इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री द्वारा असामान्य प्रियन प्रोटीन का पता लगाना
Summary
इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री प्रोटोकॉल का उपयोग करके इम्यूनोलेबलिंग असामान्य प्रियन प्रोटीन के लिए विशिष्ट नमूना और एंटी-पीआरपी एंटीबॉडी तैयारी पद्धतियों की आवश्यकता होती है। वर्तमान प्रोटोकॉल उचित पीआरपी इम्यूनोलेबलिंग सुनिश्चित करने और गैर-विशिष्ट पृष्ठभूमि धुंधलापन को कम करने के लिए एपिटोप डिमास्किंग में प्रमुख चरणों का वर्णन करता है। इसके अलावा, यह दृष्टिकोण प्रियन-संक्रमित ऊतकों के साथ इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री अध्ययन करते समय जैव सुरक्षा उपायों पर विचार करता है।
Abstract
असामान्य प्रियन प्रोटीन (पीआरपीएससी) सेलुलर प्रियन प्रोटीन के रोग से जुड़े आइसोफॉर्म और ट्रांसमिसिबल स्पंजीफॉर्म एन्सेफैलोपैथिस (टीएसई) के नैदानिक मार्कर हैं। ये न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग मनुष्यों और कई जानवरों की प्रजातियों को प्रभावित करते हैं और इसमें स्क्रैपी, जूनोटिक गोजातीय स्पंजीफॉर्म एन्सेफैलोपैथी (बीएसई), क्रोनिक वेस्टिंग डिजीज ऑफ सेरविड्स (सीडब्ल्यूडी), और नए पहचाने गए ऊंट प्रियन रोग (सीपीडी) शामिल हैं। टीएसई का निदान एन्सेफैलॉन ऊतकों पर इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी) और पश्चिमी इम्यूनोब्लोट विधियों (डब्ल्यूबी) दोनों के आवेदन द्वारा पीआरपीएससी के इम्यूनोडिटेक्शन पर निर्भर करता है, अर्थात्, ब्रेनस्टेम (ओबेक्स स्तर)। आईएचसी एक व्यापक रूप से इस्तेमाल की जाने वाली विधि है जो एक ऊतक अनुभाग की कोशिकाओं में रुचि के एंटीजन के खिलाफ प्राथमिक एंटीबॉडी (मोनोक्लोनल या पॉलीक्लोनल) का उपयोग करती है। एंटीबॉडी-एंटीजन बाइंडिंग को एक रंग प्रतिक्रिया द्वारा देखा जा सकता है जो ऊतक या कोशिका के क्षेत्र में स्थानीयकृत रहता है जहां एंटीबॉडी को लक्षित किया गया था। जैसे, प्रियन रोगों में, अनुसंधान के अन्य क्षेत्रों की तरह, इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री तकनीकों का उपयोग न केवल नैदानिक उद्देश्यों के लिए किया जाता है, बल्कि रोगजनन अध्ययनों में भी किया जाता है। इस तरह के अध्ययनों में नए प्रियन उपभेदों की पहचान करने के लिए पहले वर्णित लोगों से पीआरपीएससी पैटर्न और प्रकारों का पता लगाना शामिल है। चूंकि बीएसई मनुष्यों को संक्रमित कर सकता है, इसलिए यह सिफारिश की जाती है कि जैव सुरक्षा प्रयोगशाला स्तर -3 (बीएसएल -3) सुविधाओं और / या प्रथाओं का उपयोग टीएसई निगरानी में शामिल मवेशियों, छोटे जुगाली करने वालों और सेरविड नमूनों को संभालने के लिए किया जाता है। इसके अतिरिक्त, संदूषण को सीमित करने के लिए, जब भी संभव हो, रोकथाम और प्रियन-समर्पित उपकरणों की सिफारिश की जाती है। पीआरपीएससी आईएचसी प्रक्रिया में एक फॉर्मिक एसिड एपिटोप-डिमास्किंग चरण होता है जो प्रियन निष्क्रियता उपाय के रूप में भी कार्य करता है, क्योंकि इस तकनीक में उपयोग किए जाने वाले फॉर्मेलिन-फिक्स्ड और पैराफिन-एम्बेडेड ऊतक संक्रामक रहते हैं। परिणामों की व्याख्या करते समय, लक्ष्य लेबलिंग से गैर-विशिष्ट इम्यूनोलेबलिंग को अलग करने के लिए ध्यान रखा जाना चाहिए। इस उद्देश्य के लिए, ज्ञात टीएसई-नकारात्मक नियंत्रण जानवरों में प्राप्त इम्यूनोलेबलिंग की कलाकृतियों को पहचानना महत्वपूर्ण है ताकि विशिष्ट पीआरपीएससी इम्यूनोलेबलिंग प्रकारों से अलग किया जा सके, जो टीएसई उपभेदों, मेजबान प्रजातियों और पीआरएनपी जीनोटाइप के बीच भिन्न हो सकते हैं, जो यहां वर्णित हैं।
