JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Divulgaciones
Acknowledgements
Materials
Referencias
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Inmunología y contagio

שיטות גידול של Spirochetes מ Borrelia burgdorferi Sensu Lato קומפלקס קדחת התקפית Borrelia

Published: November 25, 2022
doi:
10.3791/64431
, , , , , ,
1Department of Biology,Mt. Allison University, 2Department of Molecular Biology,Umeå University, 3Biology Centre Czech Academy of Sciences,Institute of Parasitology

Summary

תרבית חוץ גופית היא שיטת זיהוי ישירה לנוכחות חיידקים חיים. פרוטוקול זה מתאר שיטות לתרבית של מגוון סוגי Borrelia spirochetes, כולל אלה של Borrelia burgdorferi sensu lato complex, קדחת התקפית של מיני Borrelia ו- Borrelia miyamotoi. מינים אלה הם חסונים וגדלים לאט, אך ניתן לתרבית אותם.

Abstract

הבורליה מורכבת משלוש קבוצות של מינים, אלה של קבוצת ליים בורליוזיס (LB), הידועה גם בשם B. burgdorferi sensu lato (s.l.) ולאחרונה סווגה מחדש לבורליאלה, קבוצת קדחת התקפית (RF) Borrelia, וקבוצה שלישית של ספירוצ’טים הקשורים לזוחלים. שיטות מבוססות תרבית נותרו תקן הזהב לזיהוי מעבדה של זיהומים חיידקיים הן למחקר והן לעבודה קלינית, שכן תרבית של פתוגנים מנוזלי גוף או רקמות מזהה ישירות פתוגנים משכפלים ומספקת חומר מקור למחקר. Borrelia ו– Borreliella spirochetes הם מהירים וגדלים לאט, ולכן אינם מתורבתים בדרך כלל למטרות קליניות; עם זאת, התרבות נחוצה למחקר. פרוטוקול זה מדגים את המתודולוגיה והמתכונים הדרושים לתרבית מוצלחת של ספירוצ’טות LB ו- RF, כולל כל המינים המוכרים מקומפלקס B. burgdorferi s.l. כולל B. afzelii, B. americana, B. andersonii, B. bavariensis, B. bissettii/bissettiae, B. burgdorferi sensu stricto (s.s.), B. californiensis, B. carolinensis, B. chilensis, B. finlandensis, B. garinii, B. japonica, B. kurtenbachii, B. lanei, B. lusitaniae, B. maritima, B. mayonii, B. spielmanii, B. tanukii, B. turdi, B. sinica, B. valaisiana, B. yangtzensis, and RFspirochetes, B. anserina, B. coriaceae, B. crocidurae, B. duttonii, B. hermsii, B. hispanica, B. persica, B. recurrentis ו-B. miyamotoi. המדיום הבסיסי לגידול ספירוצ’טות LB ו- RF הוא מדיום ברבור-סטונר-קלי (BSK-II או BSK-H), התומך באופן אמין בצמיחת ספירוצ’טות בתרבויות מבוססות. כדי להיות מסוגל לגדל מבודד בורליה מבודד חדש מדגימות שמקורן בקרציות או פונדקאי שבהן מספר הספירוצ’ט הראשוני נמוך בחיסון, עדיף מדיום קלי-פטנקופר שונה (MKP). מדיום זה תומך גם בצמיחה של B. miyamotoi. ההצלחה של טיפוח של spirochetes RF תלוי גם באופן קריטי באיכות המרכיבים.

Introduction

בורליה (שם מדעי: Borrelia) הוא סוג של חיידק ספירוצ’טה הכולל שלושה סוגים עיקריים: קבוצת ליים בורליוזיס (LB), קבוצת קדחת התקפית (RF), וקבוצה פחות מאופיינת המוגבלת לכאורה לזוחלים. טקסונומיה של בורליה נמצאת בשטף עם הופעתן של מתודולוגיות מולקולריות המאפשרות השוואה בין גנום לפרוטאום, כפי שנכון לגבי רוב הקבוצות הטקסונומיות האחרות 1,2,3,4,5,6,7. קבוצת LB (המכונה גם קבוצת מחלת ליים) נקראת באופן מסורתי Borrelia burgdorferi sensu lato על שם חבריה המאופיינים ביותר Borrelia burgdorferi sensu stricto.  מאמר זה משתמש בטרמינולוגיה הנפוצה ביותר כיום: LB, RF והקבוצה המשויכת לזוחלים, ומתאר את פרוטוקולי התרבות עבור קבוצות LB ו- RF.

