Saggio verde malachite per la scoperta degli inibitori della proteina 90 da shock termico
Summary
Il protocollo di analisi del verde malachite è un metodo semplice ed economico per scoprire i soppressori della proteina da shock termico 90 (Hsp90) e altri composti inibitori contro gli enzimi ATP-dipendenti.
Abstract
La proteina da shock termico 90 (Hsp90) è un promettente bersaglio antitumorale a causa del suo effetto chaperoning su più proteine oncogeniche. L’attività di Hsp90 dipende dalla sua capacità di idrolizzare l’adenosina trifosfato (ATP) in adenosina difosfato (ADP) e fosfato libero. L’attività ATPasi di Hsp90 è legata alla sua funzione chaperoning; L’ATP si lega al dominio N-terminale dell’Hsp90 e interrompere il suo legame si è rivelata la strategia di maggior successo nel sopprimere la funzione Hsp90. L’attività dell’ATPasi può essere misurata mediante un saggio colorimetrico di verde malachite, che determina la quantità di fosfato libero formato dall’idrolisi dell’ATP. Qui viene descritta una procedura per determinare l’attività dell’ATPasi del lievito Hsp90 utilizzando il kit di analisi del fosfato verde malachite. Inoltre, vengono fornite istruzioni dettagliate per la scoperta degli inibitori Hsp90 assumendo geldanamicina come inibitore autentico. Infine, viene discussa l’applicazione di questo protocollo di analisi attraverso lo screening ad alta produttività (HTS) di molecole inibitrici contro il lievito Hsp90.
Introduction
La proteina da shock termico 90 (Hsp90) è un chaperone molecolare che mantiene la stabilità delle proteine responsabili dello sviluppo e della progressione del cancro. Inoltre, le proteine responsabili dello sviluppo della resistenza agli agenti antineoplastici sono anche clienti di Hsp901. Hsp90 è sovraespresso ubiquitariamente in tutti i tipi di cellule tumorali (>90% delle proteine cellulari), rispetto alle cellule normali dove può costituire meno del 2% delle proteine totali. Inoltre, l’Hsp90 delle cellule tumorali risiede in un complesso con co-chaperoni, mentre in una cellula normale è presente prevalentemente in uno stato libero e non complessato 2,3. Negli ultimi anni, diversi inibitori di Hsp90 hanno dimostrato di possedere effetti senolitici in studi in vitro e in vivo, dove hanno migliorato significativamente la durata della vita dei topi 4,5,6. Tutti i risultati di cui sopra confermano il fatto che gli inibitori Hsp90 potrebbero essere efficaci in più tipi di cancro, con meno effetti avversi e minori possibilità di sviluppare resistenza. La funzione chaperoning di Hsp90 si ottiene legando l’ATP al dominio N-terminale di Hsp90 e idrolizzandolo in ADP e fosfato libero7. Piccole molecole che si legano in modo competitivo alla tasca di legame ATP di Hsp90 sono state trovate per sopprimere con successo l’effetto chaperoning della proteina. Ad oggi, questa rimane la migliore strategia per l’inibizione di Hsp90, che è supportata dal fatto che tali inibitori hanno raggiunto studi clinici8. Uno di questi, Pimitespib, è stato approvato in Giappone per il trattamento del tumore stromale gastrointestinale (GIST) nel giugno 20229. Questo è il primo inibitore Hsp90 approvato da quando la farmacogabilità dello chaperone è stata stabilita nel 199410.
Il test del verde malachite è una procedura semplice, sensibile, veloce ed economica per la rilevazione del fosfato inorganico, adatta per l’automazione e lo screening ad alta produttività (HTS) dei composti rispetto al target desiderato11. Il test è stato impiegato con successo per lo screening degli inibitori Hsp90 in piccole configurazioni su scala di laboratorio, nonché in un HTS 12,13,14,15,16,17. Il test utilizza un metodo colorimetrico che determina il fosfato inorganico libero formato a causa dell’attività ATPasi di Hsp90. La base di questa quantificazione è la formazione di un complesso fosfomolibdato tra fosfato libero e molibdeno, che successivamente reagisce con il verde malachite per generare un colore verde (Figura 1). Questa rapida formazione di colore viene misurata su uno spettrofotometro, o su un lettore di piastre, tra 600-660 nm18,19.
Nel presente protocollo, viene descritta la procedura per eseguire un test verde malachite con lievito Hsp90 e successiva identificazione degli inibitori contro lo chaperone. La molecola del prodotto naturale, la geldanamicina (GA), con la quale è stata stabilita per la prima volta la farmacogabilità di Hsp90, è stata assunta come un autentico inibitore10. L’HTS è diventato parte integrante dell’attuale programma di scoperta di farmaci, grazie alla disponibilità di un gran numero di molecole per i test. Questa tecnica ha acquisito maggiore importanza negli ultimi 2 anni a causa dell’urgente necessità di riutilizzare i farmaci per il trattamento dell’infezione da Covid-1920,21. Pertanto, viene presentato uno schema dettagliato per l’HTS delle molecole contro la proteina Hsp90 del lievito adottando il metodo del saggio verde malachite.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hsp90 è un obiettivo significativo per la scoperta di nuove molecole di farmaci antitumorali. Da quando la sua farmacogabilità è stata stabilita nel 199410, 18 molecole hanno raggiunto studi clinici. Attualmente, sette molecole sono in varie fasi di studi clinici, da sole o in combinazione22. Tutte queste piccole molecole sono inibitori leganti l’ATP N-terminali. Gli altri mezzi per inibire il chaperone (inibitori C-terminali, inibitori del dominio medio) non hanno proce…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato sostenuto dal programma Korea Research Fellowship (KRF), borsista post-dottorato della National Research Foundation of Korea (NRF), finanziato dal ministero della scienza e delle TIC (NRF-2019H1D3A1A01102952). Gli autori sono grati alla sovvenzione intramurale KIST e alla sovvenzione numero 2MRB130 del Ministero degli Oceani e della Pesca per aver fornito assistenza finanziaria a questo progetto.
Materials
| 1M Magnesium chloride solution in water | Sigma-Aldrich | 63069-100ml | |
| 1M Potassium chloride solution in water | Sigma-Aldrich | 60142-100ml | |
| 96-well plate | SPL Life Sciences | Not applicable | |
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A7699-5G | |
| Biomek FX laboratory automation workstation | Beckman Coulter | Not applicable | |
| Compounds 3-96 | Not applicable | Not applicable | Histidine tagged yeast Hsp90 was obtained from Dr. Chrisostomos Prodromou, School of Life Sciences, University of Sussex, United Kingdom, and protein was expressed in KIST Gangneung Institute of Natural Products. Details cannot be disclosed due to patent infringement issues. |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Geldanamycin, 99% (HPLC), powder | AK Scientific, Inc. | V2064 | |
| Invitroge UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | ThermoFisher Scientific | 10977015 | |
| Malachite Green Phosphate Assay Assay kit | Sigma-Aldrich | MAK307-1KT | |
| Multi-Detection Microplate Reader Synergy HT | Biotek Instruments, Inc. | Not applicable | |
| Synergy HT multi-plate reader | Biotek Instruments, Inc. | Not applicable | |
| Trizma hydrochloride buffer solution, pH7.4 | Sigma-Aldrich | 93313-1L | |
| Yeast Hsp90 | Not applicable | Not applicable | School of Life Sciences, University of Sussex, United Kingdom and protein was expressed in KIST Gangneung Institute of Natural Products. Primary Accession number: P02829 |
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