Introduction
प्रियन परिकल्पना के अनुसार, असामान्य आइसोफॉर्म (पीआरपीएससी) संक्रामक स्पंजीफॉर्म एन्सेफैलोपैथिस (टीएसई) में संक्रामक एजेंट का प्राथमिक, या एकमात्र घटक है। टीएसई के निदान के लिए पुष्टि इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी) प्रोटोकॉल और / या एन्सेफैलोनऊतकों के पश्चिमी इम्यूनोब्लोट विधियों (डब्ल्यूबी) के आवेदन द्वारा पीआरपीएससी के इम्यूनोडिटेक्शन पर निर्भर करती है।
आईएचसी एक ऐसी विधि है जो मोनोक्लोनल या, कुछ मामलों में, पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी (प्राथमिक एंटीबॉडी के रूप में) को एक ऊतक खंड की कोशिकाओं में स्थित विशेष रूप से लक्षित एंटीजन के इम्यूनोस्टेनिंग में पहले कदम के रूप में नियोजित करती है। किसी भी प्रभावी प्राथमिक एंटीबॉडी-एंटीजन बाइंडिंग को तब प्राथमिक एंटीबॉडी के लिए विशिष्ट द्वितीयक एंटीबॉडी का उपयोग करके देखा जाता है। ये द्वितीयक एंटीबॉडी एंजाइमों के लिए संयुग्मित होते हैं, जैसे हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज (एचआरपी) या क्षारीय फॉस्फेट (एपी)। विज़ुअलाइज़ेशन तब इन एंजाइमों में एक सब्सट्रेट जोड़कर प्राप्त किया जाता है, उन क्षेत्रों में स्थानीयकृत अघुलनशील रंग उत्पादों का उत्पादन करता है जहां प्राथमिक एंटीबॉडी लक्षित एंटीजन से बंधे होते हैं। बेहतर विज़ुअलाइज़ेशन को काउंटरस्टेनिंग द्वारा प्राप्त किया जा सकता है, जिसमें एक डाई का उपयोग इम्यूनोलेबल और अन-इम्यूनोलेबल ऊतक2 के बीच एक अंतर बनाने के लिए किया जाता है।
फॉर्मेलिन-फिक्स्ड पैराफिन-एम्बेडेड ऊतकों (एफएफपीई) का उपयोग करके आईएचसी के साथ, फॉर्मेलिन निर्धारण फॉर्मलाडेहाइड द्वारा क्रॉस-लिंकिंग और पैराफिन एम्बेडिंग के दौरान हीटिंग और निर्जलीकरण के कारण प्राथमिक एंटीबॉडी की प्रभावशीलता को समाप्त कर सकता है। ये प्रोटीन की रचना को बदलते हैं, एपिटोप्स को नष्ट, विकृत या मास्क करते हैं, इस प्रकार उनकीपहचान को कम या निरस्त करते हैं। जैसे, इसके लिए एंटीजन पुनर्प्राप्ति (एआर) की आवश्यकता होती है। एआर तकनीक एंटीजेनिक अणुओं में फॉर्मलाडेहाइड से संबंधित रासायनिक समूह क्रॉस-लिंकिंग को बाधित करती है, इस प्रकार मूल एंटीजन-प्रोटीन रचना को बहाल या अनमास्क करती है। इसके परिणामस्वरूप इम्यूनोलेबलिंग के लिए एंटीबॉडी-एंटीजन (एपिटोप) आत्मीयता को पुनर्प्राप्त किया जाता है। एआर की अंतिम प्रभावकारिता लक्षित एंटीजन और / या प्राथमिक एंटीबॉडी 2 के गुणों पर निर्भर करतीहै।
गर्मी-प्रेरित एंटीजन (एपिटोप) पुनर्प्राप्ति (एचआईईआर) एआर3 की एक प्रक्रिया है और इसका उपयोग नियमित रूप से पीआरपीएससी आईएचसी का पता लगाने के लिए किया जाता है, जैसा कि यहां वर्णित है। आईएचसी निदान के लिए आवश्यक है और पैथोलॉजी से जुड़े एंटीजन के ऊतक वितरण को निर्धारित करने के लिए अनुसंधान प्रयोगशालाओं में उपयोग किया जाता है। यह व्यापक रूप से कैंसर, तंत्रिका विज्ञान और संक्रामकरोगों 4 के निदान और शोध में उपयोग किया जाता है। टीएसई के लिए, आईएचसी प्राकृतिक मेजबानों और प्रयोगात्मक मॉडल में पीआरपीएससी वितरण की पुष्टि और जांच के लिए निदान और अनुसंधान में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। आईएचसी प्रियन रोगजनन अध्ययन और पीआरपी एससी जमाव प्रकारों और पैटर्न के विश्लेषण में योगदान देताहै , अर्थात्, तंत्रिका ऊतक5 में, नियमित रूप से वर्णित संक्रमणों से विचलन का पता लगाने और कथित नए प्रियन उपभेदों की पहचान करने के लिए।