כפי שניתן היה לצפות עבור בן משפחה Spirochaetaceae, Borrelia יכול לאמץ את הצורה הספירלית הארוכה והדקה הייחודית, בדרך כלל 20-30 מיקרומטר אורך ו 0.2-0.3 מיקרומטר רוחב. עם זאת, תאי בורליה הם פלאומורפיים מאוד ויכולים לאמץ צורות רבות אחרות הן בתרבית והן in vivo 1,8 כתוצאה מהמבנה התאי והגנטי המורכב שלהם. בצורתו הספירוכטלית, המורפולוגיה של גל הסינוס המישורי נובעת מכך שהאנדופלגלה הצירית שלו מסתובבת בחלל הפריפלסמי שבין הממברנות הפנימיות והחיצוניות. מבנה זה מאפשר לתאים להיות תנועתיים מאוד, כאשר הקרום החיצוני מכיל חלבונים המאפשרים לתא לתקשר עם רקמות מארחות 9,10. הביטוי של חלבוני הממברנה החיצונית מווסת היטב ומשפיע לא רק על פלישת רקמת המאכסן אלא גם על אינטראקציה עם מערכת החיסון המארחת11. ביטוי גנים מורכב זה מאפשר לתאי בורליה לנוע בין סביבות שונות מאוד של מארחי חוליות ווקטורים חסרי חוליות. הגנום של בורליה הוא יוצא דופן בקרב פרוקריוטים, המורכב מכרומוזום ליניארי ולא מעגלי. בנוסף לכרומוזום הליניארי, מיני בורליה מכילים 7-21 פלסמידים, חלקם ליניאריים וחלקם מעגליים. הפלסמידים מכילים את רוב הגנים הדרושים להסתגלות ולאלימות של המאכסן, והפלסמידים המעגליים שמקורם בפרופג’ים נחשבים כאחראים לרוב זרימת הגנים האופקית בין תאים ספירוכטליים12,13. בהתאם לתפקיד בהסתגלות המארח, חלקם, אולי רבים או כולם, מחברי קבוצת הבורליוזיס ליים מאבדים פלסמידים בתרבות14. הזן ה”מותאם למעבדה” הנחקר ביותר של B. burgdorferi, B31, מכיל רק שבעה מתוך תשעת הפלסמידים שנמצאו במבודדים פראיים של מין זה15. באופן דומה, B. garinii מאבד פלסמידים בתרבות16. כמה מחקרים הראו כי מיני RF ו- B. miyamotoi שומרים על פלסמידים בתרבית14,17, אך עבודות אחרונות מדגימות שינויים בפלסמידים והדבקה עם גידול מבחנה לטווח ארוך 18.

שיטות מבוססות תרבית נותרו תקן הזהב לזיהוי מעבדה של זיהומים חיידקיים, הן במחקר והן בעבודה קלינית14,17. תרבית של פתוגנים מנוזלי גוף או רקמות מזהה ישירות פתוגנים משכפלים ומספקת חומר מקור למחקר14,17. פרוטוקול זה מדגים את המתודולוגיה והמתכונים הדרושים לתרבית מוצלחת של הספירוכטות של קבוצת LB, כמו גם RF Borrelia ו– B. miyamotoi. המדיום הבסיסי לגידול ספירוצ’טות בורליה הוא מדיום ברבור-סטונר-קלי (BSK-II או BSK-H הזמין מסחרית), עם או בלי אנטיביוטיקה כדי להפחית את הצמיחה של פרוקריוטים מזהמים. מדיום זה הותאם ממדיום ששימש במקור לתמיכה ב-RF Borrelia19, שונה עוד יותר על ידי Stoenner20 ולאחר מכן על ידי Barbour21. שינויים רבים פותחו מאז, לכל אחד מהם יש השפעות על הפיזיולוגיה של החיידקים שיכולים להשפיע על גדילה, זיהומיות ופתוגניות22. מדיום זה תומך באופן אמין בגדילה של ספירוכטות בתרבויות מבוססות ושימש לבידוד ספירוכטות מדגימות קרציות, יונקים וקליניות23. הווריאציה שפותחה לאחרונה, מדיום קלי-פטנקופר (MKP), יכולה לספק הצלחה טובה יותר בבידוד, מורפולוגיה ותנועתיות בעת בידוד מבודדי בורליה חדשים מדגימות סביבתיות, כאשר מספר הספירוצ’טים הנמצאים במדגם הזמין לזרע התרבית נמוך23,24. בכל המקרים, הצלחת הטיפוח תלויה באופן קריטי במדיום המוכן ובשימוש במרכיבים המתאימים; לא כל המרכיבים המסחריים מייצרים מדיום באיכות גבוהה. תרביות מחוסנות יכולות להיות מודגרות בנוחות מבלי לרעוד באינקובטור קונבנציונלי של 32-34 מעלות צלזיוס בנוכחות כמות קטנה של שאריות חמצן סביבתי. Borrelia spirochetes הם אנאירובים אך חשופים בטבע לתנודות בריכוזי חמצן ופחמן דו חמצני ומגיבים לשינויים בביטוי גנים26,27,28,29. לפיכך, ביטוי גנים, גדילה ומחקרים מטבוליים אחרים צריכים לשלוט על רמות חמצן ופחמן דו חמצני באמצעות אינקובטור מבוקר חמצן או תא אנאירובי. בתרבית, תרביות נבדקות מדי שבוע, או לעתים קרובות יותר, עבור נוכחות של spirochetes עם מיקרוסקופ שדה כהה או מיקרוסקופ ניגודיות פאזה. כתמי תרבית יכולים להיות מוכתמים בכתמי כסף, אימונוהיסטוכימיה, או באמצעות שימוש בזנים מתויגים פלואורסצנטית29,30. PCR ואחריו ריצוף DNA היא שיטה רגישה וספציפית לזהות ולזהות גנטית או לאשר את מיני Borrelia 30,31,32,33.

