Meting van hartcontractiliteit in geïsoleerde volwassen menselijke primaire cardiomyocyten

Alle methoden zijn uitgevoerd in overeenstemming met de relevante richtlijnen en voorschriften. Alle menselijke harten die voor de onderzoeken werden gebruikt, waren niet-transplanteerbaar en ethisch verkregen door geïnformeerde wettelijke toestemming (eerste persoon of naaste verwanten) van kadaverorgaandonoren in de Verenigde Staten (VS). De herstelprotocollen en in-vitro-experimenten werden vooraf goedgekeurd door Institutional Review Boards (IRB’s) in transplantatiecentra binnen het US Organ Procurement Transplant Network (OPTN). Bovendien zijn alle overdrachten van de donorharten volledig traceerbaar en periodiek gecontroleerd door de Amerikaanse federale autoriteiten. NOTITIE: Pas alle noodzakelijke veiligheidsprocedures toe tijdens de uitvoering van dit protocol, inclusief het dragen van geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (bijv. laboratoriumjassen, veiligheidsbrillen, handschoenen). 1. Isolatie van cardiomyocyten (1 dag voor het meten van contractiliteit) Onmiddellijk na aankomst in het laboratorium donorharten opnieuw perfuseren met ijskoude gepatenteerde cardioplegische oplossing6 en enzymatisch volwassen menselijke primaire myocyten isoleren uit de ventrikels 11,12,13,14,15. Houd vervolgens de cardiomyocyten in suspensie en bewaar ze met 10 ml oplossing A (110 mM sucrose, 0,005 mM CaCl 2, 3 mM MgCl 2, 70 mM KOH, 60 mM lactobionzuur, 10 mM KH 2 PO4, 20 mM taurine, 20 mM L-histidine, 20 mM HEPES, 2 mM L-glutaminezuur, 2 mM L-(-)-appelzuur, pH 7,4 met KOH) in 20 ml Wheaton-injectieflacons (materiaaltabel) bij een gekoelde temperatuur totdat ze experimenteel worden ondervraagd.OPMERKING: Bewaar 200.000 cellen per injectieflacon. 2. Voorbereiding van lamininecoating (1 dag voor het meten van contractiliteit) Plaats een enkel glazen dekglaasje (25 mm x 25 mm vierkant, Tabel met materialen) in elk putje van een kweekplaat met acht putjes (Tabel met materialen). Smeer vervolgens de dekglaasjes in met laminine in een concentratie van 5 μg/ml. Voeg hiervoor 800 μL van de humane recombinante laminine 521-voorraad (materiaaltabel, bewaard bij -20 °C) toe aan 7,2 ml oplossing B (145 mM NaCl, 4 mM KCl, 2,5 mM CaCl 2, 1 mM MgCl2, 11,1 mM glucose en 10 mM HEPES, pH 7,4 met NaOH) en meng goed. Laat 200 μL van de verdunde laminineoplossing in het midden van elk dekglaasje vallen. Dek het bord vervolgens af en stapel het in een koelkast van 4 °C.NOTITIE: Bereid meerdere kweekplaten met acht putjes voor om ervoor te zorgen dat er voldoende gelamineerde dekglaasjes zijn. 3. Bereiding van Ca2+-tolerante cardiomyocyten (op de dag van het meten van contractiliteit) Haal een injectieflacon met cellen uit de koelkast, zuig oplossing A op uit de injectieflacon en voeg een gekoelde 10 ml oplossing B toe.OPMERKING: Zorg ervoor dat de cellen niet worden afgezogen en dispergeer oplossing B in de injectieflacon door de pipet aan de binnenkant van de bovenkant van de injectieflaconwand te plaatsen. Sluit de injectieflacon met cellen af en draai deze voorzichtig rond om ervoor te zorgen dat de cellen door oplossing B worden verspreid. Laat de cellen ten slotte 1 uur bezinken bij kamertemperatuur (RT). 4. Voorbereiding van het registratiesysteem (op de dag van de meting van de contractiliteit) OPMERKING: Het registratiesysteem omvat een temperatuurregelkast, stimulator, computergestuurde drukgestuurde perfusie, drukgestuurde perfusieflessen, interne acquisitiesoftware die de selectie van interessegebieden (ROI’s) en weergave van contractiliteitstransiënten mogelijk maakt, omgekeerde microscoop, celkamer en camera (Figuur 1). Schakel het zuigvacuümsysteem in. Verwijder vervolgens het deksel van de microscoop, zet het aan, sluit de camera aan (Tabel met materialen, Figuur 1) en controleer ten slotte of de ventilator is ingeschakeld om ervoor te zorgen dat de camera niet oververhit raakt. Schakel vervolgens de microscoopverwarmingsplaat (Tabel met materialen) en de temperatuurregelkast (Tabel met materialen, Figuur 1) in en stel ze in op de juiste bedrijfstemperatuur. Schakel vervolgens de veldstimulator (Tabel met materialen, Figuur 1) en het druksysteem in. Sluit ten slotte de slang van de oplossing (Tabel met materialen) aan op de opnamekamer (Tabel met materialen, Figuur 1). 