चूंकि बोवाइन स्पंजीफॉर्म एन्सेफैलोपैथी (बीएसई) के प्रियन मनुष्यों को संक्रमित कर सकते हैं, बीएसई के साथ काम में शामिल कुछ प्रयोगशाला प्रोटोकॉल को बीएसएल -3 सुविधाओं और प्रथाओं 6 के उपयोग की आवश्यकता हो सकतीहै। इनमें संस्थान और प्रयोगशाला के भीतर संभावित बीएसई संक्रमित ऊतक नमूनों के परिवहन के लिए एक सीलबंद माध्यमिक कंटेनर का उपयोग करना शामिल है। इसमें जब भी संभव हो बीएसई अनुसंधान और विश्लेषण के लिए नियंत्रण क्षेत्रों और प्रियन-समर्पित उपकरणों को नामित करना भी शामिल है। यह कार्य क्षेत्र के बाहर संदूषण को रोकने और एक सीमित स्थान प्रदान करने के लिए किया जाता है क्योंकि परिशोधन प्रक्रियाएं आवश्यक हो जाती हैं।
तदनुसार, आईएनआईएवी की पैथोलॉजी प्रयोगशाला टीएसई निगरानी से जुड़े मवेशियों, छोटे जुगाली करने वालों और सेरविड्स से ऊतकों के संभावित प्रियन-संक्रमित नमूनों का प्रबंधन करने के लिए अनुशंसित जैव सुरक्षा स्तर -3 (बीएसएल -3) सुविधाओं और प्रथाओं6 का पालन करती है।
टीएसई नैदानिक या अनुसंधान प्रक्रियाओं में शामिल फॉर्मेलिन-फिक्स्ड और पैराफिन-एम्बेडेड ऊतक, विशेष रूप से केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में, संभावित रूप से संक्रामक हो सकते हैं। इसलिए, इन निश्चित ऊतकों को फॉर्मिक एसिड के साथ इलाज किया जाना चाहिए ताकि ऊतक प्रसंस्करण से पहले, यदि मौजूद हो, तो प्रियोन्स की संक्रामकता को कम किया जा सके। यह एक प्रसंस्करण कैसेट में निश्चित, छंटनी ऊतकों (लगभग 2-4 मिमी मोटाई) को रखकर किया जाता है। कैसेट को तब 98% फॉर्मिक एसिड (1 घंटे के लिए) में डुबोया जाता है। विसर्जन के बाद, ऊतकों के साथ कैसेट को 30 मिनट के लिए बहते नल के पानी में धोया जाता है, और आगे की प्रक्रिया से पहले फिक्सेटिव में वापस कर दिया जाता है। यदि ऊतक वर्गों को प्रसंस्करण से पहले इलाज नहीं किया जाता है, तो पोस्ट-माइक्रोटॉमिक ऊतक वर्गों को हिस्टोलॉजिकल धुंधला होने से पहले कम से कम 5 मिनट के लिए बिना पतला फॉर्मिक एसिड में डुबोया जानाचाहिए। पीआरपीएससी के लिए आईएचसी प्रोटोकॉल में एक नियमित फॉर्मिक एसिड एपिटोप-डिमास्किंग चरण शामिल है, जो प्रियोन 7 को निष्क्रिय करने के लिए भी काम करताहै। इन प्रियन निष्क्रियता चरणों के बाद, परिणामस्वरूप निश्चित ऊतकों को मानक बीएसएल -2 प्रथाओं का उपयोग करके बीएसएल -2 पर संसाधित किया जा सकता है।
टीएसई निगरानी में शामिल किसी भी जानवर में टीएसई निदान के लिए न्यूनतम ऊतक नमूना करण आवश्यकता ब्रेनस्टेम (ओबेक्स स्तर पर) एकत्र कर रही है। इसके अतिरिक्त, एटिपिकल बीएसई और स्क्रैपी का पता लगाने के लिए, यह सलाह दी जाती है कि सेरिबैलम का हिस्सा भी एकत्र किया जाना चाहिए। सीडब्ल्यूडी निदान के लिए, ब्रेनस्टेम (ओबेक्स) और रिट्रोफैरेनजील लिम्फ नोड्स दोनों का परीक्षण किया जाना चाहिए क्योंकि पीआरपीएससी को लिम्फोइड ऊतकों में पाया जा सकता है, जिसमें ओबेक्स9 में कोई पता लगाने योग्य पीआरपीएससी नहीं है, जिसकी समीक्षा मचाडो एट अल.10 द्वारा की गई है।
ब्रेनस्टेम के ओबेक्स भाग में नैदानिक टीएसई लक्ष्य साइटें शामिल हैं, अर्थात्, पृष्ठीय योनि नाभिक (डीवीएन), एकान्त पथ नाभिक (एसटीएन) और ट्राइजेमिनल तंत्रिका (वी) के रीढ़ की हड्डी के नाभिक। ये क्षेत्र लगातार द्विपक्षीय पीआरपी एससी संचय प्रस्तुत करतेहैं, यहां तक कि बीएसई और क्लासिकल स्क्रैपी के शुरुआती चरणों में भी। उन्नत टीएसई के नैदानिक मामलों में, ब्रेनस्टेम के भीतर सभी ग्रे-मैटर क्षेत्र व्यापक पीआरपी एससी वितरण11 दिखाते हैं।