קיימות וריאציות קטנות רבות על BSK-II, וחלקן זמינות מסחרית. הפרוטוקול המתואר כאן בסעיף 1 עובד מברבור (1984)21. מדיום MKP נוזלי הוא מדיום שפותח לאחרונה ומתואר בסעיף 2. הוא מוכן על פי פרוטוקול33,34 שדווח בעבר, אשר, בדומה למדיום BSK, מורכב משני שלבים: הכנת מדיום בסיסי והכנת מדיום שלם. ניתן להכין מדיום תרבית בורליה עם אנטיביוטיקה או בלעדיה, כמתואר בסעיף 3; חוק האנטיביוטיקה להפחתת חיידקים מזהמים שהוכנסו בעת חיסון בדגימות קליניות או סביבתיות, כמתואר בסעיף 4; אם מחסנים בתרבית Borrelia sp. טהורה, ייתכן שלא יהיה צורך באנטיביוטיקה. ייצור מניות בורליה לטווח ארוך הוא לעתים קרובות חשוב, ופרוטוקול לכך מתואר בסעיף 5. סעיף 6 מתאר שימוש במדיה זו כדי לבודד שיבוטים טהורים של Borrelia sensu lato מדגימות קליניות או סביבתיות. ישנן מספר גישות אפשריות36; להלן אחד שנמצא יעיל. אמצעי הציפוי המשמש בפרוטוקול זה הוא שינוי של מדיום ציפוי BSK-II37 ו- MKP בינוני 34 (עם סרום ארנב גדל ל -10%38).

Protocol

כל המחקרים שכללו דגימות שהתקבלו מנבדקים אנושיים אושרו על ידי ועדת הביקורת המוסדית של האוניברסיטה ו / או המתקן הרפואי הרלוונטיים, והסכמה מדעת בכתב התקבלה מהמשתתפים לפני איסוף הדגימות. כל המחקרים שכללו דגימות שנלקחו מבעלי חיים אושרו ונערכו תחת הנחיות הוועדה המוסדית לאתיקה של בעלי חיים. במי…

Representative Results

מדיה תרבותית Borrelia BSK ו- MKP, וריאנטים, הם מדיה תרבותית עשירה עם מרכיבים שצריך להכין ולעקר ברצף. כאשר מכינים אותו נכון, מדיום BSK צריך להיות אדום-כתום ושקוף (איור 1). עכירות ומשקעים הנמשכים לאחר ההתחממות מצביעים על מרכיבים בעייתיים, ייצור בינוני או זיהום; מדיום כזה הוא הטוב בי…

Discussion

תרבית המעבדה של חיידקים היא קרש קפיצה למחקר. היתרון העמוק שמעניקה היכולת לתרבות בא לידי ביטוי במאבק, במשך יותר ממאה שנה שהגיע לשיאו רק לאחרונה בהצלחה, לתרבות Treponema pallidum, הספירוכטה שהיא הסוכן האטיולוגי של עגבת44. גם ספירוצ’טות בורליה מאתגרות את התרבות, אך התרבות אפשרית …

