Medición de la contractilidad cardíaca en cardiomiocitos primarios humanos adultos aislados

Todos los métodos se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices y reglamentos pertinentes. Todos los corazones humanos utilizados para los estudios no eran trasplantables y se obtuvieron éticamente mediante el consentimiento legal informado (primera persona o pariente más cercano) de donantes de órganos cadavéricos en los Estados Unidos (EE. UU.). Los protocolos de recuperación y la experimentación in vitro fueron aprobados previamente por las Juntas de Revisión Institucional (IRB, por sus siglas en inglés) en los centros de trasplante dentro de la Red de Trasplantes de Obtención de Órganos (OPTN, por sus siglas en inglés) de los Estados Unidos. Además, todas las transferencias de corazones de donantes son totalmente rastreables y revisadas periódicamente por las autoridades federales de los Estados Unidos. NOTA: Aplique todos los procedimientos de seguridad necesarios durante la ejecución de este protocolo, incluido el uso de equipo de protección personal adecuado (p. ej., batas de laboratorio, gafas de seguridad, guantes). 1. Aislamiento de cardiomiocitos (1 día antes de medir la contractilidad) Reperfundir los corazones de los donantes inmediatamente después de su llegada al laboratorio con una solución cardiopléjica patentada6 helada y aislar enzimáticamente miocitos primarios humanos adultos de los ventrículos 11,12,13,14,15. A continuación, mantener los cardiomiocitos en suspensión y almacenarlos con 10 mL de solución A (110 mM de sacarosa, 0,005 mM de CaCl 2, 3 mM de MgCl 2, 70 mM de KOH, 60 mM de ácido lactobiónico, 10 mM de KH 2 PO4, 20 mM de taurina, 20 mM de L-histidina, 20 mM de HEPES, 2 mM de ácido L-glutámico, 2 mM de ácido L-(-)-málico, pH 7.4 con KOH) en viales de Wheaton de 20 mL (Tabla de Materiales) a temperatura refrigerada hasta que sean interrogados experimentalmente.NOTA: Almacene 200,000 células por vial. 2. Preparación del recubrimiento de laminina (1 día antes de medir la contractilidad) Coloque un solo cubreobjetos de vidrio (cuadrado de 25 mm x 25 mm, Tabla de Materiales) en cada pocillo de una placa de cultivo de ocho pocillos (Tabla de Materiales). A continuación, recubra los cubreobjetos con laminina a una concentración de 5 μg/mL. Para ello, añadir 800 μL de la cepa recombinante humana de Laminina 521 (Tabla de Materiales, almacenada a -20 °C) a 7,2 mL de solución B (145 mM de NaCl, 4 mM de KCl, 2,5 mM de CaCl 2, 1 mM de MgCl2, 11,1 mM de glucosa y 10 mM de HEPES, pH 7,4 con NaOH) y mezclar bien. Deje caer 200 μL de la solución de laminina diluida en el centro de cada cubreobjetos. A continuación, tapa el plato y apílalo en una nevera a 4 °C.NOTA: Prepare varias placas de cultivo de ocho pocillos para asegurarse de que haya suficientes cubreobjetos recubiertos de laminina. 3. Preparación de cardiomiocitos tolerantes a Ca2+ (el día de la medición de la contractilidad) Sacar un vial de células de la nevera, aspirar la solución A del vial y añadir 10 ml refrigerados de solución B.NOTA: Asegúrese de que las células no sean succionadas y disperse la solución B en el vial colocando la pipeta en el interior de la parte superior de la pared del vial. Tape el frasco de células y luego gírelo suavemente para asegurarse de que las células se dispersen por toda la solución B. Finalmente, deje que las celdas se asienten durante 1 h a temperatura ambiente (RT). 4. Preparación del sistema de registro (el día de la medición de la contractilidad) NOTA: El sistema de registro incluye una caja de control de temperatura, un estimulador, una perfusión controlada por ordenador y botellas de perfusión controladas por presión, un software de adquisición interno que permite la selección de regiones de interés (ROI) y la visualización de transitorios de contractilidad, microscopio invertido, cámara celular y cámara (Figura 1). Encienda el sistema de vacío de succión. Luego, retire la cubierta del microscopio, enciéndala, conecte la cámara (Tabla de materiales, Figura 1) y, finalmente, confirme que el ventilador esté encendido para asegurarse de que la cámara no se sobrecaliente. Luego, encienda la placa calefactora del microscopio (Tabla de materiales) y la caja de control de temperatura (Tabla de materiales, Figura 1) y ajústelas a la temperatura de funcionamiento adecuada. A continuación, encienda el estimulador de campo (Tabla de Materiales, Figura 1) y el sistema de presión. Finalmente, conecte el tubo de la solución (Tabla de Materiales) a la cámara de registro (Tabla de Materiales, Figura 1). 