Detección multiparamétrica de fármacos organoides tumorales mediante imágenes de células vivas de campo amplio para análisis a granel y de un solo organoide

Se utilizaron organoides derivados de pacientes con adenocarcinoma ductal pancreático humano (PDAC). Los fragmentos de resección tisular se obtuvieron de pacientes sometidos a cirugía curativa en el Hospital Universitario de Amberes. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los pacientes, y el estudio fue aprobado por el Comité de Ética de la UZA (ref. 14/47/480). Los detalles relacionados con todos los materiales, reactivos, equipos y software utilizados en este protocolo se proporcionan en la Tabla de materiales. En la figura 1 se presenta una descripción general del flujo de trabajo. En el material complementario se proporcionan datos de ejemplo para reproducir el protocolo. 1. Día 0: Preparación de organoides de 2 o 3 días Precaliente las microplacas a 37 °C durante la noche y descongele la matriz extracelular (MEC) a 4 °C. Preparar el medio de cultivo organoide PDAC completo: suplemento ADF+++ (DMEM/F12 avanzado, suplemento de glutamina al 1%, HEPES al 1% y penicilina/estreptomicina al 1%) con proteína Wnt surrogada-Fc-Fusion al 0,5 nM, medio condicionado de proteína de fusión Noggin-Fc al 4%, medio condicionado de proteína de fusión Rpso3-Fc al 4%, 1x B27, 1 mM N-acetilcisteína (NAC), nicotinamida de 5 mM, 500 nM A83-01, 100 ng/ml FGF10 y 10 nM gastrina). Establecer los PDTOs según el método de elección.NOTA: Driehuis et al. proporcionan un protocolo detallado que describe el método convencional para establecer, cultivar y pasar PDTOs en domos ECM4. Disociar enzimáticamente los organoides en domos ECM.Aspirar el medio y lavar 1x con solución salina tamponada con fosfato (PBS). Agregue la enzima de disociación (por ejemplo, 2 ml en una microplaca de 6 pocillos) y pipete hacia arriba y hacia abajo 10 veces con una pipeta de 1 ml para disociar mecánicamente los organoides y las cúpulas de ECM. Incubar durante 10 min a 37 °C, pipetear hacia arriba y hacia abajo y comprobar si los organoides están disociados a células individuales. Repita este paso si es necesario. Recoja la suspensión celular en un tubo de 15 ml, agregue ADF+++ a un volumen de 10 ml, centrifugar durante 5 min a 450 × g a temperatura ambiente y aspirar el sobrenadante con una pipeta Pasteur y una bomba de succión. Resuspender el pellet en 100-200 μL de medio completo dependiendo del tamaño del pellet y contar el número de células utilizando el método de elección. Por ejemplo: mezclar 10 μL de la suspensión celular + 10 μL de Trypan Blue y contar con un contador de celdas automatizado. Placas de celdas individuales en domos ECM.Diluir la suspensión celular y añadir 2/3 ECM de acuerdo con la Tabla 1. Pipetear hasta diez gotas de 20 μL por pocillo en una placa precalentada de 6 pocillos. Invertir la placa e incubar durante 30 min a 37 °C. Superponer con medio completo suplementado con 10 μM Y-27632 e incubar durante 2-3 días en una incubadora.NOTA: Diez domos que contienen 75,000 celdas cada uno suelen ser suficientes para llenar una microplaca de 384 pocillos a una concentración de 200 organoides / pocillo, excluyendo los pocillos en el borde. 2. Días 2 – 3: Cosecha y siembra de organoides de 2 o 3 días Recoge organoides intactos de las cúpulas ECM.NOTA: Los organoides tienden a adherirse a superficies plásticas (por ejemplo, tubos, puntas de pipeta). Para evitar esto, los artículos de plástico se pueden enjuagar previamente con una solución de albúmina sérica bovina (BSA) / PBS al 0,1%.Aspirar el medio y lavar 1x con PBS. Añadir 1-2 ml de solución de recolección de organoides fría (4 °C) a una placa de 6 pocillos dependiendo del número de domos ECM e incubar en hielo en una plataforma de agitación durante 10 min. Pipetear hacia arriba y hacia abajo con una pipeta de 1 ml para disociar las cúpulas de ECM, incubar durante 10 minutos adicionales en hielo y verificar visualmente bajo un microscopio si la ECM está disociada. Opcional: si se prefiere una distribución de tamaño más uniforme, filtrar la suspensión a través de un filtro celular de 70 μm antes de la centrifugación. Recoger los organoides en un tubo de 15 ml prerecubierto con BSA/PBS al 0,1%, añadir ADF+++ hasta 10 ml y centrifugar durante 5 min a 200 × g a 4 °C. Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet en hasta 1.000 μL de medio organoide PDAC completo dependiendo del tamaño del pellet para obtener una concentración de >6.000 organoides/mL. Cuente los organoides utilizando cualquier método de conteo de su elección, preferiblemente uno basado en imágenes. Siembra los organoides.NOTA: Consulte la Tabla de materiales para conocer el volumen mínimo/pocillo para dos tipos diferentes de microplacas de 384 pocillos utilizadas en este protocolo.Preenfríe todos los artículos de plástico a -20 °C o en hielo durante al menos 20 minutos antes de usarlos para evitar la solidificación de la ECM. Preparar la solución de siembra a partir de 1 ml de solución madre de organoides (paso 2.1.6) utilizando medio completo para sembrar ~200 organoides por pocillo en 50 μL, el volumen mínimo utilizado para llenar un pocillo. Utilice el Archivo suplementario 1 para calcular la cantidad de solución de siembra de organoides. Añadir un volumen residual de 1.500 μL cuando se utilice un depósito de 25 ml y una pipeta multicanal o un robot de pipeteo. Siembra los organoides usando un robot pipeteador.NOTA: Tanto la solución de siembra como la microplaca deben enfriarse a 4 °C durante el pipeteo para evitar la solidificación de la ECM. Por lo tanto, un depósito de 25 ml y un soporte de microplaca se imprimieron en 3D para ser utilizados en combinación con el robot de pipeteo que puede contener los elementos de enfriamiento enumerados en la Tabla de materiales. Se proporcionan archivos STL para imprimir en 3D el material de laboratorio personalizado (Archivo complementario 2 y Archivo complementario 3) y archivos JSON de material de laboratorio personalizado para el robot de pipeteo (Archivo complementario 4 y Archivo complementario 5). Diseñe el protocolo de dispensación utilizando la herramienta de diseño de protocolos en línea. Se proporciona un archivo JSON de ejemplo (archivo complementario 6), en el que el material de laboratorio personalizado ya está cargado y se utiliza una pipeta p300 (Gen2) de ocho canales con las puntas de pipeta correspondientes. Abra la aplicación de control del robot de pipeteo, seleccione protocolos, haga clic en Importar y arrastre y suelte el Archivo complementario 6 en el campo designado. Seleccione el protocolo importado y coloque todo el material de laboratorio, incluidos los elementos de refrigeración y los artículos de plástico, en las cubiertas de acuerdo con el diseño que se muestra en el campo Configuración de la plataforma . Utilice la ranura izquierda para el depósito de 25 ml y el elemento refrigerante, como se muestra en el archivo complementario 7. Haga clic en Ejecutar protocolo y proceda a la configuración. Abra la pestaña Configuración de Labware, haga clic en Run Labware Position Check y siga las instrucciones para calibrar el robot de pipeteo al nuevo hardware.NOTA: Los datos de desplazamiento de material de laboratorio se pueden almacenar para más adelante, pero se recomienda ejecutar la comprobación de posición del material de laboratorio antes de cada ejecución. Llene el depósito de 25 ml (colocado encima del elemento refrigerante) con la solución de siembra de organoides enfriada y haga clic en Start Run (Iniciar ejecución).NOTA: Los pocillos superior e inferior también se llenan con solución de suspensión organoide debido al uso de la pipeta de ocho canales. Centrifugar la microplaca durante 1 min a 100 × g a 4 °C. Incubar a 37 °C durante al menos 30 min. Llene los pocillos exteriores en blanco con al menos 50 μL deH2Opara evitar la evaporación. Incubar a 37 °C durante la noche para eliminar cualquier burbuja en el pozo que pueda interferir con el análisis de la imagen. 