माउस कोरॉयड प्लेक्सस के माइक्रोडिसेक्शन और पूरे माउंट स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी विज़ुअलाइज़ेशन
Summary
कोरॉयड प्लेक्सस (सीपी), तंत्रिका विज्ञान में एक अंडरस्टडी ऊतक, केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के स्वास्थ्य और बीमारी में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। यह प्रोटोकॉल सीपी को अलग करने के लिए एक माइक्रोविच्छेदन तकनीक का वर्णन करता है और इसकी सेलुलर संरचना का समग्र दृश्य प्राप्त करने के लिए स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करता है।
Abstract
कोरॉयड प्लेक्सस (सीपी), मस्तिष्क के वेंट्रिकल्स में फैली एक अत्यधिक संवहनी संरचना, तंत्रिका विज्ञान में सबसे कम अध्ययन किए गए ऊतकों में से एक है। जैसा कि यह तेजी से स्पष्ट हो रहा है कि यह छोटी संरचना केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) के स्वास्थ्य और बीमारी में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है, मस्तिष्क वेंट्रिकल्स से सीपी को ठीक से विच्छेदित करना अत्यंत महत्वपूर्ण है जो डाउनस्ट्रीम प्रसंस्करण की अनुमति देता है, कार्यात्मक से संरचनात्मक विश्लेषण तक। यहां, विशेष उपकरण या उपकरण की आवश्यकता के बिना पार्श्व और चौथे मस्तिष्क वेंट्रिकल माउस सीपी का अलगाव वर्णित है। यह अलगाव तकनीक सीपी के भीतर कोशिकाओं की व्यवहार्यता, कार्य और संरचना को संरक्षित करती है। इसके उच्च वैस्कुलराइजेशन के कारण, सीपी को दूरबीन माइक्रोस्कोप का उपयोग करके मस्तिष्क के वेंट्रिकुलर गुहाओं के अंदर तैरते हुए देखा जा सकता है। हालांकि, डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए आवश्यक ट्रांसकार्डियल छिड़काव सीपी ऊतक की पहचान को जटिल कर सकता है। आगे के प्रसंस्करण चरणों (जैसे, आरएनए और प्रोटीन विश्लेषण) के आधार पर, इसे ब्रोमोफेनॉल नीले रंग के साथ ट्रांसकार्डियल छिड़काव के माध्यम से सीपी की कल्पना करके हल किया जा सकता है। अलगाव के बाद, सीपी को इस विशेष मस्तिष्क संरचना के कार्य पर और समझ हासिल करने के लिए आरएनए, प्रोटीन या एकल कोशिका विश्लेषण सहित कई तकनीकों का उपयोग करके संसाधित किया जा सकता है। यहां, संरचना का समग्र दृश्य प्राप्त करने के लिए पूरे माउंट सीपी पर स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एसईएम) का उपयोग किया जाता है।
Introduction
तंग बाधाएं केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) को परिधि से अलग करती हैं, जिसमें रक्त-मस्तिष्क बाधा (बीबीबी) और रक्त-मस्तिष्कमेरु द्रव (सीएसएफ) बाधा शामिल हैं। ये बाधाएं बाहरी अपमान के खिलाफ सीएनएस की रक्षा करती हैं और एक संतुलित और नियंत्रित माइक्रोएन्वायरमेंट 1,2,3 सुनिश्चित करती हैं। जबकि बीबीबी का समय के साथ बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है, कोरॉयड प्लेक्सस (सीपी) में स्थित रक्त-सीएसएफ बाधा ने पिछले दशक के दौरान केवल बढ़ती शोध रुचि प्राप्त की है। यह उत्तरार्द्ध बाधा मस्तिष्क के चार वेंट्रिकल्स (चित्रा 1 ए, बी) में पाई जा सकती है और एक केंद्रीय स्ट्रोमा, लीक केशिकाओं, फाइब्रोब्लास्ट