5. Bereiding van de testverbindingen (op de dag van de meting van de contractiliteit) Verdund dimethylsulfoxide (DMSO; Tabel met materialen) 1.000-voudig in oplossing C (145 mM NaCl, 4 mM KCl, 1,8 mM CaCl 2, 1 mM MgCl2, 11,1 mM glucose en 10 mM HEPES, pH 7,4 met NaOH) om een 0,1% DMSO-voertuigoplossing te maken. Om een verbinding te testen op 1-voudig, 10-voudig, 100-voudig en 1000-voudig van de therapeutische blootstelling van 0,001 μM, lost u de testverbinding op in DMSO met een concentratie van 1 mM. Verdun deze oplossing serieel met DMSO om nog drie DMSO-voorraden te produceren (bijv. 0,001 mM, 0,01 mM en 0,1 mM). Verdun ten slotte elke testmassa 1,000-voudig in 100 ml oplossing C om de uiteindelijke testconcentraties te verkrijgen (0,001 μM, 0,01 μM, 0,1 μM en 1 μM). Voeg de mediumoplossing en oplossingen van de uiteindelijke micromolaire concentraties van de verbinding toe aan glazen flessen van 100 ml (Materiaaltabel, Figuur 1) en sluit de flessen vervolgens aan op het drukgestuurde perfusiesysteem (Materiaaltabel, Figuur 1). Vul vervolgens het perfusiesysteem met een computergestuurd programma (Tabel met materialen) met een druk van 200-300 mbar om een constante perfusiestroom te leveren met een snelheid van 1.8 ml/min.OPMERKING: Voer het experiment niet uit als blijkt dat de teststof verband houdt met een probleem met de oplosbaarheid. Formuleer ook de samengestelde testoplossingen uit voorraadoplossingen binnen 30 minuten voorafgaand aan de experimentele toepassing op de cellen. 6. Plateren van cardiomyocyten (op de dag van het meten van contractiliteit) Neem een bord met acht putjes met gelamineerde dekglaasjes uit de koelkast van 4 °C en plaats voorzichtig een dekglaasje in een zeer goed gereinigde opnamekamer (Figuur 1). Zet de plaat met acht putjes vervolgens terug in de koelkast van 4 °C tot de volgende plaat.NOTITIE: Gebruik een pluisvrij doekje (Tabel met materialen) om het gecoate dekglaasje op te vegen terwijl u het dekglaasje bedekt houdt met een dunne laag laminine. Zorg er ook voor dat u gebruikte dekglaasjes in een naaldencontainer gooit. Neem vervolgens een geëscaleerde injectieflacon met cellen (stap 3.2) en zuig oplossing B uit de injectieflacon om een zo klein mogelijk volume te bereiken zonder cellen te verliezen (~200 μL). Doseer vervolgens de 200 μL cellen in de opnamemicroscoopkamer die op de tafel van een omgekeerde microscoop is gemonteerd (Tabel met materialen). Laat de cellen 5 minuten op het dekglaasje bezinken. Terwijl u wacht tot de cellen volledig tot rust zijn gekomen, opent u het gezichtsveld op de microscoop en bepaalt u of de celdichtheid voldoende is (~70%) om de experimentele run te starten.NOTITIE: Zorg ervoor dat de afzuiging niet alle cellen wegzuigt als er meer dan 200 μL wordt afgegeven. 7. Registratie van contractiliteit van cardiomyocyten Nadat het uitplateren is voltooid, brengt u de cellen gedurende 5 minuten in evenwicht door ze continu te perfunderen met oplossing C met behulp van het drukgestuurde perfusiesysteem (materiaaltabel). Stel de zuigkracht correct af, zet zowel de temperatuurregelkast als de verwarmingsplaat aan en stel ze in op ~35 °C. Stimuleer vervolgens de cellen met een bovendrempelspanning met een stimulatiefrequentie van 1 Hz (bipolaire puls van 3 ms) op een veldstimulator met een paar platinadraden aan weerszijden van de kamer die is aangesloten op een veldstimulator. Stel de amplitude van de stimulerende puls in op 1 V en verhoog deze totdat de cardiomyocyten contractie-ontspanningscycli beginnen te genereren. Gebruik tijdens het experiment een waarde van 1,5x de drempelwaarde.OPMERKING: Selecteer gezonde cellen met staafvormige morfologie en duidelijke strepen. Pas vervolgens het gezichtsveld aan en concentreer u op het in beeld brengen van zoveel mogelijk samentrekkende cellen (Figuur 2A). Geef vervolgens de gedigitaliseerde beelden van