5. Preparación de los compuestos problema (el día de la medición de la contractilidad) Dimetilsulfóxido diluido (DMSO; Tabla de Materiales) 1.000 veces en solución C (145 mM de NaCl, 4 mM de KCl, 1,8 mM de CaCl 2, 1 mM de MgCl2, 11,1 mM de glucosa y 10 mM de HEPES, pH 7,4 con NaOH) para hacer una solución de vehículo con DMSO al 0,1 %. Para probar un compuesto a 1 vez, 10 veces, 100 veces y 1000 veces su exposición terapéutica de 0,001 μM, disuelva el compuesto de prueba en DMSO a una concentración de 1 mM. Diluya esta solución en serie con DMSO para producir tres existencias adicionales de DMSO (por ejemplo, 0,001 mM, 0,01 mM y 0,1 mM). Por último, diluir 1.000 veces cada compuesto de ensayo en 100 ml de solución C para obtener las concentraciones finales de ensayo (0,001 μM, 0,01 μM, 0,1 μM y 1 μM). Agregue la solución del vehículo y las soluciones de las concentraciones micromolares finales del compuesto a botellas de vidrio de 100 ml (Tabla de materiales, Figura 1) y luego conecte las botellas al sistema de perfusión accionado por presión (Tabla de materiales, Figura 1). A continuación, cebe el sistema de perfusión con un programa controlado por ordenador (Tabla de Materiales) utilizando una presión de 200-300 mbar para proporcionar un flujo de perfusión constante a una velocidad de 1,8 mL/min.NOTA: No realice el experimento si se encuentra que el compuesto de prueba está asociado con un problema de solubilidad. Además, formule las soluciones de prueba compuestas a partir de soluciones madre dentro de los 30 minutos anteriores a la aplicación experimental a las células. 6. Siembra de cardiomiocitos (el día de la medición de la contractilidad) Tome una placa de ocho pocillos que contenga cubreobjetos recubiertos de laminina del refrigerador a 4 °C y coloque con cuidado un cubreobjetos en una cámara de registro muy limpia (Figura 1). A continuación, vuelva a colocar la placa de ocho pocillos en la nevera a 4 °C hasta el siguiente emplatado.NOTA: Use una toallita sin pelusa (Tabla de materiales) para limpiar el cubreobjetos recubierto mientras mantiene el cubreobjetos recubierto con una capa delgada de laminina. Además, asegúrese de desechar los cubreobjetos usados en un recipiente para objetos punzocortantes. A continuación, tome un vial escalado de células (paso 3.2) y aspire la solución B del vial para alcanzar un volumen lo más pequeño posible sin perder células (~200 μL). A continuación, dispense los 200 μL de células en la cámara del microscopio de registro montada en la platina de un microscopio invertido (Tabla de materiales). Deje que las células se asienten en el cubreobjetos durante 5 minutos. Mientras espera que las células se asienten por completo, abra el campo de visión en el microscopio y determine si la densidad celular es adecuada (~70%) para que comience la ejecución experimental.NOTA: Asegúrese de que la succión no aspire todas las células si se dispensan más de 200 μL. 7. Registro de la contractilidad de los cardiomiocitos Una vez finalizado el recubrimiento, equilibre las células durante 5 minutos perfundiéndolas continuamente con la solución C utilizando el sistema de perfusión impulsado por presión (Tabla de materiales). Ajuste la succión correctamente, encienda tanto la caja de control de temperatura como la placa calefactora, y configúrelas para que suministren ~35 °C. A continuación, estimule las células con un voltaje supraumbral a una frecuencia de estimulación de 1 Hz (pulso bipolar de 3 ms de duración) en un estimulador de campo con un par de hilos de platino colocados en lados opuestos de la cámara conectados a un estimulador de campo. Ajuste la amplitud del pulso estimulante a 1 V, y luego auméntela hasta que los cardiomiocitos comiencen a generar ciclos de contracción-relajación. Utilice un valor de umbral de 1,5x durante todo el experimento.NOTA: Seleccione células sanas con morfología en forma de bastoncillo y estrías claras. A