Saggio di pulldown accoppiato con co-espressione in cellule batteriche come strumento efficiente in termini di tempo per testare interazioni proteina-proteina impegnative

Il pulldown convenzionale è ampiamente utilizzato per studiare le interazioni proteina-proteina¹. Tuttavia, le proteine purificate spesso non interagiscono efficacemente in vitro^2,3, e alcune di esse sono insolubili senza il loro partner legante ^4,5. Tali proteine potrebbero richiedere l’assemblaggio co-traduzionale o la presenza di chaperoni molecolari 5,6,7,8,9. Un’altra limitazione del pulldown convenzionale è la verifica della possibile attività di eteromultimerizzazione tra domini che possono esistere come omo-oligomeri stabili assemblati co-traduzionalmente ^8,10, poiché molti di essi non possono dissociarsi e riassociarsi in vitro durante il tempo di incubazione. La co-espressione è risultata utile per superare tali problemi ^3,11. La co-espressione utilizzando vettori compatibili nei batteri è stata utilizzata con successo per purificare grandi complessi macromolecolari multi-subunità, incluso il complesso repressivo policomb PRC2¹², il modulo testa del mediatore della RNA polimerasi II¹³, il batteriofago T4 baseplate 14, il modulo di deubiquitinylasi del complesso SAGA 15,16 e la ferritina ¹⁷. Le origini di replica comunemente usate per la co-espressione sono ColE1, p15A¹⁸, CloDF13¹⁹ e RSF²⁰. Nel sistema di espressione Duet disponibile in commercio, queste origini sono combinate con diversi geni di resistenza agli antibiotici e convenienti siti di clonazione multipli per produrre vettori policistroni, consentendo l’espressione di un massimo di otto proteine. Queste origini hanno numeri di copie diversi e possono essere utilizzate in varie combinazioni per raggiungere livelli di espressione equilibrati delle proteine bersaglio²¹. Per testare le interazioni proteina-proteina, vengono utilizzati vari tag di affinità; i più comuni sono la 6xIstidina, la glutatione-S-transferasi (GST) e la proteina legante il maltosio (MBP), ognuno dei quali ha un’affinità specifica con la resina corrispondente. GST e MBP migliorano anche la solubilità e la stabilità delle proteine marcate²².

Sono stati inoltre sviluppati numerosi metodi che coinvolgono la co-espressione proteica nelle cellule eucariotiche, il più importante dei quali è il saggio a due ibridi di lievito (Y2H)²³. Il test Y2H è economico, facile e consente di testare più interazioni; Tuttavia, il completamento del flusso di lavoro richiede più di 1 settimana. Esistono anche alcuni saggi basati su cellule di mammifero meno frequentemente utilizzati, ad esempio il saggio fluorescente a due ibridi (F2H)²⁴ e il saggio di interazione proteina-proteina (CAPPIA)²⁵. Il test F2H è relativamente veloce, consentendo di osservare le interazioni proteiche nel loro ambiente cellulare nativo, ma comporta l’uso di costose apparecchiature di imaging. Tutti questi metodi hanno un vantaggio rispetto all’espressione procariotica che fornisce la traduzione eucariotica nativa e l’ambiente di piegatura; Tuttavia, rilevano l’interazione indirettamente, sia per attivazione trascrizionale che per trasferimento di energia fluorescente, che spesso produce artefatti. Inoltre, le cellule eucariotiche possono contenere altri partner di interazione di proteine di interesse, che possono interferire con il test delle interazioni binarie tra proteine di eucarioti superiori.

Il presente studio descrive un metodo per la co-espressione batterica di proteine marcate in modo differenziale seguito da tecniche convenzionali di pulldown. Il metodo consente di studiare le interazioni tra proteine bersaglio che richiedono co-espressione. È più efficiente in termini di tempo rispetto al pulldown tradizionale, consentendo il test in batch di più obiettivi, il che lo rende vantaggioso nella maggior parte dei casi. La co-espressione usando vettori compatibili è più conveniente della co-espressione policistronica poiché non richiede una laboriosa fase di clonazione.