מדידת התכווצות הלב בקרדיומיוציטים ראשוניים אנושיים בוגרים מבודדים

כל השיטות בוצעו בהתאם להנחיות ולתקנות הרלוונטיות. כל הלבבות האנושיים ששימשו למחקרים לא היו ניתנים להשתלה והושגו באופן אתי על ידי הסכמה משפטית מדעת (גוף ראשון או קרוב משפחה) מתורמי איברים גופיים בארצות הברית (ארה”ב). פרוטוקולי ההחלמה והניסויים במבחנה אושרו מראש על ידי ועדות סקירה מוסדיות (IRBs) במרכזי השתלות בתוך רשת השתלות רכישת האיברים של ארה”ב (OPTN). יתר על כן, כל העברות הלבבות התורמים ניתנות למעקב מלא ונבדקות מעת לעת על ידי הרשויות הפדרליות בארה”ב. הערה: החל את כל נהלי הבטיחות הדרושים במהלך ביצוע פרוטוקול זה, כולל לבישת ציוד מגן אישי מתאים (לדוגמה, מעילי מעבדה, משקפי בטיחות, כפפות). 1. בידוד קרדיומיוציטים (יום אחד לפני מדידת התכווצות) לנקב מחדש את לבבות התורם מיד עם הגעתם למעבדה עם תמיסה קניינית קניינית קרה כקרח6 ולבודד מיוציטים ראשוניים אנושיים בוגרים אנזימטיים מחדרי 11,12,13,14,15. לאחר מכן, לשמור על cardiomyocytes בהשעיה ולאחסן אותם עם 10 מ”ל של פתרון A (110 mM סוכרוז, 0.005 mM CaCl 2, 3 mM MgCl 2, 70 mM KOH, 60 mM חומצה לקטוביונית, 10 mM KH 2 PO4, 20 mM טאורין, 20 mM L-היסטידין, 20 mM HEPES, 2 mM L-חומצה גלוטמית, 2 mM L-(-)-חומצה מאלית, pH 7.4 עם KOH) בבקבוקוני Wheaton 20 מ”ל (טבלת חומרים) בטמפרטורת קירור עד לחקירתם הניסיונית.הערה: אחסן 200,000 תאים לכל בקבוקון. 2. הכנת ציפוי למינין (יום לפני מדידת התכווצות) הניחו מכסה זכוכית בודד (25 מ”מ x 25 מ”מ מרובע, טבלת חומרים) בכל באר של צלחת תרבית בת שמונה בארות (טבלה של חומרים). לאחר מכן, צפו את הכיסויים בלמינין בריכוז של 5 מיקרוגרם/מ”ל. לשם כך, הוסף 800 μL של מלאי למינין 521 רקומביננטי אנושי (טבלה של חומרים, מאוחסן ב -20 ° C) ל -7.2 מ”ל של תמיסה B (145 mM NaCl, 4 mM KCl, 2.5 mM CaCl 2, 1 mM MgCl2, 11.1 mM גלוקוז, ו 10 mM HEPES, pH 7.4 עם NaOH) וערבב היטב. זרוק 200 μL של תמיסת הלמינין המדוללת למרכז כל כיסוי. לאחר מכן, מכסים את הצלחת ועורמים אותה במקרר בטמפרטורה של 18 מעלות.הערה: הכינו מספר צלחות תרבית בנות שמונה בארות כדי להבטיח שיש מספיק כיסויים מצופים למינין. 3. הכנת קרדיומיוציטים סובלניים Ca2+ (ביום מדידת התכווצות) מוציאים בקבוקון תאים מהמקרר, שואפים תמיסה A מהבקבוקון ומוסיפים 10 מ”ל קירור של תמיסה B.הערה: יש לוודא שהתאים אינם נשאבים ולפזר תמיסה B לתוך הבקבוקון על ידי הנחת פיפטה בחלק הפנימי של החלק הפנימי של דופן הבקבוקון. מכסים את בקבוקון התאים ולאחר מכן מערבלים בעדינות כדי להבטיח שהתאים מפוזרים לאורך תמיסה B. לבסוף, אפשרו לתאים להסתפק במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר (RT). 