Фаго-опосредованная генетическая манипуляция болезнью Лайма Spirochete Borrelia burgdorferi

Разработка инструментов для генетической манипуляции спирохетальной бактерией Borrelia burgdorferi добавила неизмеримую ценность пониманию природы болезни Лайма 1,2,3,4. B. burgdorferi имеет необычно сложный геном, состоящий из небольшой линейной хромосомы и как линейных, так и круговых плазмид ^5,6. Спонтанная потеря плазмид, внутригенная перестройка (перемещение генов из одной плазмиды в другую в пределах одного организма) и горизонтальный перенос генов (HGT, движение ДНК между двумя организмами) привели к головокружительному количеству генетической гетерогенности среди B. burgdorferi (например, см. Schutzer et ^al.7). Полученные генотипы (или «штаммы») являются членами одного и того же вида, но имеют генетические различия, которые влияют на их способность передавать и заражать разных хозяев млекопитающих 8,9,10,11. В настоящем докладе термин «штамм» будет использоваться для обозначения B. burgdorferi с особым естественным генетическим фоном; термин «клон» будет использоваться для обозначения штамма, который был генетически модифицирован для определенной цели или в результате экспериментальных манипуляций.

Молекулярный набор инструментов, доступный для использования у B. burgdorferi, включает выбираемые маркеры, генные репортеры, векторы челноков, транспозонный мутагенез, индуцируемые промоторы и контризбираемые маркеры (для обзора см. Drektrah and Samuels¹²). Эффективное использование этих методологий требует искусственного введения гетерологичной (чужеродной) ДНК в интересующий штамм B. burgdorferi. У B. burgdorferi введение гетерологичной ДНК достигается почти исключительно с помощью электропорации, метода, который использует импульс электричества, чтобы сделать бактериальную мембрану временно проницаемой для небольших кусочков ДНК, введенных в среду¹. Большинство клеток (по оценкам, ≥99,5%) погибают от пульса, но остальные клетки имеют высокую частоту удержания гетерологичной ДНК¹³. Хотя это считается одним из наиболее высокоэффективных методов введения ДНК в бактерии, частота электропорации в B. burgdorferi очень низкая (в пределах от 1 трансформанта в 5 × 10⁴ до 5 × 10⁶ клеток)¹³. Барьеры для достижения более высоких частот трансформации, по-видимому, являются как техническими, так и биологическими. Технические барьеры для успешной электропорации B. burgdorferi включают как необходимое количество ДНК (>10 мкг), так и требование к спирохетам находиться именно в правильной фазе роста (средняя бревна, от 2 × 10⁷ клеток·мл⁻¹ до 7 × 10⁷ клеток·мл⁻¹) при получении электрокомпетентных ячеек^12,13. Однако эти технические барьеры может быть легче преодолеть, чем биологические барьеры.

Исследователи болезни Лайма признают, что клоны B. burgdorferi можно разделить на две широкие категории в отношении их способности к генетическому манипулированию^13,14. Высокопроходимые, адаптированные к лабораторным исследованиям изоляты часто легко трансформируются, но обычно теряют плазмиды, необходимые для инфекционности, ведут себя физиологически аберрантно и не способны заражать хозяина млекопитающих или сохраняться в клещевом векторе^12,13. Хотя эти клоны были полезны для препарирования молекулярной биологии спирохеты в лаборатории, они не имеют большой ценности для изучения спирохеты в биологическом контексте энзоотического цикла. С другой стороны, низкопроходимые инфекционные изоляты ведут себя физиологически, отражая инфекционное состояние, и могут завершать инфекционный цикл, но обычно непокорны к введению гетерологичной ДНК и, следовательно, трудно манипулировать для исследования^12,13. Трудность преобразования изолятов низкого прохода связана, по меньшей мере, с двумя различными факторами: (i) изоляты низкого прохода часто плотно слипаются вместе, особенно в условиях высокой плотности, необходимых для электропорации, тем самым блокируя многие клетки либо от полного применения электрического заряда, либо от доступа к ДНК в среде^13,15; и ii) B. burgdorferi кодирует по меньшей мере две различные плазмидные системы рестрикции-модификации (R-M), которые могут быть потеряны в изолятах с высоким проходом^14,16. Системы R-M эволюционировали, чтобы позволить бактериям распознавать и устранять чужеродную ДНК¹⁷. Действительно, несколько исследований b. burgdorferi показали, что эффективность трансформации увеличивается, когда источником ДНК является B. burgdorferi, а не Escherichia coli^13,16. К сожалению, приобретение необходимой высокой концентрации ДНК для электропорации у B. burgdorferi является дорогостоящей и трудоемкой перспективой. Другая потенциальная проблема при электропорации и выборе изолятов низкого прохода заключается в том, что процесс, по-видимому, благоприятствует трансформантам, которые потеряли критическую плазмиду, связанную с вирулентностью, lp25 14,18,19; таким образом, сам акт генетического манипулирования низкопроходными изолятами B. burgdorferi посредством электропорации может отбирать клоны, которые не подходят для биологически значимого анализа в энзоотическом цикле²⁰. Учитывая эти проблемы, система, в которой гетерологичная ДНК может быть электротрансформирована в высокопроходные клоны B. burgdorferi, а затем перенесена в инфекционные изоляты низкого прохода методом, отличным от электропорации, может быть желанным дополнением к растущей коллекции молекулярных инструментов, доступных для использования в спирохете болезни Лайма.

Помимо трансформации (поглощения голой ДНК), существуют два других механизма, с помощью которых бактерии регулярно поглощают гетерологичную ДНК: конъюгация, которая представляет собой обмен ДНК между бактериями, находящимися в прямом физическом контакте друг с другом, и трансдукция, которая представляет собой обмен ДНК, опосредованный бактериофагом²¹. Действительно, способность бактериофага опосредуть HGT была использована в качестве экспериментального инструмента для препарирования молекулярных процессов в ряде бактериальных систем 22,23,24. B. burgdorferi от природы не компетентен для поглощения голой ДНК, и существует мало доказательств того, что B. burgdorferi кодирует аппарат, необходимый для успешного спряжения. Однако в предыдущих докладах описывалась идентификация и предварительная характеристика φBB-1, умеренного бактериофага B. burgdorferi 25,26,27,28. φBB-1 упаковывает семейство плазмид размером 30 кб, обнаруженных в B. burgdorferi²⁵; члены этого семейства были обозначены cp32s. В соответствии с ролью φBB-1 в участии в HGT среди штаммов B. burgdorferi, Stevenson et al. сообщили об идентичном cp32, обнаруженном в двух штаммах с разрозненными cp32s, предполагая недавнее разделение этого cp32 между этими двумя штаммами, вероятно, через трансдукцию²⁹. Есть также доказательства значительной рекомбинации через HGT среди cp32s в относительно стабильном геноме 30,31,32,33. Наконец, способность φBB-1 трансдуцировать как cp32s, так и гетерологичную челночную векторную ДНК между клетками одного и того же штамма и между клетками двух разных штаммов была продемонстрирована ранее^27,28. Учитывая эти результаты, φBB-1 был предложен в качестве еще одного инструмента, который будет разработан для вскрытия молекулярной биологии B. burgdorferi.

Целью настоящего доклада является детализация метода индуцирования и очистки фага φBB-1 от B. burgdorferi, а также предоставление протокола для выполнения трансдукционного анализа между клонами B. burgdorferi и отбора и скрининга потенциальных трансдуктантов.