Размножение вирусов и клеточная колориметрическая количественная оценка
Summary
В настоящем протоколе описывается распространение вируса Зика (ZIKV) в клетках почек африканской зеленой мартышки Vero и количественная оценка ZIKV с использованием клеточных колориметрических методов иммунодетекции в 24-луночном и 96-луночном (высокопроизводительном) форматах.
Abstract
Вирус Зика (ZIKV) — это вирус, переносимый комарами, принадлежащий к роду Flavivirus. Инфекция ZIKV была связана с врожденными аномалиями головного мозга и, возможно, синдромом Гийена-Барре у взрослых. Исследования ZIKV для понимания механизмов заболевания важны для облегчения разработки вакцин и методов лечения. Метод количественной оценки вирусов является решающим и основополагающим в области вирусологии. Фокусообразующий анализ (FFA) – это количественный анализ вируса, который обнаруживает вирусный антиген с антителами и идентифицирует инфекционные очаги клеток с помощью метода иммуноокрашивания пероксидазой. В настоящем исследовании описывается протокол распространения вируса и количественного определения с использованием 24-луночного и 96-луночного форматов (с высокой пропускной способностью). По сравнению с другими подобными исследованиями, в этом протоколе дополнительно описана оптимизация размеров очагов, что может служить руководством для расширения использования этого анализа для других вирусов. Во-первых, размножение ZIKV производится в клетках Vero в течение 3 дней. Культуру надосадочной жидкости, содержащую ZIKV, собирают и количественно определяют с помощью FFA. Вкратце, культуру вируса инокулируют в клетки Vero и инкубируют в течение 2-3 дней. Образование очагов определяется после оптимизированных процессов окрашивания, включая фиксацию клеток, пермеабилизацию, блокировку, связывание антител и инкубацию с субстратом пероксидазы. Окрашенные вирусные очаги визуализируют с помощью стереомикроскопа (ручной подсчет в 24-луночном формате) или программного анализатора (автоматизированный подсчет в 96-луночном формате). FFA обеспечивает воспроизводимые, относительно быстрые результаты (3-4 дня) и подходит для использования для различных вирусов, включая вирусы, не образующие бляшек. Впоследствии этот протокол полезен для изучения инфекции ZIKV и может быть использован для обнаружения других клинически значимых вирусов.
Introduction
Инфекция, вызванная вирусом Зика (ZIKV), является новым вирусным заболеванием, переносимым комарами. Первая изоляция ZIKV была в Уганде в 1947 г. 1,2; С 1947 по 2007 год она оставалась без внимания, поскольку клинические симптомы чаще всего протекают бессимптомно и характеризуются самоизлечивающимся лихорадочным заболеванием. В 2007 г. эпидемия вируса Зика началась на островах Яп 3,4, за ней последовали более крупные эпидемии в регионах Тихого океана (Французская Полинезия, остров Пасхи, острова Кука и Новая Каледония) с 2013 по 2014 гг. 5,6,7,8, где впервые было зарегистрировано тяжелое неврологическое осложнение синдром Гийена-Барре (СГБ) у взрослых 9. В течение 2015 и 2016 гг. первая широкомасштабная эпидемия ZIKV охватила Северную и Южную Америку после появления азиатского генотипа ZIKV в Бразилии уже в 2013 г.10. Во время этой вспышки было зарегистрировано от 440 000 до 1,3 миллиона случаев микроцефалии и других неврологических расстройств у новорожденных. В настоящее время не существует специфического лекарства или лечения инфекции ZIKV; Таким образом, существует острая медицинская потребность в вакцинах ZIKV, способных предотвращать инфекции, особенно во время беременности.
