिए काटा जा सकता है, या आणविक या कार्यात्मक लक्षण वर्णन के लिए प्रत्येक सेलुलर घटक को इकट्ठा करने के लिए अलग किया जा सकता है।
अस्थि मज्जा (बीएम) अक्षीय और लंबी हड्डियों और त्रिकोणीय सपाट हड्डियों के केंद्रीय गुहाओं दोनों के भीतर पाया जाता है, और इसमें विभिन्न प्रकार के अलग-अलग सेलुलर और गैर-सेलुलर घटक होते हैं। संरचनात्मक स्तर पर, इसमें हेमटोपोइएटिक ऊतक द्वीप (जिसे “हेमटन” भी कहा जाता है) 1,2 और वसा कोशिकाएं होती हैं जो संवहनी साइनस से घिरी होती हैं जो ट्रिब्युलर हड्डी3 के भीतर फैली होती हैं। लंबी और सपाट हड्डियों में, हड्डी और अस्थि मज्जा को रक्त की आपूर्ति वाहिकाओंके एंडोस्टेल नेटवर्क के माध्यम से परस्पर जुड़ी होती है। इस ठोस सुरक्षात्मक नेटवर्क में छिपा हुआ, बीएम एक स्पंजी स्ट्रोमा में डूबी बहुत अपरिपक्व कोशिकाओं को होस्ट करता है और निवासी मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं (एमएससी) और हेमटोपोइएटिक स्टेम कोशिकाओं (एचएससी) 5 के भेदभाव के लिए स्थान का गठन करता है। दरअसल, ओस्टियोब्लास्ट के उत्पादन के माध्यम से हड्डी के ऊतकों के नवीकरण के अलावा, बीएम के मुख्य ज्ञात कार्यों में से एक हेमटोपोइजिस विकास6 में रहता है।
बीएम हेमटोपोइएटिक ऊतक में विभिन्न प्रकार के सेल प्रकार शामिल हैं, अर्थात् एचएससी, अग्रदूत, और लिम्फोसाइट्स, न्यूट्रोफिल, एरिथ्रोसाइट्स, ग्रैन्यूलोसाइट्स, मोनोसाइट्स और थ्रोम्बोसाइट्स7 जैसे अधिक विभेदित रक्त कोशिकाएं। हेमटोपोइएटिक कोशिकाओं को बीएम स्पेस में यादृच्छिक रूप से व्यवस्थित नहीं किया जाता है, लेकिन हेमटोपोइएटिक niches के भीतर एक विशेष संगठन प्रदर्शित करता है, जिसमें विभिन्न मूल (ओस्टियोब्लास्ट, ओस्टियोक्लास्ट, एमएससी, एडिपोसाइट्स, साइनसॉइडल एंडोथेलियम और पेरिवास्कुलर स्ट्रोमल कोशिकाएं, प्रतिरक्षा कोशिकाएं, तंत्रिका कोशिकाएं और विशिष्ट परिपक्व हेमटोपोइएटिक कोशिकाएं) के कई सेल प्रकार शामिल हैं, जो सामान्य हेमटोपोइजिस8 सुनिश्चित करने के लिए एक जटिल संरचना बनाते हैं। . हेमटोपोइएटिक आला के जैविक कार्यों में कई शारीरिक या गैर-शारीरिकतनावों के जवाब में विभिन्न तंत्रों (सेल-सेल और सेल-मैट्रिक्स इंटरैक्शन, घुलनशील कारकों का उत्पादन, हाइपोक्सिया) के माध्यम से एचएससी अस्तित्व, आसंजन, क्वीसेंस, होमिंग और भेदभाव का विनियमन शामिल है। यद्यपि इन हेमटोपोइएटिक niches को शुरू में सजातीय संस्थाओं के रूप में माना जाता था, लेकिन एकल-कोशिका और इमेजिंग विश्लेषण जैसे तकनीकी विकास ने उत्तरोत्तर उनकी जटिलता, गतिशीलता और अनुकूली गुणों 9,10,11 का खुलासा किया है।