और एक लिम्फोइड और माइलॉयड सेल आबादी (चित्रा 1 सी) 4,5,6 के आसपास कोरॉयड प्लेक्सस एपिथेलियल (सीपीई) कोशिकाओं की एक परत की विशेषता है।. सीपीई कोशिकाएं तंग जंक्शनों द्वारा मजबूती से जुड़ी होती हैं, इस प्रकार सीएसएफ और मस्तिष्क में अंतर्निहित फेनेस्टेड रक्त केशिकाओं से रिसाव को रोकती हैं। इसके अतिरिक्त, सीपीई कोशिकाओं में परिवहन को कई आंतरिक और बाहरी परिवहन प्रणालियों द्वारा नियंत्रित किया जाता है जो रक्त से सीएसएफ तक लाभकारी यौगिकों (जैसे, पोषक तत्वों और हार्मोन) की आमद और हानिकारक अणुओं (जैसे, चयापचय अपशिष्ट, अतिरिक्त न्यूरोट्रांसमीटर) के प्रवाह कोदूसरी दिशा में प्रबंधित करते हैं। अपने सक्रिय परिवहन कार्य को लागू करने में सक्षम होने के लिए, सीपीई कोशिकाओं में उनके साइटोप्लाज्म7 में कई माइटोकॉन्ड्रिया होते हैं। इसके अलावा, सीपी सीएसएफ का मुख्य स्रोत है और निवासीभड़काऊ कोशिकाओं की उपस्थिति से मस्तिष्क के द्वारपाल के रूप में कार्य करता है। रक्त और मस्तिष्क के बीच अपने अद्वितीय स्थान के कारण, सीपी भीप्रतिरक्षा निगरानी करने के लिए पूरी तरह से तैनात है।
चित्रा 1: कोरॉइड प्लेक्सस (सीपी) के स्थान और संरचना का योजनाबद्ध अवलोकन। (ए, बी) सीपी ऊतक (ए) मानव और (बी) माउस दिमाग के दो पार्श्व, तीसरे और चौथे वेंट्रिकल्स के भीतर पाया जाता है। (सी) सीपी ऊतक में कसकर जुड़े क्यूबॉइडल सीपी एपिथेलियम (सीपीई) कोशिकाओं की एक एकल परत होती है, जो फेनेस्टेड केशिकाओं, ढीले संयोजी ऊतक और लिम्फोइड और माइलॉयड कोशिकाओं के आसपास होती है, और रक्त-मस्तिष्कमेरु द्रव अवरोध (संदर्भ23 से अनुकूलित और संशोधित) बनाती है। Biorender.com के साथ बनाई गई आकृति। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
पिछले एक दशक में, हमारे शोध समूह की कई रिपोर्टों सहित बढ़ते सबूतों से पता चला है कि सीपी स्वास्थ्य और बीमारी 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 में एक केंद्रीय भूमिका निभाता है।. उदाहरण के लिए, यह ज्ञात है कि उम्र बढ़ने वाले रक्त-सीएसएफ अवरोध दूसरों के बीच, नाभिक, माइक्रोविली और तहखाने झिल्ली 1,19 में रूपात्मक परिवर्तन प्रदर्शित करते हैं। इसके अतिरिक्त, अल्जाइमर रोग के संदर्भ में, समग्र बाधा अखंडता से समझौता किया जाता है और ये सभी उम्र से संबंधित परिवर्तन 1,8,20 और भी अधिक स्पष्ट दिखाई देते हैं। रूपात्मक परिवर्तनों के अलावा, सीपी के प्रतिलेखन, प्रोटिओम और स्राव को रोग 12,21,22,23 के दौरान बदल दिया जाता है। इस प्रकार, न्यूरोलॉजिकल रोगों में इसकी भूमिका को बेहतर ढंग से समझने और संभावित रूप से नई चिकित्सीय रणनीतियों को विकसित करने के लिए सीपी का उन्नत ज्ञान आवश्यक है।