3. Día 4: Tratamiento farmacológico y dispensación de reactivos con dispensador digital de medicamentos Cree el protocolo de dispensación de medicamentos utilizando el software de control de dispensadores digitales de medicamentos.Desplácese sobre la placa 1 sobre el diseño de la placa, seleccione editar atributos de placa y rellene el tipo de placa: 384 pocillos, volumen adicional (μL): 50 y límite DMSO (%): 1. Agregue fluidos haciendo clic en el botón + junto a Fluidos. Haga doble clic en el fluido recién creado y asígnele un nombre; seleccione la clase (basada en DMSO o acuosa + Tween 20) y la concentración.NOTA: Todos los medicamentos y reactivos deben disolverse en 100% DMSO o 0.3% Tween-20. Se puede utilizar una solución madre de 1-10 mM, teniendo en cuenta una concentración máxima de DMSO del <1%. La Tabla 2 proporciona ejemplos de las diluciones requeridas para reactivos y terapias fluorescentes comunes. Diseño de la placaPara la titulación de medicamentos, seleccione pozos y haga clic en Titulación. Para el líquido, seleccione el fármaco de interés, elija la concentración más alta (por ejemplo, 2,000 nM) y la concentración más baja (por ejemplo, 10 nM); Para las réplicas, elija un mínimo de 2 y elija el patrón de valoración deseado.NOTA: El patrón de valoración dependerá de muchos factores, incluyendo cuánto compuesto debe caber en una sola placa, si los pocillos deben ser aleatorizados y el número de réplicas y controles. Para el control positivo, seleccione tres pocillos, haga clic en Establecer valor y complete 2 μM de estaurosporina de 10 mM en DMSO, lo que inducirá la muerte celular máxima. Para Cytotox Green, seleccione todos los pocillos utilizados, haga clic en Establecer valor e ingrese 60 nM/pocillo.NOTA: La tinción fluorescente Cytotox Green indica células que han muerto y, por lo tanto, no interferirán con el monitoreo de la respuesta al medicamento. Aquí, no se requiere un marcador fluorescente para las células vivas. Para el control negativo y la normalización DMSO, seleccione todos los pozos con cuatro pozos adicionales para el control del vehículo, haga clic con el botón derecho, seleccione normalización, seleccione normalizar la clase de fluido: basada en DMSO y normalizar al volumen de clase más alto para obtener una concentración de DMSO igual en cada pozo.NOTA: Las concentraciones de DMSO deben ser <1%. Se proporciona un ejemplo de archivo de titulación de medicamentos TDD (Archivo suplementario 8). Haga clic en la flecha debajo de Ejecutar en la esquina superior izquierda, seleccione Simular siempre y haga clic en Simular para identificar cualquier error y obtener los volúmenes de cada medicamento a preparar. NOTA: Para superar una advertencia cuando el volumen de dispensación inicial es demasiado bajo, “Se recomienda un pozo de advertencia de dispensación de 30 nL o más para cada fluido en cada placa”, seleccione dos pocillos en el borde que estén llenos de agua, seleccione Establecer valor e ingrese 10 μM del medicamento para el cual se produce la advertencia. Esto prepara el cartucho del fármaco con un volumen superior a 30 nL. Estos mismos pocillos se pueden usar para cebar el cartucho DMSO estableciendo una normalización a % del valor de volumen total (por ejemplo, 0.5%). Desmarque Simular siempre debajo del botón Ejecutar ; haga clic en Ejecutar para iniciar el protocolo de dispensación de medicamentos y siga las instrucciones. Aplique la membrana de sellado a la microplaca para evitar la evaporación. Incubar el colorante Cytotox Green 1-2 h a 37 °C en la incubadora y continuar con el paso 4. 4. Adquiera imágenes con el generador de imágenes de células vivas NOTA: Para la tasa de crecimiento y NDR, se debe adquirir una exploración en el punto de tiempo 0 (T0 = iniciar el tratamiento) 1-2 h después de agregar Cytotox Green. Abra el software de control del generador de imágenes de celda activa, seleccione Editor de métodos Nuevo, vaya al archivo > importar y seleccione el archivo XML del método de ejemplo (archivo complementario 9). Alternativamente, cree un nuevo archivo y seleccione Placa: (CORE384fb_OpticalImaging) – Corning 384 Flat Black (Corning #4588), Sin tapa y sin casete de humedad; Aplicación: Sólo imágenes; Objetivo: 4x; Patrón: Central; Compruebe los canales Brightfield y Green (intensidad del LED (%) = 40; Tiempo de exposición (ms) = 200).NOTA: La configuración del canal verde funciona bien para una