मानव शारीरिक और रोग प्रक्रियाओं को समझने के लिए जानवरों के उपयोग को बदलने और कम करने की महत्वपूर्ण आवश्यकता नए अवसरों और चुनौतियोंकी ओर ले जाती है। नए वर्णित इन विट्रो उपकरणों में, तीन-आयामी (3 डी) मॉडल जो शास्त्रीय दो-आयामी (2 डी) संस्कृतियों 13,14,15,16,17 की तुलना में विवो मानव बीएम की नकल करते हैं, प्रस्तावित किए गए हैं। इस प्रकार 3 डी मॉडलिंग सेल-सेल और सेल-मैट्रिक्स इंटरैक्शन का निरीक्षण करने के लिए एक आशाजनक दृष्टिकोण प्रतीत होता है, जो विवो में होने वाले लोगों के करीब है। इन मॉडलों की एक किस्म का उपयोग करते हुए, कुछ टीमों ने एचएससी18,19 के अस्तित्व और प्रसार का प्रदर्शन किया है। कई 3 डी मॉडल उपलब्ध हैं, सबसे आम दृष्टिकोण पाड़-आधारित 3 डी बायोमैटेरियल्स जैसे हाइड्रोगेल, कोलाइड्स या कोलेजन का उपयोग है, जो एमएससी से जुड़े हैं, जो उनकी ओस्टियोब्लास्टिक वंश भेदभाव क्षमता 20,21,22 का लाभ उठाते हैं। फिर भी, उपयोगकर्ता के अनुकूल और मानकीकृततरीके से मानव कोशिकाओं पर अध्ययन के लिए सभी आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए कोई वैश्विक सहमति नहीं मिली है, खासकर जब से ये वर्तमान 3 डी सिस्टम मुख्य रूप से प्राथमिक स्ट्रोमल कोशिकाओं पर भरोसा करते हैं, और इस प्रकार प्राथमिक नमूनों, ऊतक उपलब्धता और विषमता तक सीमित पहुंच से पीड़ित हैं।
इसके अतिरिक्त, एंडोथेलियल सेल कम्पार्टमेंट को पेश किया जाना चाहिए क्योंकि ये कोशिकाएं सेल-सेल इंटरैक्शन के एक प्रमुख घटक का प्रतिनिधित्व करती हैं और ल्यूकेमिया24 और मेटास्टेसिस25 दोनों में स्टेम सेल भाग्य और बीएम रोग के विकास में शामिल होती हैं। हमने पहले बताया था कि एक मानकीकृत मानव 3 डी अस्थि मज्जा मॉडल में पैथोलॉजिकल तत्वों के अतिरिक्त रोगी के नमूनों में देखी गई विशेषताओं को पुन: उत्पन्न करता है जैसे कि बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) परिवर्तन26। मानव बीएम माइक्रोएन्वायरमेंट और निवासी कोशिकाओं के बीच गतिशीलता और बातचीत को बेहतर ढंग से समझने के लिए, हम न्यूनतम, सुव्यवस्थित, बीएम जैसी संरचना बनाने के लिए उपयोगकर्ता के अनुकूल और मानकीकृत प्रणाली के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। इस प्रणाली में तीन मानव अस्थि मज्जा कोशिका प्रकार-एंडोथेलियल कोशिकाएं और स्ट्रोमल कोशिकाएं शामिल हैं, जो माइक्रोएन्वायरमेंट और एचएससी का प्रतिनिधित्व करती हैं। एक मचान और ओस्टियोब्लास्टिक भेदभाव माध्यम के रूप में विशिष्ट मोतियों का उपयोग करके, प्राप्त 3 डी संरचना मानव मज्जा आला की नकल करेगी, जिससे मानव अस्थि मज्जा के एक आसान अध्ययन की अनुमति मिलेगी।