सेक्शनिंग और प्रोसेसिंग से पहले, मस्तिष्क के नमूनों का मूल्यांकन किया जाता है (चित्रा 1) ऑटोलिसिस के स्तर और किसी भी ऊतक क्षति की उपस्थिति का पता लगाने के लिए संभावित रूप से आईएचसी-आधारित पुष्टिकरण निदान के लिए नमूने की उपयुक्तता से समझौताकरना। प्रारंभिक प्रोटोकॉल और विश्लेषणात्मक परिणामों की अखंडता को मान्य करने के लिए, टीएसई सकारात्मक और नकारात्मक ऊतक नमूने प्रत्येक परख में परीक्षण मामलों से ऊतकों की तैयारी के साथ संयोजन के रूप में नियंत्रण के रूप में शामिल किए जाते हैं।
चित्रा 1: पीआरपीएससी आईएचसी प्रक्रिया। ऊतक वर्गों के डीपैराफिनाइजेशन से लेकर अंतिम इम्यूनोस्टेनिंग और डिटेक्शन (एफएफपीई – फॉर्मेलिन-फिक्स्ड पैराफिन-एम्बेडेड) तकपीआरपीएससी आईएचसी प्रक्रिया के चरण-दर-चरण अनुक्रम को दिखाने वाला प्रतिनिधित्व; माब – मोनोक्लोनल एंटीबॉडी; डीएबी – 3,3 ‘डायमिनोबेंज़िडाइन)। यह आंकड़ा BioRender.com में बनाया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
Protocol
Representative Results
Discussion
टीएसई संभावित जूनोटिक रोग हैं। यूनाइटेड किंगडम में 1986 में बीएसई के उद्भव के बाद, पुर्तगालइस बीमारी की उच्च घटनाओं के साथ यूरोपीय संघ के सदस्य राज्यों में से एक बन गया। इस बीमारी क?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस लेख को प्रोजेक्ट POCI-01-0145-FEDER-029947 “पुर्तगाल में क्रोनिक वेस्टिंग रोग जोखिम मूल्यांकन” द्वारा वित्त पोषित किया गया था, जो FCT द्वारा समर्थित है (Fundaço para a Cincia e a Tecnologia) – FEDER-Balcao2020। इसके अलावा, अनुसंधान इकाई सीईसीएवी के लेखकों ने परियोजना यूआईडीबी / सीवीटी / 0772/2020 के तहत एफसीटी से धन प्राप्त किया।
Materials
| Absolute ethanol | Labchem | LB0507-9010 | Undituled |
| Diluted 90%, 70% and 50% in distilled water | |||
| Avidin-biotin complex and peroxidase Vectastain Elite ABC kit Peroxidase |
Vector Laboratories | PK-6100 | Prepare and gently mix 30 min before use according to kit instructions. Do not mix after standing. |
| Biotinylated secondary antibody (Horse anti-mouse IgG H+L) | Vector Laboratories | BA-2000-1.5 | Dilute at 1/200 in TBS with 10% horse normal serum. Prepare the volume required depending on the number of sections. |
| Chromogen Diaminobenzidine- DAB, substrate kit, Peroxidase | Vector Laboratories | SK-4100 | Prepare before use according to kit instructions. Use 400 µL of solution per section. |
| DakoCytomation Pascal pressure chamber | DAKO | S2800 | |
| Ehrlich’s Hematoxylin: | |||
| Hematoxylin | Merck | 115938 | Dissolve 2 g of hematoxylin in 100 mL of absolute ethanol. Add 100 mL of distilled water, 10 mL of glacial acetic acid and 15 g of potassium alum with constant stirring. Add 100 mL of glycerin. The natural oxidation process takes 2 months, before use. |
| Absolute ethanol | Labchem | LB0507-9010 | |
| Glacial acetic acid | Merck | 101830 | |
| Potassium alum | Merck | 1.01047.1000 | |