concentración de 60 nM Cytotox Green. La opción Live viewer se puede utilizar para ajustar el desplazamiento del enfoque y/o la configuración del led en tiempo real. Haga clic en Inicio para iniciar el escaneo en T0. Repita el escaneo cada 24 h durante un máximo de 5 días utilizando el mismo método. Como alternativa, para ejecutar la medición de lapso de tiempo automáticamente, ajuste el método en el software Control del generador de imágenes de células vivas a un experimento cinético haciendo clic y arrastrando la pestaña Bucle cinético al campo del método . Del mismo modo, las pestañas Temperatura y Gas deben arrastrarse al campo de método para ajustar el sistema a 37 °C y 5% deCO2 para garantizar las condiciones correctas dentro del generador de imágenes de células vivas durante el experimento. 5. Análisis de imágenes y datos Combinar y comprimir datosEl software de control de imágenes de células vivas genera una carpeta para cada escaneo en cada punto de tiempo. Cree una nueva carpeta, copie las carpetas de experimento individuales en esta nueva carpeta principal y agregue _0h, _24h, _48h, _72h, _96h y _120h a los nombres de carpeta de experimento correspondientes. Prepare un mapa de placas XLSX desde el software de control del dispensador digital de medicamentos haciendo clic derecho en el diseño del mapa de placas del protocolo de dispensación de medicamentos y copie todos los pocillos; pegue los datos en un archivo XLSX. Elimine los datos de Cytotox Green y staurosporine y agregue una matriz para Cell Line y Replicate. Escriba ctrl- y ctrl+. Consulte el Archivo complementario 10 para ver un ejemplo de mapa de placas. Abra la herramienta de compresión de datos, haga clic en Examinar, seleccione la carpeta principal y haga clic en Ejecutar para iniciar la compresión de datos de imagen. Todos los archivos de imagen TIFF para los diferentes puntos de tiempo se comprimen en un solo HDF5 para cada pocillo en una nueva carpeta de conjuntos de datos dentro de la carpeta parental. Análisis de imágenesVaya a la plataforma de aplicaciones web de análisis de imágenes, inicie sesión y haga clic en Agregar nuevo proyecto en la pestaña Inicio . Introduzca el nombre del proyecto, continúe, seleccione Agregar nuevo experimento y cargue la carpeta de conjuntos de datos que contiene los archivos HDF5. Después de cargar, vaya a la carpeta de proyectos y experimentos y haga clic en Cargar mapa de placas para obtener funcionalidades adicionales. Haga clic en Ejecutar análisis, seleccione Análisis multiorganoide, Parámetros predeterminados y haga clic en Analizar para iniciar el análisis de imágenes. Haga clic en Descargar resultados para descargar las tablas de datos sin procesar que contienen las mediciones para cada pozo (por ejemplo, área total de campo claro, área verde de fluorescencia total, etc.) y las imágenes / videos segmentados para confirmar la precisión del análisis y el procesamiento posterior de datos. Métricas de respuesta a medicamentos basadas en la tasa de crecimiento y respuesta normalizada a los medicamentosSeleccione el archivo Raw_NDR.xlsx de la carpeta de resultados (se requiere mapa de placas) (Archivo complementario 11) y cárguelo en el script R Official_NDR_7point (Archivo complementario 12) para generar automáticamente tablas de valores GR (normalizado a ctrl-) y NDR (normalizado a ctrl y ctrl+) (Archivo complementario 13, Archivo complementario 14, Archivo complementario 15 y Archivo complementario 16 ). Los valores GR y NDR se calculan a partir del parámetro como se muestra en la ecuación (1) utilizando el R-script (Archivo Suplementario 12).Área total de supervivencia = Área total de campo brillante – Área verde total (1)Donde 0 < NDR <1 = efecto citostático (detención del crecimiento) y NDR < 0 = respuesta citotóxica (muerte celular).NOTA: El guión R fue adaptado de Gupta et al.6. De la tabla clonal_data.xlsx, recupere los datos de respuesta de un solo organoide y tráquelos como un gráfico de burbujas. Utilice el factor Z10 para evaluar la calidad de la prueba de detección de drogas de una corrida (consulte la ecuación (2)). Descarte un experimento con un factor Z < 0.5.(2)