يصف هذا البروتوكول طريقة شبه آلية لفحوصات الأدوية العضوية متوسطة إلى عالية الإنتاجية وبرامج تحليل الصور الآلية غير المحايدة للمجهر لتحديد وتصور استجابات الأدوية متعددة المعلمات وأحادية العضوية لالتقاط عدم التجانس داخل الورم.
تحمل عضويات الورم المشتقة من المريض (PDTOs) وعدا كبيرا للبحوث قبل السريرية والانتقالية والتنبؤ باستجابة علاج المريض من فحوصات الأدوية خارج الجسم الحي . ومع ذلك ، فإن فحوصات فحص الأدوية الحالية القائمة على أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) لا تلتقط تعقيد استجابة الدواء (تثبيط الخلايا أو السامة للخلايا) وعدم التجانس داخل الورم الذي ثبت أنه يتم الاحتفاظ به في PDTOs بسبب قراءات بالجملة. يعد التصوير بالخلايا الحية أداة قوية للتغلب على هذه المشكلة وتصور استجابات الأدوية بشكل أكثر تعمقا. ومع ذلك ، غالبا ما لا يتم تكييف برنامج تحليل الصور مع الأبعاد الثلاثية ل PDTOs ، أو يتطلب أصباغ صلاحية فلورية ، أو غير متوافق مع تنسيق الصفيحة الدقيقة 384 بئرا. تصف هذه الورقة منهجية شبه آلية لزرع ومعالجة وتصوير PDTOs بتنسيق عالي الإنتاجية ، 384 بئرا باستخدام أنظمة تصوير الخلايا الحية التقليدية واسعة المجال. بالإضافة إلى ذلك ، قمنا بتطوير برنامج تحليل صور خال من علامات الجدوى لتحديد مقاييس الاستجابة للأدوية القائمة على معدل النمو والتي تعمل على تحسين قابلية التكاثر وتصحيح اختلافات معدل النمو بين خطوط PDTO المختلفة. باستخدام مقياس الاستجابة للأدوية الطبيعي ، الذي يسجل استجابة الدواء بناء على معدل النمو الطبيعي لحالة التحكم الإيجابية والسلبية ، وصبغة موت الخلايا الفلورية ، يمكن بسهولة تمييز استجابات الأدوية السامة للخلايا والمثبطة للخلايا ، مما يحسن بشكل عميق تصنيف المستجيبين وغير المستجيبين. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تحديد عدم تجانس الاستجابة للأدوية من خلال تحليل استجابة الدواء العضوي الأحادي لتحديد الحيوانات المستنسخة المحتملة والمقاومة. في النهاية ، تهدف هذه الطريقة إلى تحسين التنبؤ باستجابة العلاج السريري من خلال التقاط توقيع استجابة دوائية متعددة المعلمات ، والتي تشمل توقف النمو الحركي والقياس الكمي لموت الخلايا.
في السنوات الأخيرة ، انتقل اكتشاف أدوية السرطان في المختبر ، وفحص الأدوية ، والبحوث الأساسية من استخدام نماذج السرطان التقليدية ثنائية الأبعاد (2D) مع خطوط الخلايا الخالدة إلى نماذج سرطان ثلاثية الأبعاد (3D) أكثر صلة من الناحية الفسيولوجية. وقد حفز هذا اعتماد كرويات الورم مع خطوط الخلايا السرطانية الراسخة ، والتي تعيد إنشاء تفاعلات وهياكل أكثر تعقيدا من خلية إلى خلية موجودة في الأورام الصلبة. حاليا ، تعد عضويات الورم المشتقة من المريض (PDTOs) أكثر نماذج السرطان 3D تقدما وذات الصلة من الناحية الفسيولوجية المتاحة لأبحاث السرطان في المختبر ، لأنها توفر مزايا إضافية على كرويات الورم ، وهي عدم التجانس الموجود في مرضى السرطان1. يتم إنشاء PDTOs من أنسجة الورم الناشئة عن مرضى السرطان ، وبالتالي تحتفظ بكل من النمط الظاهري للورم والنمط الجيني. على هذا النحو ، أصبحت PDTOs لا تقدر بثمن لأبحاث السرطان الأساسية والانتقالية ولديها القدرة على تحسين علم الأورام الدقيق بشكل كبير2.