4. הכנת מערכת ההקלטה (ביום מדידת התכווצות) הערה: מערכת ההקלטה כוללת קופסת בקרת טמפרטורה, ממריץ, זילוח מונחה לחץ הנשלט על ידי מחשב, בקבוקי זילוח מונעי לחץ, תוכנת רכישה פנימית המאפשרת בחירת אזורי עניין (ROIs) ותצוגה של מעברי כיווץ, מיקרוסקופ הפוך, תא תא ומצלמה (איור 1). הפעל את מערכת ואקום היניקה. לאחר מכן, הסירו את מכסה המיקרוסקופ, הפעילו אותו, חברו את המצלמה (טבלת חומרים, איור 1), ולבסוף, ודאו שהמאוורר מופעל כדי להבטיח שהמצלמה לא תתחמם יתר על המידה. לאחר מכן, הפעילו את פלטת החימום במיקרוסקופ (Table of Materials) ואת קופסת בקרת הטמפרטורה (Table of Materials, איור 1), וכוונו אותן לטמפרטורת ההפעלה הנכונה. לאחר מכן, הפעילו את מגרה השדה (טבלה של חומרים, איור 1) ואת מערכת הלחץ. לבסוף, חברו את צינורות התמיסה (Table of Materials) לתא ההקלטה (Table of Materials, איור 1). 5. הכנת תרכובות בדיקה (ביום מדידת ההתכווצות) דילול דימתיל סולפוקסיד (DMSO; טבלת חומרים) פי 1,000 בתמיסה C (145 mM NaCl, 4 mM KCl, 1.8 mM CaCl 2, 1 mM MgCl2, 11.1 mM גלוקוז ו-10 mM HEPES, pH 7.4 עם NaOH) ליצירת פתרון רכב DMSO של 0.1%. כדי לבדוק תרכובת בפי 1, פי 10, פי 100 ופי 1000 מהחשיפה הטיפולית שלה של 0.001 מיקרומטר, יש להמיס את תרכובת הבדיקה ב-DMSO בריכוז של 1 מילימול. דלל פתרון זה באופן סדרתי עם DMSO כדי לייצר שלושה מלאי DMSO נוספים (לדוגמה, 0.001 mM, 0.01 mM ו- 0.1 mM). לבסוף, דללו כל תרכובת בדיקה פי 1,000 ב-100 מ”ל של תמיסה C כדי לקבל ריכוזי בדיקה סופיים (0.001 מיקרומטר, 0.01 מיקרומטר, 0.1 מיקרומטר ו-1 מיקרומטר). הוסיפו את תמיסת הרכב והתמיסות של ריכוזי המיקרומולר הסופיים של התרכובת לבקבוקי זכוכית של 100 מ”ל (Table of Materials, איור 1) ולאחר מכן חברו את הבקבוקים למערכת הזילוח מונעת הלחץ (Table of Materials, איור 1). לאחר מכן, הפעל את מערכת הזילוח באמצעות תוכנית מונחית מחשב (Table of Materials) תוך שימוש בלחץ של 200-300 mbar כדי לספק זרימת זילוח קבועה בקצב של 1.8 מ”ל/דקה.הערה: אין לבצע את הניסוי אם נמצא כי תרכובת הבדיקה קשורה לבעיית מסיסות. כמו כן, נסחו את פתרונות הבדיקה המורכבים מתמיסות מלאי תוך 30 דקות לפני היישום הניסיוני על התאים. 6. ציפוי קרדיומיוציטים (ביום מדידת התכווצות) הוציאו צלחת בת שמונה בארות המכילה כיסויים מצופים למינין מהמקרר בטמפרטורה של 4°C והניחו בזהירות מכסה אחד בתא הקלטה נקי היטב (איור 1). לאחר מכן, מחזירים את צלחת שמונה הבארות למקרר 4 מעלות צלזיוס עד לציפוי הבא.