de cellen weer in de acquisitiesoftware van het optische contractiliteitsregistratiesysteem. Deze software maakt gebruik van een camera met hoge resolutie en hoge framesnelheid met een snelheid van 150 FPS (Tabel met materialen, Figuur 1) om een videostream op te nemen met meerdere myocyten in hetzelfde frame.OPMERKING: Dit biedt voldoende temporele en ruimtelijke resolutie om de sarcomeerdynamiek van meerdere gezonde myocyten tegelijkertijd vast te leggen en te meten. Moderne processors met een hoog aantal kernen worden gebruikt om de parallelle berekening van veranderingen in sarcomeerlengte van de videostream in realtime mogelijk te maken (optische dichtheidsgegevens worden verzameld uit door de gebruiker gedefinieerde interessegebieden [ROI] die over de beelden van gezonde cardiomyocyten worden geplaatst en evenwijdig aan de as van contractie, Figuur 2B). De optische intensiteitsgegevens tonen heldere en donkere banden die overeenkomen met de Z-lijnen van de cardiomyocyten (Figuur 1, Figuur 2C). Ten slotte worden deze gegevens voor controledoeleinden aan de gebruiker getoond en op een schijf opgeslagen voor latere analyse (Figuur 2C).Vermijd delen van de cellen die niet scherp zijn. Plaats de ROI’s ook niet dicht bij de rand van de cellen, omdat de veranderingen in de samentrekking van de cellen tijdens het aanbrengen van medicijnen ervoor kunnen zorgen dat de ROI’s de samentrekking van de cellen niet kunnen lezen. Wanneer de selectie van ROI’s is voltooid en de contracties voldoen aan de noodzakelijke gebruiksnormen (bijv. sarcomeerverkorting >1%; ritmische contractie bij toepassing van een stimulatiefrequentie van 1 Hz, afwezigheid van aritmische gebeurtenissen), start u het experiment om de effecten van een verbinding te beoordelen. Het stimulatieprotocol en de volgorde van de toepassing van de testconcentraties door de verbinding zijn weergegeven in tabel 1. De acquisitiesoftware zal op geautomatiseerde wijze de acquisitie en weergave van gegevens en de etikettering van testconcentraties en behandelingstijd beheren.OPMERKING: Pas testconcentraties toe als de contractie gedurende de gehele basisperiode van het voertuig op een stabiele amplitude blijft. Diskwalificeer cellen met een aanloop of afloop. Zorg er ook voor dat de perfusie tijdens het experiment wordt overgeschakeld naar de verschillende testconcentraties. Na voltooiing van het experiment en de gegevensopslag op de server, schakelt u de perfusie en verwarming uit, stopt u de stimulatie, reinigt u de microscoopkamer met gedestilleerd water, verwijdert u vervolgens het glazen dekglaasje en droogt u de kamer grondig af.NOTITIE: Reinig de kamer grondig, aangezien dit van cruciaal belang is om te voorkomen dat de volgende set cellen voortijdig wordt blootgesteld aan een verbinding, waardoor alle verzamelde gegevens ongeldig worden. Voer vervolgens een nieuwe beplating van cardiomyocyten uit en voer een aanvullend experiment uit om voldoende gegevens te verkrijgen voor het voltooien van het testen van de verbinding of het testen van een nieuwe verbinding. 8. Het registratiesysteem voor optische contractiliteit uitschakelen Wanneer het dagelijks testen van de verbinding(en) is voltooid, schakelt u eerst alle apparatuur uit die niet nodig is om het systeem te reinigen en kopieert u de gegevens voor offline analyse. Verwijder vervolgens de glazen flessen van 100 ml (materiaaltabel) met oplossingen van de uiteindelijke testconcentraties en vervang ze door glazen flessen die voor de helft gevuld zijn met RBS 25-concentraatoplossing (materiaaltabel). Perfuseer de RBS-oplossing gedurende 5 minuten door de microscoopkamer, koppel vervolgens de perfusieslang los van de kamer, reinig deze met gedestilleerd water en droog deze ten slotte grondig af.NOTITIE: Zorg ervoor dat het vacuüm goed werkt om mogelijke overstromingen te voorkomen. Sluit vervolgens de perfusieslang aan op de afvoerslang. Gebruik de software van het drukgestuurde perfusiesysteem (materiaaltabel) om de RBS-oplossing 10 minuten te laten draaien en ervoor te zorgen dat de druk en het debiet adequaat zijn ingesteld. Perfuseer