मानव शारीरिक और संबंधित रोग संबंधी मुद्दों पर अध्ययन द्वारा सामना की जाने वाली वर्तमान चुनौतियों में से एक मानव अंगों के जटिल कार्यों की सटीक नकल करने वाले मॉडल की कमी है। मानव बीएम 3 डी मॉडल के मामले में, कई मॉडल हाइड्रोगेल का उपयोग करते हैं और आंशिक रूप से बीएम को पुन: पेश करते हैं, उदाहरण के लिए, एक बेहतर ओस्टियोब्लास्टिक भेदभाव 27,28 सुनिश्चित करने में शास्त्रीय 2 डी संस्कृतियों की तुलना में 3 डी संस्कृति स्थितियों की शक्ति कोदर्शाते हैं। फिर भी, अच्छी प्रजनन क्षमता और उपयोग में आसानी के बावजूद, ये सिस्टम मानव बीएम 3 डी संरचना और वास्तुकला की नकल नहीं करते हैं, जो आगे के विश्लेषणों को काफी प्रभावित कर सकते हैं। तकनीकी प्रगति ने वैज्ञानिकों को कुछ एचएससी गुणों को बनाए रखने के लिए छिड़काव-आधारित बायोरिएक्टर सिस्टम का उपयोग करके देशी मानव ओस्टियोब्लास्टिक आला वातावरण को बेहतर ढंग से पुन: उत्पन्न करने में सक्षमबनाया है। माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों के विकास ने एक प्रासंगिक अस्थि मज्जा जैसी संरचना को पुन: पेश करने के लिए नए दृष्टिकोणों को जन्म दिया है, लेकिन अब तक केवल अस्थि मज्जा की सीमित विशेषताओं को हासिल किया है, और इसलिएअनुप्रयोगों को 30,31,32,33 तक सीमित कर दिया है।
भौतिक विज्ञान में प्रगति ने प्राकृतिक या सिंथेटिक बायोमैटेरियल्स की एक विस्तृत श्रृंखला के विकास में योगदान दिया है, जिसका उपयोग प्रासंगिक 3 डी हड्डी संस्कृति प्रणालियों को विकसित करने के लिए किया जा सकता है। हालांकि, ऐसी प्रणालियों को कभी-कभी मानक जैविक प्रयोगशालाओं में विकसित करना मुश्किल होता है, जिसमें बायोफिज़िक्स में कोई इन-हाउस कौशल नहीं होता है। इसके अलावा, ज्यादातर मामलों में, ये प्रणालियां बीएम माइक्रोएन्वायरमेंट सहित मानव हड्डी की 3 डी संरचना की नकल करने की सीमित क्षमता प्राप्त करती हैं, और बड़ी मात्रा में साइटोकिन्स और विकास कारकों का उपयोग करती हैं, जिससे कृत्रिम रूप से समृद्ध संस्कृति माध्यम34 बनता है।
एडिपोसाइटिक भेदभाव के बजाय ओस्टियोब्लास्टिक भेदभाव को प्रेरित करने का विकल्प इस तथ्य पर आधारित था कि प्रीओस्टियोब्लास्ट्स और ओस्टियोब्लास्ट को एंडोस्टियल आला35 के हिस्से के रूप में वर्णित किया गया है। इसने अस्थि और अस्थि मज्जा दोनों के अनुरोधित घटकों के रूप में ओस्टियोब्लास्टिक कोशिकाओं की पहचान की। अस्थि मज्जा के सेलुलर घटकों में, एंडोथेलियल और स्ट्रोमल कोशिकाएं माइक्रोएन्वायरमेंट के एक बड़े हिस्से पर कब्जा कर लेती हैं। इसके अलावा, ये दो सेल प्रकार होमियोस्टेसिस और भेदभाव के विनियमन में शामिल बाह्य मैट्रिक्स और साइटोकिन्स के संरचनात्मक गैर-सेलुलर घटकों का उत्पादन करते हैं, जो यहां कैल्सीफाइड संरचना उत्पन्न करने के लिए अनुरोध किया गया है। इस प्रकार, यह एंडोथेलियल और स्ट्रोमल कोशिकाओं के उपयोग को सही ठहराता है, और प्रयोगशालाओं के बीच आसान पहुंच और प्रजनन क्षमता बढ़ाने की अनुमति