मस्तिष्क वेंट्रिकल्स से सीपी के सटीक सूक्ष्मविच्छेदन के लिए एक कुशल तरीका इस छोटे मस्तिष्क संरचना की उचित जांच की अनुमति देने के लिए पहला अमूल्य कदम है। इसकी अत्यधिक संवहनी प्रकृति (चित्रा 2 बी) के कारण, मस्तिष्क के वेंट्रिकुलर गुहाओं के अंदर तैरने वाले सीपी को दूरबीन माइक्रोस्कोप का उपयोग करके पहचाना जा सकता है। हालांकि, डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए अक्सर ट्रांसकार्डियल छिड़काव की आवश्यकता होती है, जो सीपी ऊतक की उचित पहचान और अलगाव को जटिल बनाता है (चित्रा 2 सी)। यदि आगे के प्रसंस्करण चरण अनुमति देते हैं (उदाहरण के लिए, आरएनए और प्रोटीन विश्लेषण के मामले में), सीपी को ब्रोमोफेनॉल ब्लू (चित्रा 2 ए) के साथ ट्रांसकार्डियल छिड़काव के माध्यम से देखा जा सकता है। कई प्रकाशन पहले से ही चूहे24 और माउस प्यूप दिमाग25 से सीपी के अलगाव का वर्णन करते हैं। यहां, वयस्क चूहों से सीपी को अलग करने के लिए एक सूक्ष्मविच्छेदन अलगाव तकनीक का वर्णन किया गया है। महत्वपूर्ण रूप से, यह अलगाव तकनीक सीपी के भीतर कोशिकाओं की व्यवहार्यता, कार्य और संरचना को संरक्षित करती है। चौथे और पार्श्व वेंट्रिकल्स में तैरने वाले सीपी का अलगाव यहां वर्णित है। संक्षेप में, चूहों को टर्मिनल रूप से एनेस्थेटाइज्ड किया जाता है और, यदि आवश्यक हो, तो ट्रांसकार्डियल रूप से संक्रमित किया जाता है। हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि छिड़काव सीपी के भीतर कोशिकाओं की संरचना को नुकसान पहुंचा सकता है। नतीजतन, यदि नमूने का विश्लेषण ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टीईएम), सीरियल ब्लॉक फेस स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एसबीएफ-एसईएम), या केंद्रित आयन बीम एसईएम (एफआईबी-एसईएम) का उपयोग करके किया जाना है, तो छिड़काव नहीं किया जाना चाहिए। इसके बाद, पूरे मस्तिष्क को अलग कर दिया जाता है, और मस्तिष्क को उत्तेजित करने के लिए बल का उपयोग किया जाता है। यहां से, पार्श्व वेंट्रिकल्स में तैरने वाले सीपी को पहचाना और विच्छेदित किया जा सकता है, जबकि चौथे वेंट्रिकल से सीपी को मस्तिष्क के अनुमस्तिष्क पक्ष से अलग किया जा सकता है।
चित्र 2: (ए, डी) ब्रोमोफेनॉल ब्लू छिड़काव के बाद (ए-सी) चौथे और (डी-एफ) पार्श्व वेंट्रिकल कोरॉइड प्लेक्सस (सीपी) का विज़ुअलाइज़ेशन, (बी, ई) कोई छिड़काव नहीं, और (सी, एफ) पीबीएस / हेपरिन के साथ छिड़काव। छवियों को स्टीरियो माइक्रोस्कोप (8x-32x आवर्धन) के साथ लिया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
एक बार जब सीपी को मस्तिष्क वेंट्रिकल्स से ठीक से विच्छेदित किया जाता है, तो इस संरचना के कार्य पर आगे की समझ हासिल करने के लिए तकनीकों का एक पूरा प्रदर्शन लागू किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, फ्लो साइटोमेट्री या एकल सेल आरएनए अनुक्रमण को कुछ रोग स्थितियों26,27 के तहत घुसपैठ करने वाली भड़काऊ कोशिकाओं को निर्धारित करने और फेनोटाइपिक रूप से विश्लेषण करने के लिए किया जा सकता है। सेलुलर संरचना के अलावा, सीपी की आणविक संरचना का विश्लेषण एंजाइम-लिंक्ड इम्यूनोसॉर्बेंट परख (एलिसा), इम्यूनोब्लॉट, या साइटोकिन बीड सरणी28 का उपयोग करके कई साइटोकिन्स के एक साथ विश्लेषण के माध्यम से साइटोकिन्स और केमोकाइन की उपस्थिति का आकलन करने के लिए किया जा सकता है। इसके अलावा, ट्रांसक्रिपटम, संवहनी, प्रतिरक्षा कोशिका हिस्टोलॉजी, और स्रावी विश्लेषण माइक्रोविच्छेदित सीपी एक्सप्लेंट29 पर किए जा सकते हैं। यहां, पूरे माउंट सीपी पर