Количественная оценка вирусов — это процесс определения количества вирусов, присутствующих в образце. Он играет важную роль в исследованиях, а академические лаборатории охватывают множество областей, таких как медицина и науки о жизни. Этот процесс также важен в коммерческих секторах, таких как производство вирусных вакцин, рекомбинантных белков, вирусных антигенов или противовирусных средств. Для количественного определения вируса можно использовать множество методов или анализов12. Выбор методов или анализов обычно зависит от характеристик вируса, желаемого уровня точности и характера эксперимента или исследования. В целом, методы количественной оценки вирусов можно разделить на две категории: молекулярные анализы, которые обнаруживают присутствие вирусных нуклеиновых кислот (ДНК или РНК), и анализы, которые измеряют инфекционность вируса in vitro12. Количественная полимеразная цепная реакция (кПЦР, для ДНК) или количественная полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (кОТ-ПЦР, для РНК)13 и цифровая капельная ПЦР14 являются примерами распространенных молекулярных методов, используемых для количественного определения вирусной нуклеиновой кислоты в данном образце15. Однако эти высокочувствительные молекулярные методы не позволяют дифференцировать жизнеспособные и нежизнеспособные вирусы15. Таким образом, исследования, требующие информации о биологических особенностях, таких как заразность вируса на клетках, не могут быть завершены с использованием вышеупомянутых молекулярных методов; Необходимы анализы, которые могут измерять и определять наличие жизнеспособных вирусов. Анализы, которые измеряют инфекционность вируса, включают бляшеобразующий анализ (PFA), 50% инфекционную дозу тканевой культуры (TCID50), флуоресцентный фокусный анализ и просвечивающую электронную микроскопию (ПЭМ)12.
PFA, разработанный Ренато Дульбекко в 1952 году, является одним из наиболее часто используемых методов титрования вирусов, в том числе для ZIKV16. Он используется для непосредственного определения вирусных концентраций для инфекционных литических вирионов. Метод основан на способности литического вируса продуцировать цитопатические эффекты (CPE; зоны клеточной гибели или бляшки, область инфекции, окруженная неинфицированными клетками) в монослое инокулированной клетки после вирусной инфекции. Однако у анализа есть несколько недостатков, которые влияют на его полезность. Анализ занимает много времени (занимает примерно 7-10 дней, в зависимости от вирусов), зависит от CPE и подвержен ошибкам. В настоящем исследовании мы сообщаем об иммуноколориметрическом методе, фокусообразующем анализе (FFA), для обнаружения и количественного определения ZIKV в форматах 24-луночных и 96-луночных планшетов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Существует несколько тестов для определения титра вируса; PFA имеет аналогичный протокол количественного определения вируса, что и FFA, в котором вирусный инокулят разбавляется, чтобы можно было различить отдельные бляшки или очаги. После окрашивания каждый налет или очаг указывает на н?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование получило поддержку от Министерства высшего образования Малайзии в рамках Схемы долгосрочных исследовательских грантов (LRGS MRUN Phase 1: LRGS MRUN/F1/01/2018) и финансирование программы Центра передового опыта высших учебных заведений (HICoE) (MO002-2019). Рисунок 3 в этом исследовании, показывающий рабочий процесс окрашивания для анализа с образованием очагов, адаптирован из «Иммуногистохимии DAB» BioRender.com (2022). Источник — https://app.biorender.com/biorender-templates/t-5f3edb2eb20ace00af8faed9-dab-immunohistochemistry.