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה חלקית על ידי מועצת המחקר למדעי הטבע וההנדסה של קנדה והקרן הקנדית למחלות ליים (AB ו- VL), מועצת המחקר השבדית (SB, M-LF ו- IN), TAČR GAMA 2 פרויקט – “תמיכה באימות פוטנציאל יישום 2.0 במרכז הביולוגי CAS” (TP01010022) (MG ו- NR), ועל ידי מענק ממשרד הבריאות של הרפובליקה הצ’כית NV19-05-00191 (MG ו- NR). אנו מודים ל-S. Vranjes (2021, מעבדת Rudenko) עבור התמונה באיור 4 ול-J. Thomas-Ebbett (2021, מעבדת לויד) עבור התמונות באיור 5. אנו מודים לכל החוקרים שתרמו לתחום ומתנצלים בפני אלה שלא יכולנו לצטט את עבודתם בשל מגבלות מקום.

Materials

1.7 mL tubes VWR 87003-294 Standard item – any supplier will do
0.2 µm Sterile syringe filter  VWR 28145-501 Standard item – any supplier will do
10 µL barrier pipette tip Neptune BT10XLS3 Standard item – any supplier will do
10 mL Serological pipettes  Celltreat 229011B Standard item – any supplier will do
1000 µL barrier pipette tip Neptune BT1000.96 Standard item – any supplier will do
15 mL tube Celltreat 188261 Standard item – any supplier will do
20 µL barrier pipette tip Neptune BT20 Standard item – any supplier will do
20 mL Sterile syringe  BD 309661 Standard item – any supplier will do
200 µL barrier pipette tip Neptune BT200 Standard item – any supplier will do
25 mL Screw Cap Culture Tubes Fisher Scientific 14-933C Standard item – any supplier will do
25 mL Serological pipettes Celltreat 229025B Standard item – any supplier will do
3 mL Sterile syringe BD 309657 Standard item – any supplier will do
35% BSA  Sigma A-7409 Source is important – see note
5 mL Serological pipettes  Celltreat 229006B Standard item – any supplier will do
50 mL tube Celltreat 229421 Standard item – any supplier will do
6.5 ml MKP glass tubes  Schott Schott Nr. 26 135 115 Standard item – any supplier will do
Amikacine Sigma PHR1654 Standard item – any supplier will do
Amphotericin B Sigma A9528-100MG Standard item – any supplier will do
Bactrim/rimethoprim/sulfamethoxazole Sigma PHR1126-1G Standard item – any supplier will do
BBL Brucella broth  BD 211088 Standard item – any supplier will do
Biosafety Cabinet Labconco 302419100 Standard item – any supplier will do
Blood collection tubes (yellow top – ACD) Fisher Scientific BD Vacutainer Glass Blood Collection Tubes with Acid Citrate Dextrose (ACD) Standard item – any supplier will do
BSK-H Medium [w 6% Rabbit serum]  Darlynn biologicals BB83-500 Standard item – any supplier will do
centrifuge  Eppendorf model 5430 Standard item – any supplier will do
Citric acid TrisodiumSaltDihydrate Sigma C-8532 100 g Standard item – any supplier will do
CMRL Gibco BRL 21540 500 mL Standard item – any supplier will do
CMRL-1066 Gibco 21-510-018 Standard item – any supplier will do
Cryogenic Tubes (Nalgene) Fisher Scientific 5000-0020 Standard item – any supplier will do
Deep Petri with stacking ring 100 mm × 25 mm Sigma P7741 Standard item – any supplier will do
Digital Incubator VWR model 1545 Standard item – any supplier will do
DMSO ThermoFisher D12345 Standard item – any supplier will do
Filters for filter sterilization Millipore 0.22μm GPExpressPLUS Membrane SCGPU05RE Standard item – any supplier will do
Gelatin Difco BD 214340 500 g Standard item – any supplier will do
Glass Culture Tubes Fisher Scientific 99449-20 Standard item – any supplier will do
Glucose Sigma G-7021 1 kg Standard item – any supplier will do
Glycerol Sigma G5516 Standard item – any supplier will do
Hemafuge (Hematocrit & Immuno hematology centrifuge ) Labwissen Model 3220 Standard item – any supplier will do
HEPES Sigma  H-3784 100 g Standard item – any supplier will do
N-acetylglucoseamine Sigma  A-3286 25 g Standard item – any supplier will do
Neopeptone Difco  BD 211681 500 g Standard item – any supplier will do
Neubauer Hematocytometer Sigma  Z359629 Standard item – any supplier will do
Phase contrast microscope  Leitz Standard item – any supplier will do
Phosphomycin Sigma P5396-1G Standard item – any supplier will do
Phosphomycine Sigma P5396 Standard item – any supplier will do
Pipetboy Integra Standard item – any supplier will do
Precision Standard Balance OHAUS model TS200S Standard item – any supplier will do
Pyruvic acid (Na salt) Sigma P-8574 25 g Standard item – any supplier will do
Rabbit Serum  Gibco 16-120-032 Source is important 
Rabbit Serum  Sigma R-4505  100 mL Source is important 
Rifampicin Sigma R3501-1G Standard item – any supplier will do
Sodium bicarbonate Sigma S-5761     500 g Standard item – any supplier will do
Sufametaxazole  Sigma PHR1126 Standard item – any supplier will do
TC Yeastolate Difco  BD 255752 100 g Standard item – any supplier will do
Transfer Pipettes VWR 470225-044 Standard item – any supplier will do
Trimethoprim Sigma PHR1056 Standard item – any supplier will do
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referencias