على الرغم من إمكاناتها الواعدة ، غالبا ما يتم استخدام نماذج السرطان 3D المتطورة في المختبر بسبب نقص طرق التحليل المتقدمة. يحدد الفحص الأكثر استخداما عدد الخلايا القابلة للحياة في PDTO عن طريق القياس الكمي ل ATP3 داخل الخلايا. عادة ما تكون هذه المقايسات عبارة عن تحليلات مجمعة ذات نقطة زمنية واحدة ، وبالتالي تتجاهل الاستجابات الحرجة المعتمدة على الوقت وتهمل الاستجابات النسيلية. على وجه التحديد ، فإن القدرة على مراقبة نمو PDTOs (معدل النمو) واستجابتها لعلاجات محددة ذات أهمية عالية 4,5. الاستجابة الدوائية الطبيعية (NDR) ، التي تسجل استجابة الدواء بناء على معدل النمو الطبيعي إلى حالة إيجابية (ctrl +) والسيطرة السلبية (ctrl-) ، تم الإبلاغ عنها مؤخرا لتكون مقياسا حاسما لتقييم حساسية أدوية السرطان من خلال الفحص القائم على الخلايا ، على الرغم من أن هذا تم في الغالب لخطوط الخلايا ثنائية الأبعاد6. لذلك ، هناك حاجة إلى طرق تحليل أكثر تطورا للاستفادة الكاملة من نماذج السرطان 3D الأكثر تمثيلا سريريا وتعقيدا. يعتبر الفحص المجهري نهجا قويا لدراسة مدى تعقيد هذه النماذج العضوية7.
تصف هذه الورقة طريقة لمراقبة الاستجابات الدوائية الحركية في نماذج السرطان 3D ، باستخدام المجاهر التقليدية واسعة المجال وأنظمة تصوير الخلايا الحية. تم إجراء تعديلات على البروتوكول الذي وصفه Driehuis et al.4 ليكون متوافقا مع الأتمتة باستخدام روبوت ماصة ، وموزع أدوية رقمي ، ونظام تصوير الخلايا الحية لزيادة قابلية التكاثر وتقليل عدد ساعات العمل “العملية”. تسمح هذه الطريقة بفحص الأدوية المتوسطة إلى العالية الإنتاجية لكل من الكرويات السرطانية ذات خطوط الخلايا السرطانية الثابتة (انظر الجدول التكميلي S1 لخطوط الخلايا المختبرة) ، بالإضافة إلى PDTOs ، في شكل صفيحة مجهرية ومتعددة الأعضاء من 384 بئرا. باستخدام عملية التعلم الآلي للشبكة التلافيفية ، يمكن إجراء التحديد الآلي وتتبع الأجسام الكروية الفردية للورم أو PDTOs فقط من التصوير الساطع وبدون استخدام أصباغ وضع العلامات على الخلايا الحية الفلورية8. هذا مفيد للغاية ، لأن معظم التعرف على التصوير الساطع يتطلب شرحا يدويا (وهو أمر شاق ويستغرق وقتا طويلا) أو يتطلب إضافة أصباغ فلورية ، والتي يمكن أن تربك الاستجابات الدوائية المتعلقةبالإجهاد التأكسدي الناجم عن الضوئية9.
يعمل برنامج تحليل الصور الناتج الذي تم تطويره داخليا على توسيع وظائف أنظمة التصوير التقليدية للخلايا الحية ، حيث أن وحدات تحليل الصور ثلاثية الأبعاد إما غير متوفرة أو مقيدة بالنظام الأساسي أو غير متوافقة مع الألواح الدقيقة ذات 384 بئرا والتصوير الكامل. بالإضافة إلى ذلك ، غالبا ما تكون هذه الوحدات باهظة الثمن وتقدم قراءات عضوية سائبة محدودة. لذلك ، فإن هذه الطريقة وثيقة الصلة بالعلماء الذين لديهم إمكانية الوصول إلى أنظمة تصوير الخلايا الحية المتاحة على نطاق واسع ويهدفون إلى استخراج المزيد من المعلومات حول استجابة الدواء مقارنة بالمعيار الذهبي ولكن الفحص البدائي القائم على ATP. مع إضافة مؤشرات محددة لموت الخلايا ، يمكن تمييز استجابات الأدوية المثبطة للخلايا عن الاستجابات السامة للخلايا ، مما يوفر مزيدا من التبصر في الإجراءات الدوائية الآلية التي لا يمكن تحقيقها حاليا من تحليل نقطة زمنية واحدة. أخيرا ، يسمح تصوير الخلايا الحية بتتبع الأعضاء الفردية للحصول على مقاييس استجابة واحدة للأدوية العضوية لالتقاط عدم تجانس الاستجابة وتحديد الحيوانات الفرعية المقاومة المحتملة.
