Stramme barrierer adskiller centralnervesystemet (CNS) fra periferien, herunder blod-hjerne-barrieren (BBB) og blod-cerebrospinalvæsken (CSF) barrieren. Disse barrierer beskytter CNS mod eksterne fornærmelser og sikrer et afbalanceret og kontrolleret mikromiljø ^1,2,3. Mens BBB er blevet grundigt undersøgt over tid, har blod-CSF-barrieren placeret ved choroid plexus (CP) kun fået stigende forskningsinteresse i løbet af det sidste årti. Denne sidstnævnte barriere kan findes i hjernens fire ventrikler (figur 1A, B) og er kendetegnet ved et enkelt lag af choroid plexus epitelceller (CPE), der omgiver en central stroma, utætte kapillærer, fibroblaster og en lymfoid og myeloid cellepopulation (figur 1C) ^4,5,6. CPE-cellerne er tæt forbundet med hinanden ved tætte kryds, hvilket forhindrer lækage fra de underliggende fenestrerede blodkapillærer ind i CSF og hjernen. Derudover reguleres transport på tværs af CPE-cellerne af en række ind- og udadgående transportsystemer, der styrer tilstrømningen af gavnlige forbindelser (f.eks. næringsstoffer og hormoner) fra blodet til CSF og udstrømningen af skadelige molekyler (f.eks. metabolisk affald, overskydende neurotransmittere) i den anden retning ^1,6. For at kunne udøve deres aktive transportfunktion indeholder CPE-cellerne adskillige mitokondrier i deres cytoplasma⁷. Desuden er CP den vigtigste kilde til CSF og fungerer som hjernens gatekeeper ved tilstedeværelsen af residente inflammatoriske celler¹. På grund af sin unikke placering mellem blodet og hjernen er CP også perfekt placeret til at udføre immunovervågning⁸.

Figur 1: Skematisk oversigt over placeringen og sammensætningen af choroid plexus (CP). (A, B) CP-væv findes i de to laterale, den tredje og den fjerde ventrikel i (A) menneskelige og (B) musehjerner. (C) CP-vævet består af et enkelt lag af tæt forbundne kuboide CP-epitelceller (CPE), der omgiver fenestrerede kapillærer, løst bindevæv og lymfoide og myeloide celler og danner blod-cerebrospinalvæskebarrieren (tilpasset og modificeret fra reference²³). Figur oprettet med Biorender.com. Klik her for at se en større version af denne figur.

I løbet af det sidste årti har stigende beviser, herunder flere rapporter fra vores forskningsgruppe, afsløret, at CP spiller en central rolle i sundhed og sygdom 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 . For eksempel er det kendt, at den aldrende blod-CSF-barriere viser morfologiske ændringer i blandt andet kernerne, mikrovilli og kældermembranen ^1,19. Derudover er den overordnede barriereintegritet kompromitteret i forbindelse med Alzheimers sygdom, og alle disse aldersrelaterede ændringer synes at være endnu mere udtalte ^1,8,20. Ud over morfologiske ændringer ændres CP’s transkriptom, proteom og sekretom under sygdom ^12,21,22,23. Således er avanceret viden om CP afgørende for bedre at forstå dens rolle i neurologiske sygdomme og potentielt udvikle nye terapeutiske strategier.

En effektiv metode til nøjagtig mikrodissektion af CP ud af hjernens ventrikler er det første uvurderlige skridt til at muliggøre korrekt undersøgelse af denne lille hjernestruktur. På grund af sin stærkt vaskulariserede natur (figur 2B) kan CP, der flyder inde i hjernens ventrikulære hulrum, identificeres ved hjælp af et kikkertmikroskop. Imidlertid kræves transkardieperfusion ofte til downstream-analyse, hvilket komplicerer korrekt identifikation og isolering af CP-vævet (figur 2C). Hvis de videre behandlingstrin tillader det (f.eks. i tilfælde af RNA- og proteinanalyse), kan CP visualiseres via transkardieperfusion med bromphenolblåt (figur 2A). Flere publikationer beskriver allerede isolationen af CP fra rotte²⁴ og musehvalpehjerner²⁵. Her beskrives en mikrodissektionsisoleringsteknik til isolering af CP fra voksne mus. Det er vigtigt, at denne isolationsteknik bevarer levedygtigheden, funktionen og strukturen af cellerne i CP. Isoleringen af CP, der flyder i fjerde og laterale ventrikler, er beskrevet her. Kort sagt bedøves musene terminalt og om nødvendigt transkardialt perfuserede. Det skal dog bemærkes, at perfusion kan beskadige strukturen af cellerne i CP. Hvis prøven skal analyseres ved hjælp af transmissionselektronmikroskopi (TEM), seriel blokfladescanningelektronmikroskopi (SBF-SEM) eller fokuseret ionstråle SEM (FIB-SEM), bør perfusion derfor ikke udføres. Dernæst isoleres hele hjernen, og tang bruges til sagittalt hemisect hjernen. Herfra kan CP’erne, der flyder i laterale ventrikler, identificeres og dissekeres, mens CP fra fjerde ventrikel kan isoleres fra den cerebellære side af hjernen.

Figur 2: Visualisering af (A-C) fjerde og (D-F) lateral ventrikel choroid plexus (CP) efter (A,D) bromphenolblå perfusion, (B,E) ingen perfusion og (C,F) perfusion med PBS/heparin. Billederne er taget med et stereomikroskop (8x-32x forstørrelse). Klik her for at se en større version af denne figur.

Når CP er korrekt dissekeret ud af hjernens ventrikler, kan et helt repertoire af teknikker anvendes til at få yderligere forståelse for funktionen af denne struktur. For eksempel kan flowcytometri eller enkeltcelle RNA-sekventering udføres for at kvantificere og fænotypisk analysere de infiltrerende inflammatoriske celler under visse sygdomstilstande^26,27. Ud over den cellulære sammensætning kan den molekylære sammensætning af CP analyseres for at vurdere tilstedeværelsen af cytokiner og kemokiner via enzymbundet immunosorbentassay (ELISA), immunoblot eller gennem samtidig analyse af flere cytokiner ved anvendelse af cytokinperlearrayet²⁸. Desuden kan transkriptom-, vaskulær-, immuncellehistologi og sekretomanalyser udføres på de mikrodissekerede CP-eksplanter²⁹. Her bruges scanningelektronmikroskopi (SEM) på helmonteret CP til at få et samlet overblik over CP-strukturen. SEM bruger en stråle af fokuserede elektroner til at scanne over overfladen og skabe et billede af overfladens topografi og sammensætning. Da elektronernes bølgelængde er meget mindre end lysets, er opløsningen af SEM i nanometerområdet og bedre end et lysmikroskop. Derfor kan morfologiske undersøgelser på det subcellulære niveau udføres via SEM. Kort fortalt overføres den dissekerede CP straks til et glutaraldehydholdigt fikseringsmiddel til en fiksering natten over efterfulgt af osmication og uranylacetatfarvning. Prøverne behandles derefter med blyaspartatplet, dehydreres og i sidste ende indlejres til billeddannelse.

Således letter denne protokol den effektive isolering af CP fra musehjerneventriklerne, som kan analyseres yderligere ved hjælp af en række nedstrømsteknikker til at undersøge dens struktur og funktion.