  1. Aberer, E., Duray, P. H. Morphology of Borrelia burgdorferi: Structural patterns of cultured borreliae in relation to staining methods. Journal of Clinical Microbiology. 29 (4), 764-772 (1991).
  2. Estrada-Peña, A., Cabezas-Cruz, A. Phyloproteomic and functional analyses do not support a split in the genus Borrelia (phylum Spirochaetes). BMC Evolutionary Biology. 19 (1), 54 (2019).
  3. Parte, A. C., Carbasse, J. S., Meier-Kolthoff, J. P., Reimer, L. C., Göker, M. List of prokaryotic names with standing in nomenclature (LPSN) moves to the DSMZ. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 70 (11), 5607-5612 (2020).
  4. . List of prokaryotic names with standing in nomenclature Genus Borrelia Available from: https://lpsn.dsmz.de/gnus/borrelia (2022)
  5. Margos, G., et al. The genus Borrelia reloaded. PLoS ONE. 13 (12), 0208432 (2018).
  6. Gupta, R. S., et al. Distinction between Borrelia and Borreliella is more robustly supported by molecular and phenotypic characteristics than all other neighbouring prokaryotic genera: Response to Margos’ et al. The genus Borrelia reloaded. PLoS ONE. 14 (12), 0221397 (2019).
  7. Barbour, A. G., Qiu, W., Trujillo, S., Dedysh, P., DeVos, B., Hedlund, P., Kampfer, F. A., Rainey, W. B., Whitman, Borreliella. Bergey’s Manual of Systematics of Archaea and Bacteria. , 1-22 (2019).
  8. Rudenko, N., Golovchenko, M., Kybicova, K., Vancova, M. Metamorphoses of Lyme disease spirochetes: Phenomenon of Borrelia persisters. Parasites and Vectors. 12 (1), 1-10 (2019).
  9. Strnad, M., et al. Nanomechanical mechanisms of Lyme disease spirochete motility enhancement in extracellular matrix. Communications Biology. 4 (1), 268 (2021).
  10. Niddam, A. F., et al. Plasma fibronectin stabilizes Borrelia burgdorferi-endothelial interactions under vascular shear stress by a catch-bond mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (17), 3490-3498 (2017).
  11. Anderson, C., Brissette, C. A. The brilliance of Borrelia: Mechanisms of host immune evasion by Lyme disease-causing Spirochetes. Pathogens. 10 (3), 1-17 (2021).
  12. Brisson, D., Drecktrah, D., Eggers, C. H., Samuels, D. S. Genetics of Borrelia burgdorferi. Annual Review of Genetics. 46, 515-536 (2012).
  13. Schwartz, I., Margos, G., Casjens, S. R., Qiu, W. G., Eggers, C. H. Multipartite genome of lyme disease Borrelia: Structure, variation and prophages. Current Issues in Molecular Biology. 42 (1), 409-454 (2021).
  14. Lopez, J. E., et al. Relapsing fever spirochetes retain infectivity after prolonged in vitro cultivation. Vector-Borne and Zoonotic Diseases. 8 (6), 813-820 (2008).
  15. Schwan, T. G., Burgdorfer, W., Garon, C. F. Changes in infectivity and plasmid profile of the Lyme disease spirochete, Borrelia Burgdorferi, as a result of in vitro cultivation. Infection and Immunity. 56 (8), 1831-1836 (1988).
  16. Biškup, U. G., Strle, F., Ružić-Sabljić, E. Loss of plasmids of Borrelia burgdorferi sensu lato during prolonged in vitro cultivation. Plasmid. 66 (1), 1-6 (2011).
  17. Gilmore, R. D., et al. Borrelia miyamotoi strain LB-2001 retains plasmids and infectious phenotype throughout continuous culture passages as evaluated by multiplex PCR. Ticks and Tick-borne Diseases. 12 (1), 101587 (2021).
  18. Krishnavajhala, A., Armstrong, B. A., Lopez, J. E. The impact of in vitro cultivation on the natural life cycle of the tick-borne relapsing fever spirochete Borrelia turicatae. PLoS One. 15 (10), 0239089 (2020).
  19. Kelly, R. Cultivation of Borrelia hermsi. Science. 173 (3995), 443-444 (1971).