الهدف من هذه الطريقة وبرنامج تحليل الصور المرتبط بها هو تنفيذ أتمتة منخفضة التكلفة في فحص الأدوية العضوية للحد من تدخل المستخدم وتقليل التباين في المناولة وتحليل الصور وتحليل البيانات. لجعل هذا البرنامج متاحا للباحثين ، فهو محايد للمجهر والنظام الأساسي ، ويتم توفير تطبيق قائم على السحابة. وبالتالي ، من خلال دعم أنظمة التصوير التقليدية للخلايا الحية ، نهدف أيضا إلى تحسين وظائفها لتطبيقات الزراعة 3D والتحليل.
غالبا ما يعتمد فحص أدوية PDTO متوسط إلى عالي الإنتاجية على قراءات تستخرج جزءا صغيرا فقط من المعلومات التي يمكن أن توفرها الكائنات العضوية. لقد أصبح من الواضح بشكل متزايد أنه من أجل أن تحقق التكنولوجيا العضوية سريعة التطور إمكانات علمية وسريرية أكبر ، فإن فحوصات 3D الأكثر تقدما ، والقراءات ، وطرق التحليل مطلوبة بشدة. هنا ، يتم وصف خط أنابيب الفحص المتقدم ، والذي لا يزيد من قابلية التكاثر فحسب ، بل يعزز أيضا بشكل كبير قابلية الترجمة السريرية من خلال دمج قراءات تصوير الخلايا الحية التي تعتمد على الذكاء الاصطناعي. بالإضافة إلى برامج التحليل التي تم تطويرها داخليا ، يتم تنفيذ استخدام مقياس الاستجابة للأدوية الطبيعي (NDR) ، والذي يوضح بوضوح قدرته على تحديد الاختلافات الخاصة بالمريض في الاستجابة للعلاج6.
سيكون إدراج مقياس التطبيع هذا بلا شك ذا قيمة هائلة ، مع التذكير بأن العديد من الدراسات تهدف إلى تحديد استجابات العلاج بناء على الاختلافات الطفيفة في المنطقة الواقعة تحت المنحنى (AUC) أو التركيز المثبط نصف الأقصى (IC50) (حيث تتداخل معظم منحنيات الجرعة والاستجابة / تقع بالقرب من بعضها البعض)11,12 . تم بالفعل تنفيذ مقاييس معدل النمو في بروتوكولات فحص الأدوية العضوية باستخدام الفحص القائم على ATP ولكنها تعتمد على تطبيع الآبار المرجعية المحللة في النقطة الزمنية 04. في المقابل ، تسمح هذه الطريقة بتطبيع معدل النمو داخل البئر ، والذي لا يفسر فقط الاختلافات بين المرضى في معدل نمو PDTO ولكن أيضا الاختلافات بين الآبار الناتجة عن الاختلافات في كثافة البذر والتأثيرات المعتمدة على موقع اللوحة لزيادة التكاثر. علاوة على ذلك ، قمنا بتكييف NDR لزيادة فصل استجابة PDTO للمرضى الداخليين من خلال تضمين تحكم إيجابي للتطبيع 6,8.
علاوة على ذلك ، يمكن للتحليل ، المتوافق مع تنسيقات الإنتاجية العالية والأتمتة ، اكتشاف الاستجابات العضوية الفردية بدقة ، مما يتيح القياس الكمي للمقاومة تحت النسيلة – القوة الدافعة الرئيسية لانتكاس الورم وتقدمه13. على سبيل المثال ، على الرغم من أن PDAC052 و PDAC060 أظهرا استجابة جيدة للعلاج في المختبر (بناء على NDR) ، إلا أن التحليل العضوي الفردي الإضافي كان قادرا على اكتشاف مجموعة صغيرة (أكبر من السكان مع PDAC060) من المستنسخات الفرعية التي لا تستجيب للعلاج. ومن المثير للاهتمام ، أن هذا يتوافق بشكل كبير مع الملاحظة السريرية ، بالنظر إلى أن PDAC052 و PDAC060 كان لهما استجابة دائمة (لم يتم اكتشاف أي نشاط للورم) ولكن في النهاية تم تشخيصهما بتطور الورم المحلي (بسبب وجود استنساخ مقاوم). بالمقارنة مع قراءات 3D التقليدية (الفحص القائم على ATP والحجم / الأرقام) ، من المتوقع أن يزيد خط أنابيب الفحص المتقدم هذا من الأداء التنبئي من خلال استخراج المزيد من المعلومات ذات الصلة سريريا من هؤلاء “المرضى في المختبر”. يتم الآن اختبار هذه الفرضية عن طريق فحص عينات PDTO السريرية في مختبر المؤلفين بهذه الطريقة لربط خارج الجسم الحي بالاستجابة في الجسم الحي والنتيجة السريرية.