देने के लिए सेल लाइनों की हमारी पसंद। एचएमईसी -1 लाइन की संस्कृति समय के साथ अधिक स्थिर होने के साथ, इस सेल लाइन को 3 डी सिस्टम के विकास के लिए बरकरार रखा गया था। स्ट्रोमल कोशिकाओं के लिए, हमने 2 डी संस्कृति में सामान्य अस्थि मज्जा से प्राप्त स्ट्रोमल सेल लाइनों की ओस्टियोब्लास्ट भेदभाव क्षमता की तुलना की: एचएस 5 और एचएस 27 ए। हमने पाया कि एचएस 5 लाइन ने किसी भी सेल लाइन के साथ उत्पन्न 3 डी सिस्टम में एचएस 27 ए लाइन के रूप में अंतर नहीं किया। इस संबंध में, एचएस 5 लाइन द्वारा एचएस 27 ए कोशिकाओं को बदलने के प्रयासों के परिणामस्वरूप कम कठोर संरचना का उत्पादन हुआ है, यह सुझाव देते हुए कि एचएस 27 ए अधिक उपयुक्त हैं।
एचएस 27 ए और एचएमईसी -1 सेल लाइनों दोनों को अलग-अलग मीडिया संयोजनों में सुसंस्कृत किया गया था, जिसमें ओस्टियोब्लास्ट संरचनाओं के साथ एचएमईसी -1 की सबसे अच्छी कठोर संरचना और संरेखण प्राप्त होता है ताकि बाह्य मैट्रिक्स का उत्पादन मूल संरचना में सापेक्ष कठोरता लाए। डी 14 में भेदभाव की प्रगति के विश्लेषण से पता चला है कि भेदभाव डी 21 (बीएसपी, लेट ओस्टियोब्लास्टिक मार्कर का माप) पर अधिक उन्नत था, एचएमईसी -1: एचएस 27 ए के लिए 1: 2 अनुपात के साथ और बेहतर परिणाम के साथ जब 2 × 106 एचएस 27 ए पेश किए गए थे। एंडोथेलियल कोशिकाओं की होमियोस्टैसिस और भेदभाव (साइटोकिन्स की आपूर्ति के माध्यम से अन्य चीजों के बीच) को विनियमित करने में भी महत्वपूर्ण भूमिका है। तथ्य यह है कि एचएमईसी -1 कोशिकाओं को इस प्रणाली में बनाए रखा जाता है, यह इंगित करता है कि वे कम से कम इस भूमिका को पूरा कर सकते हैं, और यह हमारे मॉडल की वैधता में योगदान देता है। एचएमईसी -1 एंडोथेलियल लाइन के लिए, इसे जल्दी पेश करना महत्वपूर्ण था ताकि इसे संरचना में ठीक से एकीकृत किया जा सके और इस उम्मीद के साथ कि ये कोशिकाएं संरचना के भीतर संरेखण या यहां तक कि ट्यूब भी बना सकती हैं। एचएस 27 ए और एचएमईसी -1 के सह-संस्कृति परीक्षण विभिन्न चरणों में उत्तरार्द्ध को पेश करके किए गए थे: डी 0, डी 7, डी 14; कोई उल्लेखनीय अंतर नहीं देखा गया, न तो स्ट्रोमल कोशिकाओं के भेदभाव में और न ही एंडोथेलियल कोशिकाओं के रखरखाव या स्थिति में। इस प्रकार, इन कोशिकाओं को प्रक्रिया की शुरुआत में पेश किया गया था। हेमटोपोइएटिक कोशिकाओं को ऐसे समय में पेश किया गया था जब ओस्टियोब्लास्टिक भेदभाव सेल-सेल इंटरैक्शन के पक्ष में पर्याप्त उन्नत होगा। यह विकल्प इस तथ्य से भी वातानुकूलित था कि यह ओस्टियोब्लास्टिक भेदभाव एक माध्यम के उपयोग से वातानुकूलित है, जो हमारे परीक्षणों के अनुसार, हेमटोपोइएटिक कोशिकाओं के रखरखाव का पूरी तरह से समर्थन नहीं करता है। हेमेटोलॉजिकल कोशिकाएं या तो सेल लाइनें या प्राथमिक बीएम सीडी 45 हेमटोपोइएटिक कोशिकाएं हो सकती हैं।