  20. Stoenner, H. G. Biology of Borrelia hermsii in Kelly Medium. Applied Microbiology. 28 (4), 540-543 (1974).
  21. Barbour, A. G. Isolation and cultivation of Lyme disease spirochetes. Yale Journal of Biology and Medicine. 57 (4), 521-525 (1984).
  22. Wang, G., et al. Variations in Barbour-Stoenner-Kelly culture medium modulate infectivity and pathogenicity of Borrelia burgdorferi clinical isolates. Infection and Immunity. 72 (11), 6702-6706 (2004).
  23. Pollack, R. J., Telford, S. R., Spielman, A. Standardization of medium for culturing Lyme disease spirochetes. Journal of Clinical Microbiology. 31 (5), 1251-1255 (1993).
  24. Ružiæ-Sabljiæ, E., et al. Comparison of MKP and BSK-H media for the cultivation and isolation of Borrelia burgdorferi sensu lato. PLoS One. 12 (2), 0171622 (2017).
  25. Ružić-Sabljić, E., et al. Comparison of isolation rate of Borrelia burgdorferi sensu lato in two different culture media, MKP and BSK-H. Clinical Microbiology and Infection. 20 (7), 636-641 (2014).
  26. Hyde, J. A., Trzeciakowski, J. P., Skare, J. T. Borrelia burgdorferi alters its gene expression and antigenic profile in response to CO2 levels. Journal of Bacteriology. 189 (2), 437-445 (2007).
  27. Seshu, J., Boylan, J. A., Gherardini, F. C., Skare, J. T. Dissolved oxygen levels alter gene expression and antigen profiles in Borrelia burgdorferi. Infection and Immunity. 72 (3), 1580-1586 (2004).
  28. Raffel, S. J., Williamson, B. N., Schwan, T. G., Gherardini, F. C. Colony formation in solid medium by the relapsing fever spirochetes Borrelia hermsii and Borrelia turicatae. Ticks and Tick-borne Diseases. 9 (2), 281-287 (2018).
  29. Margos, G., et al. Long-term in vitro cultivation of Borrelia miyamotoi. Ticks and Tick-borne Diseases. 6 (2), 181-184 (2015).
  30. Middelveen, M. J., et al. Culture and identification of Borrelia spirochetes in human vaginal and seminal secretions. F1000Research. 3, 309 (2014).
  31. Moriarty, T. J., et al. Real-time high resolution 3D imaging of the Lyme disease spirochete adhering to and escaping from the vasculature of a living host. PLoS Pathogens. 4 (6), 1000090 (2008).
  32. Cerar, T., Korva, M., Avšič-Županc, T., Ružić-Sabljić, E. Detection, identification and genotyping of Borrellia spp. In rodents in Slovenia by PCR and culture. BMC Veterinary Research. 11, 188 (2015).
  33. Liebisch, G., Sohns, B., Bautsch, W. Detection and typing of Borrelia burgdorferi sensu lato in Ixodes ricinus ticks attached to human skin by PCR. Journal of Clinical Microbiology. 36 (11), 3355-3358 (1998).
  34. Ružić-Sabljić, E., Strle, F. Comparison of growth of Borrelia afzelii, B. gavinii, and B. burgdorferi sense strict in MKP and BSK-II medium. International Journal of Medical Microbiology. 294 (6), 407-412 (2004).
  35. Preac-Mursic, V., Wilske, B., Schierz, G. European Borrelia burgdorferi isolated from humans and ticks culture conditions and antibiotic susceptibility. Zentralblatt fur Bakteriologie Mikrobiologie und Hygiene. Series A, Medical Microbiology, Infectious Diseases, Virology, Parasitology. 263 (1-2), 112-118 (1986).
  36. Preac-Mursic, V., Wilske, B., Reinhardt, S. Culture of Borrelia burgdorferi on six solid media. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 10 (12), 1076-1079 (1991).
  37. Rosa, P. A., Hogan, D. Colony formation by Borrelia burgdorferi in solid medium: clonal analysis of osp locus variants. First International Conference on Tick Borne Pathogens at the Host-Vector Interface: An Agenda for Research. , 95-103 (1992).