vervolgens 1% DMSO gedurende 5 minuten en destilleer vervolgens water gedurende 15-20 minuten om de reiniging van het perfusiesysteem te voltooien. Doe het microscooplicht uit en plaats het deksel. Koppel vervolgens de cameradraden los van de doos aan de zijkant van de microscoop en zet de ventilator uit. Zorg ervoor dat alle gebruikte flessen worden opgestuurd voor reiniging en autoclaaf. Zorg er ten slotte voor dat alle afvoeremmers voor 1/4 of minder vol zijn.NOTITIE: Zorg ervoor dat er voldoende gelamineerde dekglaasjes zijn voor gebruik de volgende dag. Kopieer ten slotte de bestanden in de acquisitiemap van alle experimenten die op elk opnamesysteem zijn uitgevoerd en plak ze in een beveiligde back-upserver voor aanvullende offline analyse. Verwijder vervolgens alle gegevensbestanden uit de acquisitiemap. 9. Analyse van contractiliteitsgegevens Voer offline analyses uit met behulp van de analysesoftware en een op maat gemaakte macro om het gemiddelde van de gegevens te nemen. De analysesoftware berekent en rapporteert verschillende statistieken op basis van de sarcomeerdynamiekgegevens die door de acquisitiesoftware worden geproduceerd. Een gedetailleerde lijst van deze parameters is weergegeven in figuur 2D.OPMERKING: De toepassing van low-level softwaretechnieken maakt het mogelijk om veel runs van opnames in 5 s te analyseren. De belangrijkste parameter om door geneesmiddelen geïnduceerde veranderingen in contractiliteit te beoordelen, is de contractiliteitsamplitude (sarcomeerverkorting % = verandering in sarcomeerlengte). Het wordt berekend als de sarcomeerlengte bij piekcontractie/rustlengte van het sarcomeer en gemiddeld over de laatste 20 contractiliteitstransiënten voor elke testconcentratie. Kwantificeer de effecten van de testverbinding op de gemiddelde contractiliteitsamplitude ten opzichte van de specifieke uitgangstoestand van het vehiculumcontrolemiddel van elke cardiomyocyt. Druk de gemiddelde resultaten uit als gemiddelde ± SEM en maak een grafiek waarin het concentratie-effect van de teststof op de contractiliteitsamplitude wordt uitgezet. Pas vervolgens de concentratie-responscurve aan de Hill-vergelijking aan met behulp van analysesoftware (tabel met materialen) om IC50 (concentratie die een remming van 50% van de contractiliteitsamplitude veroorzaakt) en EC50 (concentratie die een toename van 50% in contractiliteitsamplitude veroorzaakt) waarden af te leiden. Naast de contractiliteitsamplitude kunt u ook andere parameters berekenen:Nacontractie: Identificeer nacontractie als een spontane secundaire contractie van voorbijgaande aard van de cardiomyocyt die optreedt vóór de volgende reguliere contractie en een abnormale en niet-gesynchroniseerde contractie veroorzaakt. Contractiefout: Identificeer contractiefalen als het onvermogen van de elektrische stimulus om een contractie te induceren. Kortetermijnvariabiliteit (STV) en alternanen: Visualiseer deze twee parameters in Poincaré-grafieken van contractieamplitudevariabiliteit.Bereken de STV (∑|CAn + 1 − CAn| (20 × √2) −1) met de laatste 20 transiënten van elke concentratieperiode van elk controle- en testartikel. Identificeer alternanen als repetitieve afwisselende korte en lange contractiliteitsamplitudetransiënten. Om de incidentie van pro-aritmie te berekenen, normaliseert u de STV-waarden naar de voertuigcontrolewaarde van elke cel, plott u nacontractie, contractiefalen, STV en alternanen en drukt u ze uit als % van de incidentie van cellen die elk van de signalen vertonen. Voltooi de multiparametrische mechanistische profilering met de berekening van de tijd Ato-piek, verval tot 30% ontspanning (verval 30), verval tot 90% ontspanning (verval 90), tijd tot 90% ontspanning (TR90) (Figuur 2D), basislijnlengte van sarcomeren, tijd tot 50% piek, piekhoogte, sarcomeerlengte bij piekcontractiliteit, maximale contractiesnelheid en maximale relaxatiesnelheid12. Net als de contractiliteitsamplitude, drukt u deze parameters uit ten opzichte van de specifieke basislijncontroleconditie van elke cardiomyocyt en zet u ze in grafieken in concentratie-responsgrafieken.