للحصول على مزيد من الأفكار حول آليات الاستجابة الدوائية ، تتوافق كواشف التصوير الفلورية التقليدية للخلايا الحية ، بالإضافة إلى أصباغ السمية الخلوية ، مع هذه الطريقة لدراسة آليات موت الخلايا. لقد أظهرنا سابقا توافق هذه الطريقة مع الكاشف الأخضر Sartorius Caspase 3/7 لدراسة تحريض موت الخلايا المبرمج المعتمد على caspase بعد علاج سيسبلاتين8. لا يزال يتعين اختبار التوافق مع الأصباغ الأخرى لدراسة الإجهاد التأكسدي (كواشف CellOX) أو نقص الأكسجة (كواشف نقص الأكسجة Image-iT). ومع ذلك ، فقد تم بالفعل استخدام هذه الكواشف بنجاح في نماذج 3D في المختبر 14,15.
يتوافق برنامج تحليل الصور أيضا مع تنسيقات الألواح الأخرى أو طرق الزراعة (على سبيل المثال ، لوحات التجاويف الدقيقة ، وقباب ECM) إذا كان من الممكن التقاط صور واضحة ومركزة للكائنات العضوية. غالبا ما يمثل هذا تحديا للعضويات المستزرعة في القباب لأنها تنمو في مستويات z مختلفة ، الأمر الذي يتطلب وظيفة تكديس z للمجهر غير المتوفرة دائما. لذلك ، ننصح باستخدام الألواح الدقيقة ULA 384-well ذات القاع المسطح لضمان صور ذات جودة كافية.
بالإضافة إلى ذلك ، يتوافق التحليل مع أنظمة تصوير الخلايا الحية الأخرى ، كما هو موضح سابقا لصور تباين الطور الملتقطة باستخدام نظام IncuCyte ZOOM8. أحد قيود نظام تصوير الخلايا الحية Spark Cyto الذي تم استخدامه في هذه المخطوطة هو سعة اللوحة الواحدة للقياسات الحركية. ومع ذلك ، فإن توسعة Spark Motion تزيد من قدرتها إلى ما يصل إلى 40 لوحة صغيرة يمكن فحصها بكميات كبيرة. سيتم توسيع توافق البرامج التي تم تطويرها داخليا لتشمل هذه الأنظمة وغيرها لتقديم حل محايد للنظام الأساسي ، بهدف توحيد وأتمتة خطوط أنابيب تحليل الصور والبيانات. سيتضمن التطبيق المستند إلى الويب أيضا أدوات رسوم بيانية تفاعلية وحسابات آلية لقياس الأدوية ، كما هو موضح في هذه الورقة ، لتقليل وقت التحليل اليدوي.
تم تدريب خوارزمية تجزئة PDTO الخالية من الملصقات واختبارها على العديد من النماذج الكروية المزروعة داخليا و PDTO مع اختلافات مورفولوجية مميزة (صلبة ، شبه صلبة ، كيسية) ، وبالتالي يمكنها اكتشافها بدقة عالية8. أحد قيود النموذج هو أن إدراج PDTOs الكيسية زاد من الكشف غير المرغوب فيه عن الفقاعات الموجودة في البئر بعد البذر. ومع ذلك ، كانت الحضانة الليلية كافية لإزالة معظم هذه الفقاعات ، مما يسمح بمسح زمني نوعي 0. يجب التحقق من دقة تجزئة الصورة العضوية والطريقة من قبل مستخدمين آخرين ، وبناء على ملاحظاتهم ، يمكن تدريب البرنامج بشكل أكبر للحصول على خوارزمية تحليل صور قوية وآلية. بالإضافة إلى ذلك ، نهدف إلى الحصول على المزيد من البيانات السريرية لربط استجابة الدواء خارج الجسم الحي التي تم تحديدها كميا بهذه الطريقة بالاستجابة السريرية لدى المريض لتحديد أفضل المعلمات للتنبؤ باستجابة العلاج وتطوير هذه الطريقة لطب السرطان الدقيق الوظيفي16.
The authors have nothing to disclose.
تم تمويل جزء من هذا البحث من خلال تبرعات من مانحين مختلفين ، بما في ذلك Dedert Schilde vzw والسيد Willy Floren. يتم تمويل هذا العمل جزئيا من قبل مؤسسة البحوث الفلمنكية ، 12S9221N (A.L.) ، G044420N (S.V. ، A.L. ، على سبيل المثال) ، 1S27021N (M.L) ، ومن قبل صندوق البحوث الصناعية بجامعة أنتويرب ، PS ID 45151 (S.V. ، A.L. ، C.D.). تم إنشاء الشكل 1 مع BioRender.com.