  38. Wagemakers, A., Oei, A., Fikrig, M. M., Miellet, W. R., Hovius, J. W. The relapsing fever spirochete Borrelia miyamotoi is cultivable in a modified Kelly-Pettenkofer medium, and is resistant to human complement. Parasites and Vectors. 7 (1), 4-9 (2014).
  39. Oliver, J. H., et al. First isolation and cultivation of Borrelia burgdorferi sensu lato from Missouri. Journal of Clinical Microbiology. 36 (1), 1-5 (1998).
  40. Greenfield, E. A. Myeloma and hybridoma cell counts and viability checks. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (10), 689-690 (2019).
  41. Baradaran-Dilmaghani, R., Stanek, G. In vitro susceptibility of thirty borrelia strains from various sources against eight antimicrobial chemotherapeutics. Infection. 24 (1), 60-63 (1996).
  42. Ružić-Sabljić, E., Podreka, T., Maraspin, V., Strle, F. Susceptibility of Borrelia afzelii strains to antimicrobial agents. International Journal of Antimicrobial Agents. 25 (6), 474-478 (2005).
  43. Sicklinger, M., Wienecke, R., Neubert, U. In vitro susceptibility testing of four antibiotics against Borrelia burgdorferi: A comparison of results for the three genospecies Borrelia afzelii, Borrelia garinii, and Borrelia burgdorferi sensu stricto. Journal of Clinical Microbiology. 41 (4), 1791-1793 (2003).
  44. Edmondson, D. G., Hu, B., Norris, S. J. Long-term in vitro culture of the syphilis spirochete treponema pallidum subsp. Pallidum. mBio. 9 (3), 01153 (2018).
  45. Wilhelmsson, P., et al. Prevalence and diversity of Borrelia species in ticks that have bitten humans in Sweden. Journal of Clinical Microbiology. 48 (11), 4169-4176 (2010).
  46. Toledo, A., et al. Phylogenetic analysis of a virulent Borrelia species isolated from patients with relapsing fever. Journal of Clinical Microbiology. 48 (7), 2484-2489 (2010).
  47. Elbir, H., et al. Genome sequence of the Asiatic species Borrelia persica. Genome Announcements. 2 (1), 01127 (2014).
  48. Sapi, E., et al. Improved culture conditions for the growth and detection of Borrelia from human serum. International Journal of Medical Sciences. 10 (4), 362-376 (2013).
  49. Liveris, D., et al. Quantitative detection of Borrelia burgdorferi in 2-millimeter skin samples of erythema migrans lesions: Correlation of results with clinical and laboratory findings. Journal of Clinical Microbiology. 40 (4), 1249-1253 (2002).
  50. Wormser, G. P., et al. Comparison of the yields of blood cultures using serum or plasma from patients with early Lyme disease. Journal of Clinical Microbiology. 38 (4), 1648-1650 (2000).
  51. Lagal, V., Postic, D., Ruzic-Sabljic, E., Baranton, G. Genetic diversity among Borrelia strains determined by single-strand conformation polymorphism analysis of the ospC gene and its association with invasiveness. Journal of Clinical Microbiology. 41 (11), 5059-5065 (2003).
  52. Lin, Y. P., Diuk-Wasser, M. A., Stevenson, B., Kraiczy, P. Complement evasion contributes to Lyme Borreliae-host associations. Trends in Parasitology. 36 (7), 634-645 (2020).
  53. Real-time PCR: understanding Ct. Application Note Real-time PCR. Thermo Fisher Scientific Inc Available from: https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/Documents/PDFs/PG1503-PJ9169-CO019879-Re-brand-Real-Time-PCR-Undertanding-Ct-Value-Americas-FHR.pdf (2016)
  54. Adams, B., Walter, K. S., Diuk-Wasser, M. A. Host specialisation, immune cross-reaction and the composition of communities of co-circulating Borrelia strains. Bulletin of Mathematical Biology. 83 (6), 66 (2021).