स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एसईएम) का उपयोग सीपी संरचना के समग्र दृश्य को प्राप्त करने के लिए किया जाता है। एसईएम सतह पर स्कैन करने और सतह की स्थलाकृति और संरचना की छवि बनाने के लिए केंद्रित इलेक्ट्रॉनों की एक किरण का उपयोग करता है। चूंकि इलेक्ट्रॉनों की तरंग दैर्ध्य प्रकाश की तुलना में बहुत छोटी है, इसलिए एसईएम का रिज़ॉल्यूशन नैनोमीटर रेंज में है और प्रकाश माइक्रोस्कोप से बेहतर है। संक्षेप में, विच्छेदित सीपी को रात भर के निर्धारण के लिए तुरंत ग्लूटाराल्डिहाइड युक्त फिक्सेटिव में स्थानांतरित कर दिया जाता है, इसके बाद ऑस्मिकेशन और यूरिनिल एसीटेट धुंधला हो जाता है। फिर नमूनों को लीड एस्पार्टेट दाग के साथ इलाज किया जाता है, निर्जलित किया जाता है, और अंततः इमेजिंग के लिए एम्बेडेड किया जाता है।
इस प्रकार, यह प्रोटोकॉल माउस मस्तिष्क वेंट्रिकल्स से सीपी के कुशल अलगाव की सुविधा प्रदान करता है, जिसे इसकी संरचना और कार्य की जांच के लिए विभिन्न डाउनस्ट्रीम तकनीकों का उपयोग करके आगे विश्लेषण किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां, पार्श्व वेंट्रिकल और माउस मस्तिष्क के चौथे वेंट्रिकल से कोरॉइड प्लेक्सस (सीपी) को अलग करने की एक विधि का वर्णन किया गया है। सीपी की यह पूरी बढ़ती विधि सीपी आकृति विज्ञान, सेलुलर संरचना, ट्रांसक्रि…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को बेल्जियन फाउंडेशन ऑफ अल्जाइमर रिसर्च (एसएओ; परियोजना संख्या: 20200032), रिसर्च फाउंडेशन फ्लैंडर्स (एफडब्ल्यूओ व्लाएंडरेन; परियोजना संख्या: 1268823 एन, 11 डी 0520 एन, 11 9 5021 एन) और बैलेट लैटोर फंड द्वारा समर्थित किया गया था। हम उपकरण पार्क में प्रशिक्षण, समर्थन और पहुंच के लिए वीआईबी बायोइमेजिंग कोर को धन्यवाद देते हैं।
Materials
| 26G x 1/2 needle | Henke Sass Wolf | 4710004512 | |
| Aluminium specimen mounts | EM Sciences | 75220 | |
| Cacodylate buffer | EM Sciences | 11652 | |
| Carbon steel surgial blades | Swann-Morton | 0210 | size: 0.45 mm x 12 mm |
| Carbon adhesive tabs -12 mm | EM Sciences | 77825-12 | |
| Critical point dryer | Bal-Tec | CPD030 | |
| Crossbeam 540 | Zeiss | SEM system | |
| Forceps | Fine Science Tools GmbH | 91197-00 | |
| Glutaraldehyde | EM Sciences | 16220 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H-3125 | |
| Ismatec Reglo ICC Digital Peristaltic pump 2-channel | Metrohm Belgium N.V | CPA-7800160 | |
| Osmium Tetroxide | EM Sciences | 19170 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Lonza | BE17-516F | |
| Platinum | Quorum | Q150T ES | PBS without Ca++ Mg++ or phenol red; sterile filtered |
| Sodium pentobarbital | Kela NV | 514 | |
| Specimen Basket Stainless Steel | EM Sciences | 70190-01 | |
| Stemi DV4 Stereo microscope | Zeiss | ||
| Surgical scissors | Fine Science Tools GmbH | 91460-11 |
Referencias
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