| Glycerin | Merck | 1.04091.1000 | |
| Endogenous Peroxidase Block solution (3% concentration H2O2): | 40 mL Hydrogen peroxide (30% w/w) in 360 mL Methanol. Prepare before use |
||
| Hydrogen peroxide (30% w/w) | Scharlau | HI0136 | |
| Methanol | Sigma Aldrich | 322415-2L | |
| Formic acid 98% | Merck | 1.00264.1000 | Undiluted |
| Microtome | Shandon-AS325 | Microtome | Shandon-AS325 |
| Mounting medium Entellan | Merck | 107960 | Ready- to- use. |
| Normal serum (20% ) block solution in TBS: Horse normal serum |
Gibco |
16050-122 |
Prepare final volume according to the number of sections in the assay (200 µL of solution per section). |
| Primary antibody anti-PrP Mouse MAb 2G11 | BIORAD | MCA2460 | PrP 146-R154R171182 Ovine including atypical scrapie, cervine, feline. Not suitable for bovine. According to the number of sections in the assay (200 µL of solution per section) and antibody dilution, prepare final volume in TBS supplemented with 10% of normal serum from the species the secondary antibody was raised in (horse normal serum) Usual antibody dilution: MAb 2G11 1/100 but working dilution should be established in every new batch to get the concentration to give the strongest labelling with lowest background. For storage, freeze aliquot volumes of a minimum of 10 μL into sterile microtubes. Defrost and use one aliquot at a time. |
| Primary antibody anti-PrP Mouse MAb 12F10 | Cayman Chemical Company | 189710 | PrP142-160 Bovine, not suitable for ovine Usual antibody dilution: 1/200 but working dilution should also be established. Prepare as MAb 2G11 |
| Shandon CoverplateTM chamber | Thermo Scientific | 72110017 | |
| Shandon Sequenza® Immunstaining center | Thermo Scientific | 73300001 | |
| Shandon Sequenza® Immunstaining slide rack | Thermo Scientific | 73310017 | |
| Solution Citrate Buffer (10 mM pH 6.1): | 2.55 g Tri-sodium citrate dihydrate and 0.255 g Citric acid in one litre purified water. Adjust pH of working solution to 6.1 using 10 mM citric acid solution (1.05 g citric acid in 500 mL purified water) Prepare on assay day. |
||
| Tri-sodium citrate dihydrate | Sigma-aldrich | S4641-500G | |
| Citric acid | Sigma Aldrich | C0759 | |
| Staining jar and basket | Deltalab | 19360 | |
| 19361 | |||
| Superfrost Plus microscope slides | VWR | 631-0108 | |
| Tris-Buffered Saline solution (TBS) (50 mM TRIZMA BASE; 0.8% NaCI; pH 7.6): | 10xTBS (stock solution 0.5 M TRIZMA BASE; 8% NaCI; pH 7.6): TRIZMA BASE 60,57 g and NaCl 80 g in 800 mL purified water. Adjust pH of stock solution using Hydrochloric acid 37% and final volume to one litre with purified water (keep 5± 3 °C until 2 months) Dilute TBS stock solution 1/10 on assay day. |
||
| TRIZMA BASE | Sigma Aldrich | T6066-1KG | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Merck | 106404 | |
| Xylene | Panreac Applied Chem ITW reagents | 251769 | Undiluted |
Referencias
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