הערה: השתמש במגבון ללא סיבים (רשימת חומרים) כדי לנגב את הכיסוי המצופה תוך שמירה על ציפוי הכיסוי בשכבה דקה של למינין. כמו כן, הקפידו להשליך כיסויים משומשים במיכל חד. לאחר מכן, קח בקבוקון של תאים (שלב 3.2) ושאפו תמיסה B מהבקבוקון כדי להגיע לנפח קטן ככל האפשר מבלי לאבד תאים (~ 200 μL). לאחר מכן, שחררו את 200 μL התאים לתוך תא מיקרוסקופ הקלטה רכוב על הבמה של מיקרוסקופ הפוך (טבלה של חומרים). תן לתאים להתיישב על הכיסוי במשך 5 דקות. בזמן ההמתנה להתיישבות המלאה של התאים, פתחו את שדה הראייה במיקרוסקופ וקבעו אם צפיפות התאים מספקת (~70%) לתחילת ריצת הניסוי.הערה: ודא שהיניקה אינה שואפת את כל התאים החוצה אם מחלקים יותר מ -200 μL. 7. הקלטה של התכווצות cardiomyocyte לאחר השלמת הציפוי, אזנו את התאים למשך 5 דקות על ידי ערבוב רציף שלהם עם תמיסה C באמצעות מערכת זילוח מונעת לחץ (טבלה של חומרים). התאם את היניקה כראוי, הפעל הן את תיבת בקרת הטמפרטורה והן את צלחת החימום, והגדר אותם לספק ~ 35 ° C. לאחר מכן, לעורר את התאים עם מתח סף supra-threshold בתדר קצב 1 הרץ (דופק דו קוטבי של 3 ms משך) על מגרה שדה עם זוג חוטי פלטינה ממוקם משני הצדדים של התא מחובר מגרה השדה. הגדר את המשרעת של הדופק המגרה ב 1 V, ולאחר מכן להגדיל אותו עד cardiomyocytes להתחיל לייצר מחזורי התכווצות-הרפיה. השתמש בערך סף של 1.5x לאורך כל הניסוי.הערה: בחר תאים בריאים עם מורפולוגיה בצורת מוט ופסיעות ברורות. לאחר מכן, התאימו את שדה הראייה והתמקדו בהבאת תאים מתכווצים רבים ככל האפשר לתצוגה (איור 2A). לאחר מכן, להציג את התמונות הדיגיטליות של התאים בתוך תוכנת הרכישה של מערכת רישום התכווצות אופטית. תוכנה זו משתמשת במצלמה ברזולוציה גבוהה ובקצב פריימים גבוה עם קצב של 150 FPS (טבלה של חומרים, איור 1) כדי להקליט זרם וידאו המכיל מיוציטים מרובים באותו פריים.הערה: זה מספק רזולוציה זמנית ומרחבית מספקת כדי ללכוד ולמדוד את הדינמיקה של סרקומר של מספר מיוציטים בריאים בו זמנית. מעבדים מודרניים בעלי ספירת ליבות גבוהה ממונפים כדי לאפשר חישוב מקביל של שינויים באורך הסרקומר מזרם הווידאו בזמן אמת (נתוני צפיפות אופטית נאספים מאזורי עניין המוגדרים על-ידי המשתמש [ROI] הממוקמים מעל תמונות של קרדיומיוציטים בריאים ובמקביל לציר ההתכווצות, איור 2B). נתוני העוצמה האופטית מראים פסים בהירים וכהים המתאימים לקווי Z של הקרדיומיוציטים (איור 1, איור 2C). לבסוף, הנתונים האלה מוצגים למשתמש למטרות ניטור ונשמרים בדיסק לצורך ניתוח מאוחר יותר (איור 2C).