Materials
| 0.22 µm Polyethersulfone syringe filter | Sartorius | S6534-FMOSK | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Nest | 615601 | |
| 10 mL sterile serological pipette | Labserv | 14955156 | |
| 1x Dulbecco’s phosphate-buffered saline (dPBS) | Gibco | 14190-136 | |
| 2.0 mL Screw cap tube | Axygen | SCT-200-SS-C-S | |
| 24-well plate | Corning | 3526 | |
| 25 mL Sterile serological pipettes | Labserv | 14955157 | |
| 3,3'Diaminobenzidine (DAB) peroxidase substrate | Thermo Scientific | 34065 | |
| 37 °C incubator with 5% CO2 | Sanyo | MCO-18AIC | |
| 5 mL sterile serological pipette | Labserv | 14955155 | |
| 50 mL centrifuge tube | Falcon | LAB352070 | |
| 75 cm2 tissue culture flask | Corning | 430725U | |
| 96-well plate | Falcon | 353072 | |
| Anti-flavivirus monoclonal antibody, 4G2 (clone D1-4G2-4-15) | MilliporeSigma | MAB10216 | |
| Autoclaved 20x Phosphate buffered saline (PBS) | N/A | N/A | 22.8 g of 8 mM Na2HPO4, 4.0 g of 1.5 mM KH2PO4, 160 g of 0.14 M NaCl, 4.0 g of 2.7 mM KCl, 1 L of MilliQ H2O |
| Biological safety cabinet, Class II | Holten | HB2448 | |
| CTL S6 Universal ELISpot/FluoroSpot Analyzer | ImmunoSpot, Cellular Technology Limited (CTL) | CTL-S6UNV12 | Commercial software analyzer |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 12800-017 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Bovogen | SFBS | |
| Goat anti-mouse IgG secondary antibody conjugated with horseradish peroxidase (HRP) | MilliporeSigma | 12-349 | |
| Hemacytometer | Laboroptik LTD | Neubauer improved | |
| IGEPAL CA-630 detergent | Sigma-Aldrich | I8896 | Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanolIGEPAL |
| Inverted microscope | ZEISS | TELAVAL 31 | |
| Laboratory rocker | FINEPCR | CR300 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Low viscosity carboxymethyl cellulose (CMC) | Sigma-Aldrich | C5678 | |
| Multichannel micropipette (10 – 100 µL) | Eppendorf | 3125000036 | |
| Multichannel micropipette (30 – 300 µL) | Eppendorf | 3125000052 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Single channel pipettes (10 – 100 µL) | Eppendorf | 3123000047 | |
| Single channel pipettes (100 – 1000 µL) | Eppendorf | 3123000063 | |
| Single channel pipettes (20 – 200 µL) | Eppendorf | 3123000055 | |
| Skim milk | Sunlac Low Fat | N/A | Prepare 3% Skim milk in 1x PBS for blocking stage in staining |
| Sodium Hypochlorite | Clorox | N/A | To disinfect any discarded infectious liquid waste from flasks/plates |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1000 | |
| Syringe disposable, Luer Lock, 10 mL with 21 G Needle | Terumo | SS10L21G | |
| Vero African green monkey kidney cells | – | ECACC 88020401 | Received from collaborator. However, Vero cells obtained from other suppliers should be able to be used with some optimization. |
Referencias
- Dick, G. W. A., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. Zika virus. I. Isolations and serological specificity. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 46 (5), 509-520 (1952).
- Dick, G. W. A., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. Zika virus. II. Pathogenicity and physical properties. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 46 (5), (1952).
- Duffy, M. R., et al. Zika virus outbreak on Yap Island, Federated States of Micronesia. The New England Journal of Medicine. 360 (24), 2536-2543 (2009).
- Musso, D., Nilles, E. J., Cao-Lormeau, V. M. Rapid spread of emerging Zika virus in the Pacific area. Clinical Microbiology and Infection. 20 (10), O595-O596 (2014).
- Cao-Lormeau, V. -. M., et al. Zika virus, French polynesia, South pacific, 2013. Emerging Infectious Diseases. 20 (6), 1085-1086 (2014).
- Dupont-Rouzeyrol, M., et al. Co-infection with Zika and dengue viruses in 2 patients, New Caledonia, 2014. Emerging Infectious Diseases. 21 (2), 381-382 (2015).
- Roth, A., et al. Concurrent outbreaks of dengue, chikungunya and Zika virus infections-an unprecedented epidemic wave of mosquito-borne viruses in the Pacific 2012-2014. Euro Surveillance. 19 (41), 20929 (2014).
- Tognarelli, J., et al. A report on the outbreak of Zika virus on Easter Island, South Pacific, 2014. Archives of Virology. 161 (3), 665-668 (2016).
- Oehler, E., et al. Zika virus infection complicated by Guillain-Barre syndrome-case report, French Polynesia, December 2013. Euro Surveillance. 19 (9), 20720 (2014).