continuación, ajuste el campo de visión y concéntrese en mostrar el mayor número posible de células de contracción (Figura 2A). A continuación, muestre las imágenes digitalizadas de las células dentro del software de adquisición del sistema de registro de contractilidad óptica. Este software utiliza una cámara de alta resolución y alta velocidad de fotogramas con una velocidad de 150 FPS (Tabla de materiales, Figura 1) para grabar una secuencia de vídeo que contiene varios miocitos en el mismo fotograma.NOTA: Esto proporciona suficiente resolución temporal y espacial para capturar y medir la dinámica del sarcómero de varios miocitos sanos simultáneamente. Los procesadores modernos de alto número de núcleos se aprovechan para permitir el cálculo paralelo de los cambios en la longitud del sarcómero a partir de la transmisión de vídeo en tiempo real (los datos de densidad óptica se recopilan de las regiones de interés [ROI] definidas por el usuario colocadas sobre las imágenes de cardiomiocitos sanos y paralelas al eje de contracción, Figura 2B). Los datos de intensidad óptica muestran bandas brillantes y oscuras correspondientes a las líneas Z de los cardiomiocitos (Figura 1, Figura 2C). Finalmente, estos datos se muestran al usuario con fines de monitoreo y se guardan en un disco para su posterior análisis (Figura 2C).Evite las áreas de las células que no estén enfocadas. Además, no coloque los ROI cerca del borde de las células, ya que los cambios en la contracción de las células durante la aplicación de medicamentos pueden hacer que los ROI no puedan leer la contracción de las células. Cuando se completa la selección de las ROI y las contracciones cumplen con los estándares necesarios para su uso (p. ej., acortamiento del sarcómero >1%; contracción rítmica tras la aplicación de una frecuencia de estimulación de 1 Hz, ausencia de eventos arrítmicos), inicie el experimento para evaluar los efectos de un compuesto. En el cuadro 1 se muestran el protocolo de estimulación y la secuencia de aplicación de las concentraciones de ensayo del compuesto. El software de adquisición gestionará, de forma automatizada, la adquisición y visualización de datos y el etiquetado de las concentraciones de ensayo y el tiempo de tratamiento.NOTA: Aplique las concentraciones de prueba si la contracción se mantiene en una amplitud estable durante todo el período de referencia del vehículo. Descalifique las celdas que muestran un run-up o run-down. Además, asegúrese de que la perfusión se cambie a las diferentes concentraciones de prueba durante todo el experimento. Una vez finalizado el experimento y el almacenamiento de datos en el servidor, apague la perfusión y el calentador, detenga la estimulación, limpie la cámara del microscopio con agua destilada, luego retire el cubreobjetos de vidrio y seque bien la cámara.NOTA: Limpie la cámara a fondo, ya que esto es fundamental para evitar exponer el siguiente conjunto de células a cualquier compuesto prematuramente, invalidando así cualquier dato recopilado. A continuación, realice una nueva siembra de cardiomiocitos y realice un experimento adicional para obtener datos suficientes para completar la prueba del compuesto o probar un nuevo compuesto. 8. Apagar el sistema de registro de contractilidad óptica Cuando se completen las pruebas diarias de los compuestos, primero apague todo el equipo que no sea necesario para limpiar el sistema y copie los datos para el análisis fuera de línea. A continuación, retire los frascos de vidrio de 100 ml (Tabla de materiales) que contienen soluciones de concentraciones de prueba final y reemplácelos con frascos de vidrio llenos hasta la mitad con la solución concentrada RBS 25 (Tabla de materiales). Perfundir la solución RBS a través de la cámara del microscopio durante 5 minutos, luego desconectar el tubo de perfusión de la cámara, limpiarlo con agua destilada y, finalmente, secarlo bien.NOTA: Asegúrese de que la aspiradora funcione bien para evitar posibles inundaciones. A continuación, conecte el tubo de perfusión al tubo de drenaje. Utilizando el software del sistema de perfusión accionado por presión (Tabla de materiales), haga funcionar la solución RBS durante 10 minutos mientras se asegura de que la presión y el caudal estén