इस 3 डी मॉडल से, हम प्रत्येक सेल प्रकार को प्राथमिक कोशिकाओं, सामान्य या पैथोलॉजिकल द्वारा प्रतिस्थापित करने की परिकल्पना कर सकते हैं, या यहां तक कि बायोमिमेटिक गुणों को बढ़ावा देने के लिए अन्य सेल प्रकारों को जोड़ने के लिए, जैसे प्रतिरक्षा कोशिकाएं, एडिपोसाइट्स, या फाइब्रोब्लास्ट26। वास्तव में, एचएस 27 ए सेल लाइन को कम पासिंग के साथ प्राथमिक बीएम एमएससी के साथ बदल दिया गया है। इसी तरह, हेमेटोलॉजिकल सेल लाइनों को प्राथमिक बीएम हेमटोपोइएटिक कोशिकाओं के साथ बदल दिया गया था। हालांकि, प्राथमिक एंडोथेलियल कोशिकाओं द्वारा एचएमईसी -1 कोशिकाओं के प्रतिस्थापन का अभी तक परीक्षण नहीं किया गया है। वर्तमान में, इस मॉडल को अभी भी वाहिका प्रतिनिधित्व के संदर्भ में बेहतर बनाया जा सकता है, भले ही एंडोथेलियल कोशिकाएं मौजूद हों और माइक्रोएन्वायरमेंट (जैसे, हेमटोपोइएटिक कोशिकाओं) से अन्य कोशिकाओं के साथ सही ढंग से बातचीत करती हैं, वे संरचित वाहिकाओं का निर्माण नहीं करती हैं, इस प्रकार कार्यात्मक रक्त वाहिकाओं की नकल करने के लिए प्रवाह छिड़काव को रोकती हैं। कुल मिलाकर, यह वर्तमान न्यूनतम 3 डी मॉडल की जटिलता और प्रतिनिधित्व को उत्तरोत्तर बढ़ा सकता है। अन्य सेल प्रकारों के अलावा अन्य मुद्दों की जांच करने वाले अध्ययन की सुविधा हो सकती है, जैसे कि स्थानीय बीएम सूजन का महत्व या इम्यूनोथेरेपी के प्रतिरोध।
हालांकि, इस 3 डी प्रणाली को रुचि की कोशिकाओं से पहले 3 सप्ताह की आवश्यकता होती है, हेमेटोलॉजिकल कोशिकाओं या उपकला कैंसर कोशिकाओं यदि मेटास्टेसिस प्रक्रिया का मूल्यांकन किया जाता है, तो जोड़ा जा सकता है। बाँझ स्थितियों को बनाए रखने की आवश्यकता है, क्योंकि साप्ताहिक रूप से दो बार मध्यम परिवर्तन कभी-कभी मध्यम संदूषण का कारण बन सकता है। इसके अलावा, चूंकि कुछ कोशिकाएं इंसर्ट के छिद्रों के माध्यम से पलायन कर सकती हैं और कुएं में फैलना शुरू कर सकती हैं, जिससे मध्यम खपत बढ़ जाती है, नियमित निगरानी की सिफारिश की जाती है।
हमने यहां ओस्टियोब्लास्टिक भेदभाव की अनुमति देने वाले एक 3 डी पाड़ का वर्णन किया और एक प्रासंगिक , इन विट्रो, 3 डी, मानव बीएम जैसे माइक्रोएन्वायरमेंट विकसित किया। यह प्रणाली सीटू विश्लेषण और अंतिम लाइव सेल पुनर्प्राप्ति में अनुमति देती है। यह प्रणाली मानव बीएम माइक्रोएन्वायरमेंट के भीतर बातचीत और तंत्र का अध्ययन करने के लिए अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ एक नया और अत्यधिक लचीला उपकरण, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और उपयोगकर्ता के अनुकूल प्रदान करती है।
The authors have nothing to disclose.