6-well plate | Greiner | 657160 | |
8-Channel p300 (GEN 2) pipette | Opentrons | ||
300 µL Tips | Opentrons | ||
384-well flat-bottom ULA microplate | Corning | 4588 | minimum volume 50 µL |
384-well flat-bottom ULA Phenoplate | Perkin Elmer | 6057802 | minimum volume 75 µL |
A8301 | Tocris Bioscience | 2939 | |
ADF+++ | Advanced DMEM/F12, 1% GlutaMAX, 1% HEPES, 1% penicillin/streptomycin | ||
Advanced DMEM/F-12 | ThermoFisher Scientific | 12634 | |
B27 | ThermoFisher Scientific | 17504044 | |
Breathe easy sealing membrane | Sigma-Aldrich | Z380059 | |
Caspase 3/7 Green | Sartorius | 4440 | |
Cell Counting Slides for TC10/TC20 | Bio-Rad Laboratories | 1450017 | |
CellTiter-Glo 3D | Promega | G9681 | ATP-assay |
Cooler for 25 mL reservoir | VWR (Diversified Biotech) | 490006-908 | |
Cooling element 12 x 8 x 3 cm | Bol.com | 9200000107744702 | For custom microplate holder OT-2 |
Cultrex Organoid Harvesting Solution | R&D systems | 3700-100-01 | |
Cultrex PathClear Reduced Growth Factor BME, Type 2 | R&D systems | 3533-010-02 | extracellular matrix (ECM) |
Cytotox Green | Sartorius | 4633 | |
Cytotox Red | Sartorius | 4632 | |
D300e | Tecan | Digital drug dispenser | |
D300e Control v3.3.5 | Tecan | Control software D300e | |
FGF10 | Peprotech | 100-26 | |
Full Medium | ADF+++ supplemented with 0.5 nM WNT surrogate-Fc-Fusion protein, 4% Noggin-Fc Fusion Protein conditioned medium, 4% Rpso3-Fc Fusion Protein conditioned medium, 1x B27, 1 mM N-acetyl cysteine (NAC), 5 mM nicotinamide, 500 nM A83-01, 100 ng/mL FGF10, and 10 nM Gastrin | ||
Gastrin | Sigma-Aldrich | G9145 | |
Gemcitabine | Selleck Chemicals | S1714 | |
GlutaMAX | ThermoFisher Scientific | 35050 | |
HEPES | ThermoFisher Scientific | 15630056 | |
Hoechst 33342 Solution (20 mM) | ThermoFisher Scientific | 62259 | |
Human pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) patient-derived organoids | Biobank@uza (Antwerp, Belgium; ID: BE71030031000; Belgian Virtual Tumorbank funded by the National Cancer Plan) | ||
N-acetyl-cysteine | Sigma-Aldrich | A9165-25G | |
Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-100G | |
Noggin-Fc Fusion Protein conditioned medium | Immunoprecise | N002 | |
Opentrons App v6.0.1 | Opentrons | OT-2 control software | |
Opentrons Protocol Designer Tool | Opentrons | https://designer.opentrons.com/ | |
Orbits data compression tool | www.orbits-oncology.com or contact corresponding author | ||
Orbits image analysis webapp | University of Antwerp | www.orbits-oncology.com or contact corresponding author | |
OT-2 | Opentrons | Pipetting robot | |
Paclitaxel | Selleck Chemicals | S1150 | |
Pasteur Pipette 230 mm | Novolab | A33696 | |
Peniciline-Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140 | |
Prism 9 | GraphPad | ||
Rspo3-Fc Fusion Protein conditioned medium | Immunoprecise | N003 | |
Spark Cyto 600 | Tecan | Live-cell imaging and multi-mode platereader | |
SparkControl v3.1 | Tecan | Spark Cyto control software | |
Staurosporine | Tocris Bioscience | 1285 | |
Sterile 25 mL reservoir | VWR (Diversified Biotech) | 10141-922 | |
T8 plus cassette | Tecan | ||
TC20 | Bio-Rad Laboratories | automated cell counter | |
TrypLE | ThermoFisher Scientific | 12604-021 | dissociation enzyme |
Tween-20 | Acros Organics | 233360010 | |
WNT Surrogate-Fc-Fusion protein | Immunoprecise | N001 | |
Y-27632 | Selleck Chemicals | S1049 |