基于刀豆球蛋白A的沉降测定法，用于测量葡聚糖磷酸酶的底物结合

葡聚糖磷酸酶是蛋白酪氨酸磷酸酶 （PTP） 超家族¹ 中功能多样化的双重特异性磷酸酶 （DSP） 亚家族的成员。它们存在于大多数生命形式中，包括广泛不同的光合生物、人类、脊椎动物以及一些无脊椎动物和原生生物^2,3,4。植物含有三种已知的葡聚糖磷酸酶：淀粉过量4（SEX4），Like Four1（LSF1）和Like Four2（LSF2）^5,6,7。缺乏葡聚糖磷酸酶的植物显示出暂时淀粉降解和淀粉在叶片中积累的速率降低^8,9。拉福林是葡聚糖磷酸酶家族的创始成员，该家族使脊椎动物^和人类的糖原去磷酸化^3,10。拉福林的突变导致神经退行性拉福拉病，这是一种致命的常染色体隐性癫痫形式¹¹。葡聚糖磷酸酶是糖原和淀粉代谢所必需的，并且已成为调节植物淀粉含量和治疗神经退行性Lafora病的重要酶^12,13。最近对葡聚糖磷酸酶的X射线晶体学研究与模型葡聚糖底物揭示了底物结合和葡聚糖去磷酸化的催化机制^14,15,16,17。然而，目前对葡聚糖磷酸酶如何与其生理底物结合的理解是不完整的。

淀粉是由80%-90%支链淀粉和10%-20%直链淀粉¹⁸制成的葡萄糖不溶性聚合物。植物葡聚糖磷酸酶的底物是磷酸化的碳水化合物分子，如糖原和淀粉颗粒。磷酸化的葡萄糖基残基以1：600的磷酸：葡萄糖基残基比例存在。有趣的是，磷酸盐仅存在于支链淀粉分子¹⁹上。主要植物葡聚糖磷酸酶SEX4作用于淀粉颗粒以去磷酸化支链淀粉分子。SEX4的X射线晶体结构与结构引导的诱变研究相结合，证明了SEX4对葡聚糖结构内不同位置的独特底物特异性¹⁵。我们最近表明，SEX4的生物学相关活性只能在作用于其可溶的支链淀粉底物²⁰时观察到。然而，由于底物的结构复杂性、更广泛的结合特异性以及蛋白质与其底物之间的低结合亲和力，理解葡聚糖-SEX4 相互作用已被证明是困难的。这些问题阻碍了利用蛋白质-配体相互作用中常用的方法的能力，例如等温滴定量热法（ITC），核磁共振（NMR）波谱和基于酶联免疫吸附测定（ELISA）的测定。

有趣的是，我们对碳水化合物 – 蛋白质相互作用的大部分理解都来自研究凝集素。刀豆球蛋白A（ConA）是一种豆科凝集素家族，最初是从杰克豆中提取的蛋白质。ConA以高特异性结合碳水化合物，这有利于其在药物靶向和递送应用中的使用。ConA与含有非还原性α-D-甘露糖基和α-D-葡萄糖基的各种底物的结合已被广泛研究^19,20。市售ConA结合琼脂糖珠通常用于纯化糖蛋白和糖脂²¹。ConA通过葡萄糖残基的C3，C4和C6羟基与这些葡聚糖结合。ConA-琼脂糖珠也已成功用于测量糖原-蛋白质和淀粉-蛋白质相互作用的结合^22,23。在这项研究中，我们使用ConA-琼脂糖珠开发了一种结合测定法，以测量葡聚糖磷酸酶-支链淀粉相互作用的结合特异性。

以前，使用基于ConA的沉降测定来评估葡聚糖磷酸酶底物结合能力^14,20,24。在这项研究中，使用相同的策略开发了一种确定葡聚糖-葡聚糖磷酸酶和碳水化合物相互作用的结合亲和力的新方法。该方法在研究各种可溶的碳水化合物-蛋白质相互作用方面也具有优势。