הימנע מאזורים בתאים שאינם ממוקדים. כמו כן, אל תמקמו את ה-ROI קרוב לקצה התאים, מכיוון שהשינויים בהתכווצות התאים במהלך יישום התרופות עלולים לגרום לכך שה-ROI לא יוכל לקרוא את התכווצות התאים. כאשר בחירת החזר ההשקעה הושלמה והצירים עומדים בסטנדרטים הדרושים לשימוש (למשל, קיצור סרקומר >1%; התכווצות קצבית עם יישום תדר קצב של 1 הרץ, היעדר אירועים אריתמיים), התחל את הניסוי כדי להעריך את ההשפעות של תרכובת. פרוטוקול הגירוי ורצף היישום של ריכוזי הבדיקה בתרכובת מוצגים בטבלה 1. תוכנת הרכישה תנהל, באופן אוטומטי, רכישה והצגה של נתונים ותיוג ריכוזי הבדיקה וזמן הטיפול.הערה: החל ריכוזי בדיקה אם ההתכווצות נשארת באמפליטודה יציבה לאורך כל תקופת הרכב הבסיסית. פסילת תאים המציגים הפעלה או ריצה. כמו כן, יש לוודא שהזילוח עובר לריכוזי הבדיקה השונים במהלך הניסוי. עם סיום הניסוי ואחסון הנתונים בשרת, כבו את הזילוח והתנור, עצרו את הגירוי, נקו את תא המיקרוסקופ במים מזוקקים, הסירו את מכסה הזכוכית וייבשו היטב את התא.הערה: נקה את החדר ביסודיות מכיוון שזה קריטי כדי למנוע חשיפת קבוצת התאים הבאה לתרכובת כלשהי בטרם עת, ובכך לפסול את כל הנתונים שנאספו. לאחר מכן, לבצע ציפוי חדש של cardiomyocytes ולבצע ניסוי נוסף כדי לקבל מספיק נתונים להשלמת הבדיקה של התרכובת או בדיקת תרכובת חדשה. 8. כיבוי מערכת הקלטת הכיווץ האופטי לאחר השלמת הבדיקה היומית של התרכובות, תחילה כבה את כל הציוד שאינו נחוץ לניקוי המערכת והעתק את הנתונים לניתוח לא מקוון. לאחר מכן, הסר את בקבוקי הזכוכית של 100 מ”ל (טבלה של חומרים) המכילים תמיסות של ריכוזי בדיקה סופיים והחלף אותם בבקבוקי זכוכית מלאים באמצע הדרך בתמיסת RBS 25 Concentrate (טבלה של חומרים). יש לנקב את תמיסת RBS דרך תא המיקרוסקופ למשך 5 דקות, ואז לנתק את צינור הזילוח מהחדר, לנקות אותו במים מזוקקים, ולבסוף לייבש אותו היטב.הערה: ודא ששואב האבק פועל היטב כדי למנוע הצפות אפשריות. לאחר מכן, חבר את צינורות הזילוח לצינורות הניקוז. באמצעות התוכנה של מערכת הזילוח מונעת הלחץ (טבלה של חומרים), הפעל את פתרון RBS במשך 10 דקות תוך הבטחת הלחץ וקצב הזרימה מוגדרים כראוי. לאחר מכן, יש לנקב 1% DMSO למשך 5 דקות ולאחר מכן מים מזוקקים למשך 15-20 דקות כדי להשלים את ניקוי מערכת הזילוח. כבו את אור המיקרוסקופ והניחו את הכיסוי שלו. לאחר מכן, נתק את חוטי המצלמה מהקופסה בצד המיקרוסקופ וכבה את המאוורר. ודא כי כל הבקבוקים המשומשים נשלחים לניקוי autoclave. לבסוף, ודא שכל דליי הניקוז מלאים או פחות.הערה: ודא שיש מספיק כיסויים מצופים למינין לשימוש למחרת. לבסוף, העתק את הקבצים בתיקיית הרכישה של כל הניסויים שנעשו בכל מערכת הקלטה והדבק אותם בשרת גיבוי מאובטח לניתוח לא מקוון נוסף. לאחר מכן, מחק את כל קבצי הנתונים מתיקיית הרכישה. 