- Faria, N. R., et al. Zika virus in the Americas: early epidemiological and genetic findings. Science. 352 (6283), 345-349 (2016).
- Rapid risk assessment: Zika virus epidemic in the Americas: potential association with microcephaly and Guillain-Barré syndrome – 4th update. European Centre for Disease Prevention and Control Available from: https://www.ecdc.europa.eu/en/publications-data/rapid-risk-assessment-zika-virus-epidemic-americas-potential-association (2015)
- Payne, S. Methods to study viruses. Viruses. , 37-52 (2017).
- Bustin, S. A., Mueller, R. Real-time reverse transcription PCR (qRT-PCR) and its potential use in clinical diagnosis. Clinical Science. 109 (4), 365-379 (2005).
- Sedlak, R. H., Jerome, K. R. Viral diagnostics in the era of digital polymerase chain reaction. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 75 (1), 1-4 (2013).
- Bae, H. -. G., Nitsche, A., Teichmann, A., Biel, S. S., Niedrig, M. Detection of yellow fever virus: a comparison of quantitative real-time PCR and plaque assay. Journal of Virological Methods. 110 (2), 185-191 (2003).
- Dulbecco, R. Production of plaques in monolayer tissue cultures by single particles of an animal virus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 38 (8), 747-752 (1952).
- Nahapetian, A. T., Thomas, J. N., Thilly, W. G. Optimization of environment for high density Vero cell culture: effect of dissolved oxygen and nutrient supply on cell growth and changes in metabolites. Journal of Cell Science. 81, 65-103 (1986).
- Agbulos, D. S., Barelli, L., Giordano, B. V., Hunter, F. F. Zika virus: quantification, propagation, detection, and storage. Current Protocols in Microbiology. 43, (2016).
- Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus. Current Protocols in Microbiology. 31, (2013).
- Bolívar-Marin, S., Bosch, I., Narváez, C. F. Combination of the focus-forming assay and digital automated imaging analysis for the detection of dengue and Zika viral loads in cultures and acute disease. Journal of Tropical Medicine. 2022, 2177183 (2022).
- Dangsagul, W., et al. Zika virus isolation, propagation, and quantification using multiple methods. PLoS One. 16 (7), e0255314 (2021).
- Brien, J. D., et al. Genotype-specific neutralization and protection by antibodies against dengue virus type 3. Journal of Virology. 84 (20), 10630-10643 (2010).
- Lazear, H. M., et al. A mouse model of Zika virus pathogenesis. Cell Host & Microbe. 19 (5), 720-730 (2016).
- Miner, J. J., et al. Zika virus infection during pregnancy in mice causes placental damage and fetal demise. Cell. 165 (5), 1081-1091 (2016).
- Kang, W., Shin, E. -. C. Colorimetric focus-forming assay with automated focus counting by image analysis for quantification of infectious hepatitis C virions. PLoS One. 7 (8), e43960 (2012).
- Brien, J. D., et al. Isolation and quantification of Zika virus from multiple organs in a mouse. Journal of VIsualized Experiments. (150), e59632 (2019).
- Payne, A. F., Binduga-Gajewska, I., Kauffman, E. B., Kramer, L. D. Quantitation of flaviviruses by fluorescent focus assay. Journal of Virological Methods. 134 (1-2), 183-189 (2006).
- Moser, L. A., et al. Growth and adaptation of Zika virus in mammalian and mosquito cells. PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (11), e0006880 (2018).
- Ishimine, T., Tadano, M., Fukunaga, T., Okuno, Y. An improved micromethod for infectivity assays and neutralization tests of dengue viruses. Biken Journal. 30 (2), 39-44 (1987).
- Leiva, S., et al. Application of quantitative immunofluorescence assays to analyze the expression of cell contact proteins during Zika virus infections. Virus Research. 304, 198544 (2021).
- Lee, E. M., Titus, S. A., Xu, M., Tang, H., Zheng, W. High-throughput Zika viral titer assay for rapid screening of antiviral drugs. ASSAY and Drug Development Technologies. 17 (3), 128-139 (2019).