ajustados adecuadamente. A continuación, perfundir DMSO al 1% durante 5 min y luego agua destilada durante 15-20 min para completar la limpieza del sistema de perfusión. Apague la luz del microscopio y coloque su tapa. Luego, desconecte los cables de la cámara de la caja en el costado del microscopio y apague el ventilador. Asegúrese de que todas las botellas usadas se envíen para su limpieza y autoclave. Finalmente, asegúrese de que todos los cubos de drenaje estén llenos o menos.NOTA: Asegúrese de que haya suficientes cubreobjetos recubiertos de laminina para usar al día siguiente. Por último, copie los archivos de la carpeta de adquisición de todos los experimentos realizados en cada sistema de grabación y péguelos en un servidor de copia de seguridad seguro para realizar un análisis adicional fuera de línea. A continuación, elimine todos los archivos de datos de la carpeta de adquisición. 9. Análisis de los datos de contractilidad Realice análisis fuera de línea utilizando el software de análisis y una macro personalizada para promediar los datos. El software de análisis calcula e informa de varias métricas a partir de los datos de dinámica del sarcómero producidos por el software de adquisición. En la Figura 2D se proporciona una lista detallada de estos parámetros.NOTA: La aplicación de técnicas de software de bajo nivel permite analizar muchas series de grabaciones en 5 s. El parámetro principal para evaluar los cambios en la contractilidad inducidos por fármacos es la amplitud de la contractilidad (% de acortamiento del sarcómero = cambio en la longitud del sarcómero). Se calcula como la longitud del sarcómero en la contracción máxima/longitud del sarcómero en reposo y se promedia en los últimos 20 transitorios de contractilidad para cada concentración de ensayo. Cuantificar los efectos de los compuestos de ensayo en la amplitud de contractilidad promediada en relación con la condición de control del vehículo de referencia específica de cada cardiomiocito. Exprese los resultados medios como media ± SEM y elabore un gráfico que represente el efecto de la concentración del compuesto problema en la amplitud de la contractilidad. A continuación, ajuste la curva de concentración-respuesta a la ecuación de Hill utilizando un software de análisis (Tabla de Materiales) para derivar los valores de IC50 (concentración que produce una inhibición del 50% de la amplitud de la contractilidad) y EC50 (concentración que produce un aumento del 50% en la amplitud de la contractilidad). Además de la amplitud de contractilidad, también puede calcular otros parámetros:Postcontracción: Identificar la postcontracción como una contracción secundaria espontánea transitoria del cardiomiocito que se produce antes de la siguiente contracción regular y produce una contracción anormal y no sincronizada. Falla de contracción: Identifique la falla de contracción como la incapacidad del estímulo eléctrico para inducir una contracción. Variabilidad a corto plazo (VST) y alternancias: Visualice estos dos parámetros en gráficos de Poincaré de variabilidad de amplitud de contracción.Calcular el STV (∑|CAn + 1 − CAn| (20 × √2) −1) con los últimos 20 transitorios de cada período de concentración de los artículos de control y ensayo. Identifique los alternos como transitorios repetitivos de amplitud de contractilidad alterna corta y larga. Para calcular la incidencia de pro-arritmia, normalice los valores de STV al valor de control del vehículo de cada célula, grafique la postcontracción, la falla de contracción, STV y alternantes, y expréselos como % de la incidencia de células que exhiben cada una de las señales. Complete el perfil mecanicista multiparamétrico con el cálculo del tiempo Ato pico, decaimiento a 30% de relajación (Decay 30), decaimiento a relajación 90% (Decay 90), tiempo a relajación 90% (TR90) (Figura 2D), longitud basal del sarcómero, tiempo hasta el pico del 50%, altura del pico, longitud del sarcómero en la contractilidad máxima, velocidad máxima de contracción y velocidad máxima de relajación12. Al igual que la amplitud de la contractilidad, exprese estos parámetros en relación con la condición de control basal específica de cada cardiomiocitos y grafíquelos en gráficos de concentración-respuesta.