9. ניתוח נתוני התכווצות בצע ניתוח לא מקוון באמצעות תוכנת הניתוח ומאקרו מותאם אישית כדי לחשב ממוצע של הנתונים. תוכנת הניתוח מחשבת ומדווחת על מדדים שונים מנתוני הדינמיקה של סרקומר המיוצרים על ידי תוכנת הרכישה. רשימה מפורטת של פרמטרים אלה מופיעה באיור 2D.הערה: היישום של טכניקות תוכנה ברמה נמוכה מאפשר לנתח ריצות רבות של הקלטות ב -5 שניות. הפרמטר העיקרי להערכת שינויים בהתכווצות הנגרמים על ידי תרופות הוא משרעת ההתכווצות (קיצור סרקומר % = שינוי באורך הסרקומר). הוא מחושב כאורך הסרקומר בשיא התכווצות / אורך סרקומר מנוחה וממוצע על פני 20 ארעי ההתכווצות האחרונים עבור כל ריכוז בדיקה. כמת את ההשפעות המורכבות של הבדיקה על משרעת ההתכווצות הממוצעת ביחס למצב בקרת הרכב הבסיסי הספציפי של כל קרדיומיוציטים. בטא את התוצאות הממוצעות כממוצע ± SEM והפק גרף המתווה את השפעת הריכוז של תרכובת הבדיקה על משרעת ההתכווצות. לאחר מכן, התאימו את עקומת הריכוז-תגובה למשוואת היל באמצעות תוכנת ניתוח (טבלה של חומרים) כדי לגזור ערכי IC50 (ריכוז המייצר עיכוב של 50% של משרעת התכווצות) ו-EC50 (ריכוז המייצר עלייה של 50% באמפליטודת ההתכווצות). בנוסף למשרעת ההתכווצות, ניתן גם לחשב פרמטרים אחרים:לאחר התכווצות: זהה לאחר התכווצות ככיווץ משני ספונטני חולף של הקרדיומיוציטים המתרחש לפני ההתכווצות הסדירה הבאה ומייצר התכווצות לא תקינה ולא מסונכרנת. כשל התכווצות: זהה כשל התכווצות כחוסר היכולת של הגירוי החשמלי לגרום להתכווצות. השתנות לטווח קצר (STV) ואלטרננים: דמיינו את שני הפרמטרים הללו בחלקות פואנקרה של השתנות משרעת התכווצות.חישוב STV (∑|CAn + 1 − CAn| (20 × √2) −1) עם 20 הארעיות האחרונות של כל תקופת ריכוז של מאמר בקרה ובדיקה. זהה אלטרנים כמעברי משרעת התכווצות קצרים וארוכים לסירוגין. כדי לחשב את ההיארעות של פרו-הפרעות קצב, נרמלו את ערכי ה-STV לערך בקרת הרכב של כל תא, התוויית לאחר התכווצות, כשל התכווצות, STV ואלטרננים, ובטאו אותם כאחוזים משכיחות התאים המציגים כל אחד מהאותות. השלם את הפרופיל המכניסטי הרב-פרמטרי עם חישוב הזמן שיא אטו, דעיכה ל-30% הרפיה (דעיכה 30), דעיכה ל-90% הרפיה (דעיכה 90), זמן ל-90% הרפיה (TR90) (איור 2D), אורך סרקומר בסיסי, זמן ל-50% שיא, גובה שיא, אורך סרקומר בשיא ההתכווצות, מהירות התכווצות מקסימלית ומהירות הרפיה מרבית12. בדומה למשרעת ההתכווצות, בטאו פרמטרים אלה ביחס למצב הבקרה הבסיסי הספציפי של כל קרדיומיוציטים והציגו אותם בגרף בתרשימי ריכוז-תגובה.