हम सीआरसीएल साइटोमेट्री प्लेटफॉर्म से पी बैटिस्टन-मोंटेने और ए जाम्बन और रिसर्च पैथोलॉजी प्लेटफॉर्म, ट्रांसलेशनल रिसर्च एंड इनोवेशन विभाग, सेंटर लेओन बेरार्ड से एन गैडोट और सी लेनवे को धन्यवाद देते हैं। लेखक अंग्रेजी संस्करण के लिए बी मैनशिप के आभारी हैं। इस काम को इंसरम और एफआई-एलएमसी द्वारा वीएमएस को वित्त पोषित किया गया था, और एस एलकेए और एलबी को सोसाइटी फ्रैंकाइस डी’हेमेटोलॉजी से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।
3,3-Diaminobenzidine (DAB) Liquid Substrate System | MERCK SIGMA | D7304 | IHC staining |
5 mL Pipette | SARSTEDT | 861253001 | Medium change |
Anti Mouse HRP | Thermofisher | 62-6520 | IHC secondary staining |
Anti Rabbit HRP | Thermofisher | 31460 | IHC secondary staining |
Ascorbic Acid 250 μM | MERCK SIGMA | A92902 | ODM medium |
BCP | CaP Biomaterials LLC-US |
3D Beads | |
Beta Glycerophosphate 10 mM | MERCK SIGMA | G9422 | ODM medium |
CD31-BV711 | BD | 744078 | 3D endothelial Cell population labelling |
CD34-APC | BD | 555824 | 3D immature hematological Cell population labelling |
CD38-PE-Cy5 | BD | 555461 | 3D progenitor hematological Cell population labelling |
CD45 | Miltenyibiotec | 130-110-637 | IHC staining of hematological cells |
CD45-APC | BD | 555485 | 3D hematological Cell population labelling |
CD45-BV500 | BD | 560777 | 3D hematological Cell population labelling |
CD73 | Miltenyibiotec | 130-120-066 | IHC staining of stromal compartment |
CD73-BV605 | BD | 563199 | 3D osteoblastic Cell population labelling |
Cell Strainer for FACS equipment with 5 mL tube | FALCON | 352235 | Strainer and tube used to collect the cells and eliminate beads |
Collagenase | MERCK SIGMA | C2674-1G | 3D enzymatic dissociation |
Cytometry filtration tube | Thermofisher | 10585801 | 3D retrieved cells filtration |
Cytometry tube | Thermofisher | 10100151 | 3D retrieved cells labelling |
DAPI (Solution 12) | Chemometec | 910-3012 | 3D retrieved viable cells labelling |
Dexamethasone | Thermofisher | A13449 | ODM medium |
DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate 500 mL | Thermofisher | 31966021 | ODM medium |
EGF | MERCK SIGMA | E9644-0.2MG | HMED-1 medium |
Eppendorf 1.5 mL tube | SARSTEDT | 72696 | For beads autoclave and supernatant retieve |
Falcon 15 mL | FALCON | 352096 | For 3D Dissociation |
FBS | DUTSCHER | S1900-500 | To supplement culturing medium and stop trypsin action |
Glutamax | Thermofisher | A1286001 | glutamine substitute for HMED-1 medium |
Hematoxylin Solution, Gill No. 1 | MERCK SIGMA | GHS132-1L | IHC staining |
HMEC-1 | ATCC | CRL-3243 | 3D endothelial Cell population |
HS27A | ATCC | CRL-2496 | 3D osteoblastic Cell population |
Hydrocortisone | MERCK SIGMA | H0135-1MG | HMED-1 medium |
Insert: Nunc Polycarbonate Cell Culture Inserts in Multi-Well Plates | THERMO SCIENTIFIC NUNC | 140627 | To harvest cells and form a 3D Bone like structure |
KI-67 IHC | Thermofisher | MA5-14520 | IHC staining of proliferative cells |
MCDB 131 Medium, no glutamine | Thermofisher | 10372019 | HMED-1 medium |
Micropipette (1,000 µL) | Eppendorf | 4924000088 | Medium change |
PBS D 1x | Thermofisher | 14190169 | Cells/ Insert wash |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermofisher | 15140122 | To supplement culturing medium |
PFA (Formaldehyde 16%) | EUROMEDEX | EM-15710 | 3D Fixation (dilution with PBS 1X) |
RMPI 1640 medium, glutamax supplement | Thermofisher | 61870044 | Cuture medium |
Scalpel | FISHER SCIENTIFIC | 11768353 | 3D membrane cutting |
Six well plate | FALCON | 353046 | 3D culture |
TRYPSIN-EDTA SOLUTION (1x) | Thermofisher | 25300096 | 3D enzymatic dissociation |