  55. Marosevic, D., et al. First insights in the variability of Borrelia recurrentis genomes. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (9), 0005865 (2017).
  56. Koetsveld, J., et al. Development and optimization of an in vitro cultivation protocol allows for isolation of Borrelia miyamotoi from patients with hard tick-borne relapsing fever. Clinical Microbiology and Infection. 23 (7), 480-484 (2017).
  57. Kuleshov, K. V., et al. Whole genome sequencing of Borrelia miyamotoi isolate Izh-4: Reference for a complex bacterial genome. BMC Genomics. 21 (1), 16 (2020).
  58. Replogle, A. J., et al. Isolation of Borrelia miyamotoi and other Borreliae using a modified BSK medium. Scientific Reports. 11 (1), 1926 (2021).
  59. Stanek, G., Reiter, M. The expanding Lyme Borrelia complex-clinical significance of genomic species. Clinical Microbiology and Infection. 17 (4), 487-493 (2011).
  60. Seifert, S. N., Khatchikian, C. E., Zhou, W., Brisson, D. Evolution and population genomics of the Lyme borreliosis pathogen, Borrelia burgdorferi. Trends in Genetics. 31 (4), 201-207 (2015).
  61. Kurokawa, C., et al. Interactions between Borrelia burgdorferi and ticks. Nature Reviews Microbiology. 18 (10), 587-600 (2020).
  62. Coburn, J., et al. Lyme disease pathogenesis. Current Issues in Molecular Biology. 42 (1), 473-518 (2021).
  63. Wolcott, K. A., Margos, G., Fingerle, V., Becker, N. S. Host association of Borrelia burgdorferi sensu lato: A review. Ticks and Tick-borne Diseases. 12 (5), 101766 (2021).
  64. Thompson, D., Watt, J. A., Brissette, C. A. Host transcriptome response to Borrelia burgdorferi sensu lato. Ticks and Tick-borne Diseases. 12 (2), 101638 (2021).
  65. Chaconas, G., Moriarty, T. J., Skare, J., Hyde, J. A. Live imaging. Current Issues in Molecular Biology. 42 (1), 385-408 (2021).
  66. Kerstholt, M., Netea, M. G., Joosten, L. A. B. Borrelia burgdorferi hijacks cellular metabolism of immune cells: Consequences for host defense. Ticks and Tick-borne Diseases. 11 (3), 101386 (2020).
  67. Rudenko, N., Golovchenko, M. Sexual transmission of Lyme Borreliosis? The question that calls for an answer. Tropical Medicine and Infectious Disease. 6 (2), 87 (2021).
  68. Cutler, S. J., et al. Diagnosing Borreliosis. Vector-Borne and Zoonotic Diseases. 17 (1), 2-11 (2017).
  69. Middelveen, M. J., et al. Persistent Borrelia infection in patients with ongoing symptoms of Lyme disease. Healthcare. 6 (2), 33 (2018).
  70. Bernard, Q., Grillon, A., Lenormand, C., Ehret-Sabatier, L., Boulanger, N. Skin Interface, a key player for Borrelia multiplication and persistence in Lyme Borreliosis. Trends in Parasitology. 36 (3), 304-314 (2020).
  71. Bobe, J. R., et al. Recent progress in Lyme disease and remaining challenges. Frontiers in Medicine. 8, 666554 (2021).
  72. Branda, J. A., Steere, A. C. Laboratory diagnosis of lyme borreliosis. Clinical Microbiology Reviews. 34 (2), 1-45 (2021).

Tags

SpirochetesBorrelia BurgdorferiRelapsing Fever BorreliaBorrelia MiyamotoiCultureBSK-II MediumBacterial GrowthRabbit SerumGelatinAnaerobic AtmosphereIncubation Temperature

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artículo
Berthold, A., Faucillion, M., Nilsson, I., Golovchenko, M., Lloyd, V., Bergström, S., Rudenko, N. Cultivation Methods of Spirochetes from Borrelia burgdorferi Sensu Lato Complex and Relapsing Fever Borrelia. J. Vis. Exp. (189), e64431, doi:10.3791/64431 (2022).
Descargar cita
Reimpresiones y permisos

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image